Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan winates kanggo CSS. Kanggo pengalaman sing paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni mode kompatibilitas ing Internet Explorer).Sauntara kuwi, kanggo mesthekake dhukungan terus, kita bakal nampilake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Pentinge ngawasi conto lingkungan wis diapresiasi banget wiwit wiwitan pandemik COVID-19, lan sawetara upaya pemantauan ditindakake nggunakake standar emas, sanajan teknik basis qPCR larang. Biosensor DNA elektrokimia bisa nyedhiyakake biaya sing efektif. solusi kanggo ngawasi conto banyu lingkungan ing negara-negara berpendapatan rendah lan menengah. Ing karya iki, kita nduduhake deteksi elektrokimia saka amplikon sing dipikolehi saka Phi6 phage sing diisolasi saka conto banyu tlaga spiked (pengganti populer kanggo SARS-CoV-2), nggunakake ENIG kanggo ngrampungake elektroda PCB tanpa modifikasi lumahing.jinis. Tanggepan sensor elektrokimia ditondoi kanthi lengkap kanggo rong fragmen DNA sing beda-beda dawa (\({117}\,\hbox {bp}\) lan \({503}\,\hbox {bp}\)), lan efek saka uyah ing campuran master PCR ing interaksi methylene blue (MB) -DNA.Asil kita nuduhake yen dawa fragmen DNA sacara signifikan nemtokake sensitivitas elektrokimia lan nduduhake ing karya iki sing kemampuan kanggo ndeteksi amplicons dawa tanpa pemurnian gel produk PCR punika penting kanggo pangukuran in situ sampel banyu.Solusi kanthi otomatis kanggo viral load dadi apik.
Panularan virus saka banyu wis dikenal minangka bebaya kesehatan masyarakat wiwit taun 1940-an, kanthi bukti pisanan transmisi polio lan hepatitis E1 sing ditularake ing banyu. Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) wis ngelasake sawetara patogen virus sing ditularake ing banyu kanthi signifikansi kesehatan moderat nganti dhuwur2.Virus tradisional cara deteksi gumantung ing Techniques basis qPCR emas-standar, kang banget sensitif lan spesifik, nanging mbutuhake personel trampil kanggo nyoba ing laboratorium nggunakake instruments larang.Nanging, ing negara-negara berpendapatan rendah lan menengah (LMICs) karo sumber daya winates, manungsa testing sampel kamungkinan kanggo njupuk precedence saka ngawasi sampel banyu lingkungan.Mulane, cara murah alternatif dibutuhake kanggo sustainable, nyata-wektu ngawasi banyu lan sampel banyu limbah ing negara-negara berpendapatan rendah lan tengah minangka bebaya awal saka wabah penyakit berkembang, kanthi mangkono nglindhungi saka dampak sosial ekonomi sing abot saka pandemi virus.Biosensor elektrokimia sing murah kanggo asam nukleat bisa nyedhiyakake solusi potensial kanggo kabutuhan sing ora bisa ditindakake iki. lumahing lan hibridisasi nalika urutan sing cocog ana ing sampel. Iki banjur bisa diowahi dadi sinyal kanthi macem-macem teknik elektrokimia nggunakake mediator redoks kayata wesi kalium / ferrocyanide. Methylene blue (MB) minangka salah sawijining molekul redoks aktif, sing nduweni wis kacarita interkalate dadi DNA untai ganda (dsDNA) saliyane kanggo ikatan sing luwih nonspesifik menyang DNA untai tunggal5,6. Sifat interkalasi MB kanggo mbentuk kompleks MB-DNA ndadekake dheweke dadi pilihan populer minangka mediator redoks ing sawetara DNA elektrokimia. konfigurasi sensor5,6,7,8,9. Sanajan interkalasi MB menyang DNA ora spesifik, lan kekhususan sensor elektrokimia iki gumantung banget marang kemurnian primer sing digunakake kanggo PCR utawa amplifikasi isotermal, iku cocok kanggo implementasine nyata. -QPCR basis elektrokimia wektu utawa amplifikasi isothermal fluoresensi minangka alternatif kanggo pangukuran konsentrasi DNA 9 . Ing siji implementasine kuwi, Won et al. Lumahing elektroda emas diowahi karo 6-mercapto-1-hexanol (MCH) kanggo wektu nyata pangukuran amplikon PCR kanthi MB nggunakake voltammetri pulsa diferensial (DPV)9. Ing kasus liyane, Ramirez et al.Deteksi SARS-CoV-2 ing banyu limbah kanthi reaksi RT-LAMP nggunakake MB kanthi elektroda sing dicithak layar.Elektroda platinum uga wis digunakake minangka elektrods in situ ing platform PCR microfluidic dirancang kanggo electrochemically ndeteksi amplicons sak reaksi 8 .Kabeh studi iki mbutuhake modifikasi lumahing elektrods, implying tambah produksi lan biaya operasi amarga syarat panyimpenan khusus kanggo stabilitas saka elektroda functionalized iki.
Skema alur kerja kanggo deteksi elektrokimia saka amplikon sing dipikolehi saka partikel virus sing konsentrasi ing conto banyu tlaga.
Kita bubar nuduhake sensing elektrokimia saka amplikon SARS-CoV-2 kanthi elektroda papan sirkuit cetak (PCB) murah adhedhasar DPV lan voltammetri siklik (CV) sing disebabake dening adsorpsi kompleks MB-DNA ing permukaan elektroda sing ora diowahi) owah-owahan ing puncak. saiki11.Kita nglaporake manawa fragmen DNA sing luwih dawa (N1-N2, \ ({943} \, \ hbox) dibentuk nggunakake primer N1 maju lan N2 sing disaranake CDC dibandhingake karo fragmen sing luwih cendhek {bp} \)) nuduhake linearitas sing luwih apik ing respon sensor. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) dibentuk nggunakake set primer maju lan N1 mbalikke. Panaliten kasebut dilapurake nggunakake pengenceran DNA sing disiapake ing banyu tanpa nuklease. Platform kasebut uga digunakake kanggo ndeteksi SARS-CoV -2 amplicons ing conto banyu sampah simulasi (dipikolehi dening spiking total conto RNA karo SARS-CoV-2 RNA).Amarga RNA rentan kanggo shearing sak isolasi lan Processing hilir,12,13 iku angel kanggo nggedhekake fragmen maneh karo sampel heterogen iki. Mula, demonstrasi sensing elektrokimia saka amplikon SARS-CoV-2 ing banyu limbah diwatesi ing fragmen N1 sing luwih cendhek.
Ing karya iki, kita nyelidiki kelayakan ENIG PCB basis elektrokimia sensing saka phage Phi6 klempakan lan diisolasi saka conto banyu tlaga (Fig. 1). Phi6 phages iso dibandhingke ing ukuran (80-100 nm) kanggo SARS-CoV-2 lan uga duwe membran lipid lan protein spike.Amarga alasan kasebut, bacteriophage Phi6 minangka pengganti populer kanggo SARS-CoV-2 lan virus RNA patogen sing dibungkus liyane14,15.RNA sing diisolasi saka partikel fag digunakake minangka cithakan kanggo sintesis cDNA diikuti dening PCR kanggo njupuk rong fragmen DNA kanthi dawa 117 lan 503 pasangan basa. Amarga tantangan nggedhekake fragmen N1-N2 ing karya sadurunge, kita targetake fragmen dawa penengah (\(117). \,\hbox {bp}\) lan \(503 \,\hbox {bp}\)), adhedhasar primer sing kasedhiya. Respon sensor elektrokimia ditliti kanthi sistematis sajrone sawetara konsentrasi sing amba (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) kanggo \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Kanggo loro fragmen ing ing ngarsane MB, efek uyah ing respon sensor wis ditondoi lan cross-validated dening pangukuran spektrofotometri. Kontribusi utama karya iki minangka nderek:
Dawane fragmen DNA lan anané uyah ing sampel banget mengaruhi sensitivitas.Asil kita nuduhake yen aktivitas elektrokimia gumantung ing mekanisme beda saka interaksi MB, DNA, lan sensor ing respon voltammetric, gumantung ing konsentrasi DNA lan dawa, karo maneh Fragmen nuduhake sensitivitas sing luwih dhuwur, sanajan uyah duweni efek negatif ing interaksi elektrostatik antarane. MB lan DNA.
Konsentrasi DNA nemtokake mekanisme interaksi MB-DNA ing elektroda sing ora dimodifikasi Kita nduduhake manawa mekanisme interaksi MB-DNA sing beda-beda gumantung marang konsentrasi DNA. {l}}}\), kita mirsani yen respon arus elektrokimia utamane ditemtokake dening adsorpsi MB-DNA ing elektroda, nalika ing konsentrasi sing luwih murah Ing konsentrasi DNA sing dhuwur, respon arus elektrokimia ditemtokake dening inhibisi sterik saka redoks. aktivitas amarga penyisipan MB antarane pasangan basa DNA.
ENIG PCB-Based Electrochemical Sensing of Viral Nucleic Acid in Lake Water Samples Pengamatan kasebut divalidasi kanthi deteksi elektrokimia saka Phi6-added \(503\,\hbox {bp}\) fragmen DNA sing dipikolehi saka sampel banyu saka Powai Lake, Kampus IIT Mumbai. Hasil fag.
Biaya implementasine murah lan potensial kanggo integrasi menyang sistem ngawasi kanthi otomatis, oligonukleotida utawa aptamer ing elektroda kanthi umur sing luwih dawa.
Phage Phi6 minangka virus dsRNA sing dibungkus saka kulawarga Cytoviridae sing nginfèksi Pseudomonas syringae. Genom Phi6 phage ana ing wangun 3 fragmen: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07). \,\hbox {Kb}\)) lan L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\)) 16,17. Wiwit Phi6 phage nginfèksi galur Pseudomonas BSL-1 non-patogen, aman kanggo nggunakake. lan bisa gampang ditanam ing laboratorium.Phage Phi6 lan host Pseudomonas syringae dituku saka Pusat Referensi Felix d'Herelle kanggo Virus Bakteri, Universitas Laval, Kanada (nomer katalog pusat referensi yaiku HER-102 lan HER-1102, masing-masing) .Phi6 phage lan tuan rumah diuripake maneh kaya sing diarahake dening pusat referensi.Phage Phi6 diresiki kanthi lisis piring lan elusi kanggo entuk titer pungkasan kanthi \ (\ babagan 10 ^ {12} \, {\ hbox {PFU} / \ hbox { ml}}\) (unit pembentuk plak/ mililiter).RNA diisolasi saka partikel phage sing diresiki nggunakake Kit Pemurnian RNA Total GenElute™ (Sigma-Aldrich) miturut instruksi pabrikan. 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) dilisis lan lysate dimuat menyang kolom spin kanggo ngidini RNA ngiket kolom resin .RNA banjur diencerake ing larutan elusi \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) sing diwenehake dening kit.Ngira konsentrasi RNA kanthi absorbansi ing \(260\,\hbox {nm}\).RNA disimpen ing alikuot ing \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) nganti dienggo maneh.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Kit Sintesis cDNA iScript (Bio -Rad Laboratories) digunakake minangka cithakan kanggo sintesis cDNA miturut instruksi pabrikan. Sedhela, reaksi sintesis cDNA kasusun saka 3 langkah: priming ing \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\), transkripsi mbalikke \({20}\,{\hbox {min}}\) ing \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), lan mbalikke Perekam ana ing \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) kanggo \({1}\,{\hbox {min }}\).Nalika nganggo gel agarose 1%, cDNA nuduhake telung pita sing cocog karo telung fragmen RNA sing dikarepake (data ora ditampilake). nggunakake cDNA minangka cithakan kanggo PCR ing siklus termal miniPCR® mini8:
Primer kanggo \(117\,\hbox {bp}\) lan \(503\,\hbox {bp}\) cocog karo 1476-1575 nukleotida saka segmen M lan 458-943 nukleotida saka segmen L, masing-masing asam. .Kabeh produk PCR sing diamplifikasi dielektroforesis ing gel agarose 1%, lan DNA target sing dikuatake diresiki nggunakake Kit Ekstraksi Gel GeneJET (Thermo Fisher Scientific).
Tlaga ing kampus IIT Mumbai (Tlaga Powai, Powai, Mumbai) digunakake kanggo nambah partikel phage. Banyu tlaga kasebut disaring liwat membran \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) kanggo mbusak partikel sing digantung, banjur Phi6 phage ditambahake. Tambah \({1}\,{\hbox {ml}}\) saka \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) menyang \({100}\ ,{\hbox {ml}}\) banyu tlaga sing disaring, ing \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).Aliquot cilik ana dilindhungi undhang-undhang kanggo pangukuran viral load kanthi uji plak. Kita nguji rong cara kanggo konsentrasi partikel virus Phi6 sing spiked: (1) metode adsorpsi-presipitasi aluminium hidroksida,19 sing wis divalidasi kanggo konsentrasi sawetara virus RNA sing dibungkus saka sampel lingkungan, lan (2) ) Metode konsentrasi virus berbasis polyethylene glycol (PEG) diadaptasi saka Flood et al.20 .Amarga efisiensi pemulihan metode basis PEG ditemokake luwih apik tinimbang metode hidroksida aluminium, metode basis PEG digunakake kanggo konsentrasi partikel Phi6 saka conto banyu tlaga.
Cara PEG sing digunakake kaya ing ngisor iki: PEG 8000 lan \(\hbox {NaCl}\) ditambahake ing sampel banyu tlaga Phi6-spiked kanggo entuk 8 % PEG 8000 lan \(0.2 \,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Sampel diinkubasi ing shaker\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), banjur disentrifugasi ing \(4700 \,\hbox {g}\) yaiku \({45}\,{\hbox {min}}\).Buang supernatant lan resuspend pelet ing \({1}\, {\hbox {ml}}\) ing supernatant padha.Kabeh eksperimen konsentrasi spiking lan virus dileksanakake ing triplicate.Sawise konsentrasi, aliquot cilik dilindhungi undhang-undhang kanggo pangukuran efisiensi Recovery dening assay tondo pengeling eling.RNA diisolasi kaya sing diterangake sadurunge lan diencerake. ing buffer elusi sing disedhiyakake kit\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).Amarga konsentrasi RNA bakal beda-beda saka sampel kanggo sampel ing rangkap tiga, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) saka RNA digunakake kanggo kabeh telu tanpa preduli saka konsentrasi cDNA sintesis saka sampel. Sintesis cDNA ditindakake kaya sing wis diterangake sadurunge.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA digunakake minangka cithakan kanggo \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR kanggo 35 siklus kanggo nggedhekake \ (117\,\hbox {bp}\) lan \(503\,\hbox { bp}\) fragmen. Sampel iki dituduhake minangka "1: 1", yaiku tanpa pengenceran. Kontrol tanpa cithakan (NTC) disetel minangka kontrol negatif, dene cDNA sing disintesis nggunakake RNA sing diisolasi saka phage sing diresiki disetel. minangka cithakan kanggo kontrol positif (PC) .Quantitative PCR (qPCR) iki dileksanakake ing Stratagene Mx3000P RT-PCR instrument nggunakake Brilliant III Ultra-Cepet SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies) . diterangake.Batesan siklus (Ct) dicathet kanggo kabeh sampel. Kajaba iku, sampel sing diencerke yaiku \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) nggunakake cDNA diencerke 1:100 ing banyu tlaga sing disaring minangka \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR kanggo 35 siklus. Sampel iki dituduhake minangka "1:100".
Elektroda PCB digawe kanthi nggunakake proses Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) kanthi biaya murah tanpa mbutuhake plating emas tambahan. Spesifikasi elektroda ENIG PCB rinci ing karya sadurunge 11. Kanggo elektroda ENIG PCB, metode reresik elektroda tradisional kayata solusi piranha utawa voltametri siklik asam sulfat ora dianjurake amarga bisa njalari kulit lapisan emas tipis (ketebalan \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) lan mbukak lapisan tembaga sing ndasari. nganti korosi 21, 22, 23, 24, 25. Mula, ngresiki elektroda nganggo kain tanpa serat sing dibasahi nganggo IPA. Sampel sing bakal diuji diinkubasi nganggo \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB ing \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) kanggo gampang dilebokake. Ing karya sadurunge , kita mirsani yen sensitivitas lan linearitas sensor wis apik kanthi nambah konsentrasi MB 11. Adhedhasar optimasi sing dilapurake ing karya sadurunge, kita nggunakake \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB konsentrasi kanggo nglebokake DNA ing panliten iki.Deteksi elektrokimia saka DNA untai ganda (ds-DNA) bisa digayuh nggunakake interkalator anionik utawa kationik.Sanajan interkalator anionik ndeteksi DNA kanthi selektivitas sing luwih apik, mbutuhake inkubasi sewengi, nyebabake wektu deteksi luwih suwe. tangan liyane, interkalator kationik kayata MB mbutuhake wektu inkubasi sing luwih cendhek, kira-kira \({1}\,{\hbox {h}}\) kanggo deteksi elektrokimia ds-DNA6. Saben pangukuran kalebu dispensing sampel kanggo diuji ing elektroda\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), banjur resiki nganggo gombal IPA-moistened, sadurunge nerusake karo sampel liyane.siji pangukuran.Saben sampel dites ing 5 elektroda sing beda-beda kajaba nyatakake. Pangukuran DPV lan CV ditindakake kanthi nggunakake potentiostat Smart PalmSens Sensit, lan piranti lunak PSTrace digunakake kanggo konfigurasi potentiostat lan akuisisi data, kalebu petungan saiki puncak. Setelan ing ngisor iki digunakake kanggo pangukuran DPV lan CV:
DPV: Wektu Keseimbangn = \(8\,\hbox {s}\), Langkah Tegangan = \(3\,\hbox {mV}\), Tegangan Pulsa = \(25\,\hbox {mV}\), durasi pulsa = \(50\,\hbox {ms}\), scan rate = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Equilibrium Time = \(8\,\hbox {s}\), Voltage Step = \(3\,\hbox {mV}\), Sweep Rate = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
Arus puncak sing dipikolehi saka voltammogram DNA sing dikompleks karo \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Voltammogram DPV lan CV dipikolehi ing elektroda ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB kompleks karo DNA (kanthi konsentrasi 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) yaiku 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) kanggo \(117\,\hbox {bp}\ ) lan 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) kanggo \(503\,\hbox {bp}\)).Voltammograms perwakilan ditampilake ing Gambar S1 ing Informasi Tambahan.Gambar 2 nuduhake asil pangukuran DPV lan CV (arus puncak) nggunakake produk PCR sing diresiki gel. Dibandhingake karo pangukuran CV, pangukuran DPV nuduhake sensitivitas sing luwih dhuwur (saiki minangka fungsi konsentrasi DNA) amarga arus kapasitif latar mburi ing pangukuran CV ndhelikake arus Faradaic 26 .Data kanggo saben kothak ing boxplot ngemot pangukuran saka 5 elektrods. Kabeh pangukuran nggunakake set elektroda sing padha kanggo ngindhari kesalahan pangukuran amarga variasi elektroda-kanggo-elektroda. , luwih dawa (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ dibandhingake karo \(117) ) fragmen. Iki konsisten karo tren samesthine saka adsorpsi elektroda sing dilapurake ing karya sadurunge. adsorpsi kompleks MB-DNA nggampangake transfer muatan ing elektroda, sing nyumbang kanggo nambah arus puncak.Panaliten liyane wis nuduhake efek ukuran lan urutan oligonukleotida ing interkalasi MB-DNA27,28,29,30.Guanine -cytosine (GC) isi loro amplicons (\(117\,\hbox {bp}\) lan \(503\,\hbox {bp}\)) kira-kira 50%, nuduhake yen pengamatan prabédan amarga kanggo dawa amplicon. Nanging, kanggo konsentrasi DNA sing luwih dhuwur (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), kanggo \(503\,\hbox {bp} \) lan \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) kanggo \(117\,\hbox {bp}\)), kita mirsani rong amplifikasi. Arus puncak subs dikurangi ing ukuran DPV lan CV. Iki amarga MB saturates lan intercalates antarane pasangan basa DNA, nyebabake inhibisi sterik saka aktivitas redoks saka grup reducible ing MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Uyah sing ana ing campuran master PCR ngganggu interaksi elektrostatik antarane MB lan DNA, mula kanthi nambah \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) karo \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB produk sing diresiki gel kanggo nyinaoni efek uyah ing interaksi MB-DNA. Kaya sing dituduhake ing Gambar 3, kita mirsani yen kanggo konsentrasi DNA sing luwih dhuwur (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) lan \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) kanggo \(117\,\hbox {bp} \)), ing DPV lan CV Penambahan uyah ora mengaruhi pangukuran sing signifikan (pirsani Gambar S2 ing Informasi Tambahan kanggo voltammograms perwakilan).Nanging, ing konsentrasi DNA sing luwih murah, tambahan uyah nyuda sensitivitas banget, nyebabake ora ana owah-owahan sing signifikan ing saiki karo konsentrasi DNA.Efek negatif uyah sing padha ing interaksi lan interkalasi MB-DNA wis dilapurake sadurunge dening peneliti liyane33,34.\(\hbox { Kation Mg}^{2+}\) ikatan karo backbone fosfat negatif DNA, saéngga ngalangi interaksi elektrostatik antara MB lan DNA. Ing konsentrasi DNA sing luwih dhuwur, inhibisi sterik MBs sing aktif redoks nyebabake arus puncak sing luwih murah, mula interaksi elektrostatik. ora mengaruhi respon sensor kanthi signifikan. Intine yaiku biosensor iki luwih cocog kanggo ndeteksi konsentrasi DNA sing luwih dhuwur (jarang \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) utawa luwih dhuwur), kanggo ngolah sampel banyu lingkungan kanthi otomatis, ing ngendi pemurnian gel produk PCR bisa uga ora bisa ditindakake.
Area ing sangisore kurva panyerepan kanggo dawane gelombang 600–700 \(\hbox {nm}\) kanggo macem-macem konsentrasi DNA sing dikompleks karo \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) nganggo lan tanpa uyah (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) nganggo lan tanpa uyah (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Konsentrasi DNA sing cocog karo \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) sampel MB Ora ana DNA.
Kanggo luwih verifikasi asil ing ndhuwur, kita nindakake pangukuran optik nggunakake spektrofotometer UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), sampel \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) digunakake kanggo saben Pangukuran.Tandha panyerepan suda kanthi nambah konsentrasi DNA, kaya sing bisa dideleng saka tren area ing sangisore kurva serapan kanggo rentang dawa gelombang \(600\,\hbox {nm}\) nganti \(700\,\hbox { nm}\), minangka ditampilake ing Fig. 4 (spektrum panyerepan ditampilake ing Fig. S3 ing Informasi Tambahan).Kanggo conto karo konsentrasi DNA kurang saka \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), ora ana prabédan sing signifikan ing serapan antarane sampel sing ngemot DNA lan mung MB (kanggo \(503\,\hbox {bp}\) lan \(117\,\hbox {bp}\ ) fragmen dawa), nuduhake ora ana inhibisi sterik saka MB redoks-aktif. Ing konsentrasi DNA sing luwih dhuwur, kita mirsani penurunan bertahap ing sinyal absorbansi lan nyathet penurunan absorbansi sing luwih cilik ing ngarsane uyah.Asil kasebut disebabake molekuler interaksi lan inhibisi sterik karo tumpukan basa ing hibrida DNA.Asil kita konsisten karo laporan ing literatur babagan studi spektroskopi saka interkalasi MB-DNA sing nggandhengake hypochromaticity karo tingkat energi suda ing \(\pi\)-\(\pi ^*\ ) transisi elektronik amarga interkalasi Lapisan 36, 37, 38.
Elektroforesis gel agarose Phi6: produk PCR kanthi dawa \(117\,\hbox {bp}\) lan \(503\,\hbox {bp}\) saka sampel banyu tlaga.M-DNA marker;Kontrol NTC-no-template, primer ngemot amplicon sing cocog;PC kontrol positif;1, 2, 3-undiluted (1:1) conto banyu tlaga spiked ing triplicate. Pita katon ing \(\udakara 50\,\hbox {bp}\) amarga oligonukleotida sing ora digunakake ing \(503\,\ hbox {bp}\) lane.
Kita ngevaluasi utilitas sensor nggunakake conto banyu Powai Lake spiked karo Phi6 phage.Konsentrasi RNA sing diisolasi saka conto banyu phage-spiked kisaran saka 15.8-\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), dene sing diisolasi saka suspensi fag sing diresiki RNA dikira-kira dadi \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) kanthi efisiensi pemulihan kira-kira 1 %.RNA ditranskripsi mbalikke dadi cDNA lan digunakake minangka cithakan kanggo PCR lan qPCR. Ukuran produk dikonfirmasi dening elektroforesis gel agarose (Gambar 5) sadurunge dites nganggo sensor. Sampel iki ora diresiki gel lan mulane ngemot kabeh komponen PCR minangka Nilai Ct sing direkam sajrone qPCR (Tabel 1) dituduhake hubungane karo konsentrasi RNA sing diisolasi saka conto banyu spiked sing cocog. Nilai Ct nuduhake jumlah siklus sing dibutuhake kanggo sinyal fluoresensi. ngluwihi ambang utawa sinyal latar mburi. Nilai Ct sing luwih dhuwur nuduhake konsentrasi cithakan sing luwih murah lan kosok balene. Nilai Ct saka sampel NTC dhuwure kaya sing dikarepake. kontrol positif lan sampel test luwih nuduhake yen saben sampel test wis kira-kira 1% cithakan dibandhingake kontrol positif.Kita sadurunge wis rembugan sing amplicons maneh mimpin kanggo sensitivitas luwih.Amplification saka pecahan maneh diisolasi saka sampel lingkungan heterogen tantangan diwenehi cacat. konsentrasi virus sing kurang lan degradasi RNA. Nanging, kanthi pengayaan virus lan protokol amplifikasi PCR, kita bisa sukses nggedhekake fragmen \(503\,\hbox {bp}\) kanggo sensing elektrokimia.
Gambar 6 nuduhake asil sensor elektrokimia saka amplicon fragmen \(503\,\hbox {bp}\), loro-lorone nggunakake cDNA undiluted minangka cithakan (1:1) lan cDNA diencerke 100-fold minangka cithakan (1:100) sing ditindakake PCR , dibandhingake karo NTC lan PC (pirsani Gambar S4 ing Informasi Tambahan kanggo voltammograms perwakilan). Saben kothak ing boxplot ing Figure 6 ngemot pangukuran saka telung conto ing 5 elektroda. Elektroda sing padha digunakake kanggo ngukur kabeh sampel supaya ora ana kesalahan amarga elektroda. -to-electrode variation.Dibandhingake karo pangukuran CV, pangukuran DPV nuduhake resolusi sing luwih apik kanggo mbedakake tes lan conto PC saka NTC amarga, kaya sing kasebut sadurunge, arus Faradaic didhelikake amarga arus kapasitif latar mburi. kontrol negatif (NTC) ngasilake arus puncak CV lan DPV sing luwih dhuwur tinimbang kontrol positif, dene sampel tes positif lan undiluted nuduhake dhuwur puncak arus puncak DPV sing padha. Nilai rata-rata lan median sing diukur kanggo saben undiluted (1: 1). ) sampel test lan PC bisa ditanggulangi kanthi cetha saka output sensor kanggo sampel NTC, dene resolusi kanggo sampel diencerke 1:100 kurang jelas. (jalur ora ditampilake ing Gambar 5), lan arus puncak DPV lan CV sing cocog padha karo sing dikarepake kanggo NTC. Asil kanggo fragmen \ (117 \, \ hbox {bp} \) ditampilake ing Informasi Tambahan. kontrol nyebabake respon elektrokimia saka sensor PCB amarga adsorpsi MB gratis ing elektroda lan interaksi MB karo oligonukleotida primer untai tunggal. Mula, saben sampel diuji, kontrol negatif kudu ditindakake lan arus puncak sampel tes dibandhingake karo arus puncak sing dipikolehi kontrol negatif kanggo entuk pangukuran diferensial (relatif)39,40 kanggo nggolongake sampel tes positif utawa negatif.
(a) DPV, lan (b) arus puncak CV kanggo deteksi elektrokimia saka fragmen \(503\,\hbox {bp}\) ing sampel banyu tlaga. kontrol positif (PC).
Temuan kita nggambarake mekanisme sing beda-beda sing mengaruhi kinerja sensor elektrokimia kanggo amplikon sing beda-beda dawa kanggo DNA sing beda-beda, kanthi konsentrasi sing diverifikasi kanthi pangukuran optik nggunakake spektrofotometer UV/Vis. \(500\,\hbox {bp}\) bisa dideteksi kanthi sensitivitas sing luwih dhuwur lan anané uyah ing sampel ora Sensitivitas konsentrasi DNA sing mengaruhi sensitivitas sing luwih dhuwur (jarang \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) lan ndhuwur).Kajaba iku, kita nyelidiki efek saka macem-macem jinis conto, kalebu amplicons diresiki gel karo lan tanpa uyah ditambahaké, lan tambahan saka conto banyu tlaga ing DPV lan pangukuran CV.Kita diamati manawa DPV nyedhiyakake resolusi sing luwih apik, amarga arus kapasitif latar mburi uga mengaruhi pangukuran CV, dadi kurang sensitif.
Amplifikasi fragmen sing luwih dawa gumantung marang integritas RNA genomik virus. Sawetara panliten nuduhake yen amplifikasi fragmen sing luwih dawa ora tansah efisien amarga degradasi RNA ing lingkungan lan potensial kanggo splicing sajrone isolasi11,41,42,43,44 .We diamati yen metode konsentrasi virus berbasis PEG luwih efektif kanggo konsentrasi phage Phi-6 spiked ing conto banyu tlaga tinimbang metode konsentrasi virus berbasis aluminium hidroksida. kanggo nggedhekake sawetara cithakan dawa luwih cendhek lan nyuda kamungkinan saka salib-spesifik.
Sampel biologi langka, mula perlu ngrancang biosensor sing mbutuhake sampel minimal kanggo dites. Elektroda ENIG PCB sing digunakake ing panliten iki mung mbutuhake \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) conto kanggo testing kanggo nutupi area efektif saka elektrods.Kajaba iku, elektroda padha bisa digunakake maneh sawise reresik sadurunge dispensing sampel sabanjuré.Conto amplified ora mbutuhake Kajaba saka bahan kimia liyane saka methylene biru, kang inexpensive lan kimia umum digunakake.Amarga saben elektroda biaya babagan $0,55 (utawa INR 40) kanggo Pabrik, biosensor iki bisa dadi alternatif biaya-efektif kanggo teknologi deteksi ana.Tabel 2 nuduhake comparison karya iki karo sensor liyane kacarita ing sastra kanggo dangu fragmen DNA ing sampel heterogen.
Amarga protokol deteksi elektrokimia adhedhasar MB gumantung ing kekhususan PCR, watesan utama metode iki yaiku potensial kanggo amplifikasi non-spesifik ing conto heterogen kayata banyu limbah lan banyu tlaga utawa nggunakake primer kemurnian rendah. Kanggo nambah sensitivitas cara deteksi elektrokimia kanggo deteksi DNA produk PCR unpurified nggunakake unmodified ENIG PCB elektrods, iku perlu kanggo luwih ngerti kasalahan ngenalaken dening dNTPs lan primer sing ora digunakake, lan kanggo ngoptimalake kahanan reaksi lan protokol assay.Parameter fisikokimia tambahan kayata pH, suhu, lan biologi kabutuhan oksigen (BOD) saka sampel banyu bisa uga kudu diukur kanggo nambah akurasi pangukuran.
Kesimpulane, kita ngusulake sensor ENIG PCB elektrokimia murah kanggo deteksi virus ing sampel lingkungan (banyu tlaga). Boten kados elektroda oligonukleotida immobilized utawa substrat khusus kanggo sensing DNA sing mbutuhake panyimpenan cryogenic kanggo njaga sensitivitas, 53,54 teknik kita nggunakake PCB sing ora dimodifikasi. elektroda kanthi umur simpan sing luwih dawa lan ora ana syarat panyimpenan tartamtu lan mulane cocog kanggo pangembangan solusi pangukuran kanthi pangolahan sampel otomatis sing disebarake ing LMICs. umum ing conto lingkungan nyuda spesifisitas metode sensing iki amarga ikatan nonspesifik MB menyang oligonukleotida untai tunggal lan dobel. Mulane, spesifisitas tes iki gumantung marang optimalisasi primer lan kondisi reaksi PCR. Kajaba iku, CV lan arus puncak DPV sing dipikolehi saka conto sing dites kudu diinterpretasikake relatif marang respon sing dipikolehi saka kontrol negatif (NTC) kanggo saben test.Desain lan metode sensor elektrokimia sing ditampilake ing karya iki bisa digabungake karo autosamplers kanggo ngembangake kanthi otomatis lan kurang. -solusi biaya sing bisa ngumpulake lan nganalisa conto lan ngirim asil kanthi nirkabel bali menyang laboratorium.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Metode kanggo konsentrasi awal virus saka conto banyu: review lan meta-analisis studi anyar.J.Aplikasi.microorganism.115, pp. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne virus: Barriers to safe drinking water.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Epidemiologi banyu limbah kanggo pengawasan skala gedhe sing larang regane COVID-19 ing negara-negara berpendapatan rendah lan menengah: tantangan lan kesempatan.Banyu 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene blue minangka diskriminator elektrokimia saka oligonukleotida untai tunggal lan ganda sing diimobilisasi ing substrat emas. Analyst 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion Intercalators for Electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long-Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Transfer biaya liwat DNA: biosensor DNA elektrokimia selektif.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Perangkat mikrofluida PCR wektu nyata kanthi deteksi elektrokimia bebarengan.sensor biologis.Bioelektronik.24, 2131-2136 (2009).
Win, BY et al. Sinau mekanisme sinyal lan verifikasi kinerja sistem PCR wektu nyata elektrokimia adhedhasar interaksi biru metilen karo DNA. Analyst 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop-mediated isothermal amplifikasi basis sensor elektrokimia kanggo deteksi sars-cov-2 ing sampel banyu sampah.J.Environment.Chemical.Inggris.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Penginderaan elektrokimia saka amplikon SARS-CoV-2 kanthi elektroda PCB. Sensor diaktifake.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Deteksi efisien saka RNA SARS-CoV-2 ing bagian sekedhik padhet banyu limbah.science.lingkungan umum.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Metode Analitik kanggo Deteksi SARS-CoV-2 ing Limbah: Protokol lan Perspektif Masa Depan.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Survival saka bakteriofag Phi6 sing enveloped (sulih kanggo SARS-CoV-2) ing tetesan idu nguap sing disimpen ing permukaan kaca.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Ketekunan lingkungan saka surrogate SARS-CoV-2 (Phi6) ing amoeba.J.Kesehatan Banyu 20, 83 (2021).
Mindich, L. Kemasan sing tepat saka telung fragmen genomik saka bakteriofag RNA untaian ganda\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Struktur sekunder DH RNA phage\(\varphi\)6 packaging region.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - Protokol sing cepet lan efisien kanggo nyiapake stok laboratorium bakteriofag.PeerJ 4, e2261 (2016).
Wektu kirim: Mei-27-2022