Ống đông lạnhthường được sử dụng để lưu trữ đông lạnh các dòng tế bào và các vật liệu sinh học quan trọng khác, trong các bình chứa đầy nitơ lỏng.

Có một số giai đoạn liên quan đến việc bảo quản thành công tế bào trong nitơ lỏng. Trong khi nguyên tắc cơ bản là đông lạnh chậm, kỹ thuật chính xác được sử dụng phụ thuộc vào loại tế bào và chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng. Có một số cân nhắc về an toàn và các biện pháp tốt nhất cần lưu ý khi bảo quản tế bào ở nhiệt độ thấp như vậy.

Bài viết này nhằm mục đích cung cấp cái nhìn tổng quan về cách bảo quản ống nghiệm đông lạnh trong nitơ lỏng.

Cryovials là gì?

Cryovials là lọ nhỏ có nắp được thiết kế để lưu trữ các mẫu chất lỏng ở nhiệt độ cực thấp. Chúng đảm bảo rằng các tế bào được bảo quản trong chất bảo vệ đông lạnh không tiếp xúc trực tiếp với nitơ lỏng, giảm thiểu nguy cơ gãy tế bào trong khi vẫn được hưởng lợi từ hiệu ứng làm mát cực độ của nitơ lỏng.

Các lọ thường có nhiều thể tích và thiết kế khác nhau – chúng có thể được luồn bên trong hoặc bên ngoài với đáy phẳng hoặc tròn. Cũng có sẵn các dạng vô trùng và không vô trùng.

Ai sử dụngCyrovialsđể lưu trữ tế bào trong nitơ lỏng

Nhiều phòng thí nghiệm tư nhân và của NHS cũng như các viện nghiên cứu chuyên về ngân hàng máu dây rốn, sinh học tế bào biểu mô, miễn dịch học và sinh học tế bào gốc sử dụng ống đông lạnh để bảo quản tế bào.

Các tế bào được bảo quản theo cách này bao gồm Tế bào B và T, Tế bào CHO, Tế bào gốc và tiền thân tạo máu, Tế bào lai, Tế bào ruột, Đại thực bào, Tế bào gốc và tiền thân trung mô, Tế bào đơn nhân, U tủy, Tế bào NK và Tế bào gốc đa năng.

Tổng quan về cách bảo quản lọ đông lạnh trong nitơ lỏng

Bảo quản đông lạnh là một quá trình bảo quản tế bào và các cấu trúc sinh học khác bằng cách làm lạnh chúng xuống nhiệt độ rất thấp. Tế bào có thể được lưu trữ trong nitơ lỏng trong nhiều năm mà không mất khả năng sống của tế bào. Đây là phác thảo về các quy trình được sử dụng.

Chuẩn bị tế bào

Phương pháp chính xác để chuẩn bị mẫu sẽ khác nhau tùy thuộc vào loại tế bào, nhưng nhìn chung, các tế bào được thu thập và ly tâm để tạo thành viên giàu tế bào. Viên này sau đó được tái huyền phù trong dịch nổi trộn với chất bảo vệ đông lạnh hoặc môi trường bảo quản đông lạnh.

Môi trường bảo quản đông lạnh

Môi trường này được sử dụng để bảo quản tế bào trong môi trường nhiệt độ thấp mà chúng sẽ phải chịu bằng cách ức chế sự hình thành các tinh thể nội bào và ngoại bào và do đó là sự chết của tế bào. Vai trò của chúng là cung cấp một môi trường an toàn, bảo vệ cho tế bào và mô trong quá trình đông lạnh, lưu trữ và rã đông.

Một môi trường như huyết tương tươi đông lạnh (FFP), dung dịch huyết tương có heparin hoặc dung dịch không chứa huyết thanh, không chứa thành phần động vật được trộn với chất bảo vệ đông lạnh như dimethyl sulphoxide (DMSO) hoặc glycerol.

Viên mẫu được hóa lỏng lại được chia thành các ống nghiệm đông lạnh bằng polypropylen nhưCông ty Suzhou Ace Biomedical Lọ lưu trữ đông lạnh.

Điều quan trọng là không nên đổ quá đầy lọ đông lạnh vì điều này sẽ làm tăng nguy cơ nứt và có thể làm rò rỉ chất bên trong (1).

Tỷ lệ đóng băng được kiểm soát

Nhìn chung, tốc độ đông lạnh được kiểm soát chậm thường được sử dụng để bảo quản tế bào thành công.

Sau khi các mẫu được chia nhỏ vào các lọ đông lạnh, chúng được đặt trên đá ướt hoặc trong tủ lạnh 4℃ và quy trình đông lạnh được bắt đầu trong vòng 5 phút. Theo hướng dẫn chung, các tế bào được làm lạnh ở tốc độ -1 đến -3 mỗi phút (2). Điều này đạt được bằng cách sử dụng bộ làm mát có thể lập trình hoặc bằng cách đặt các lọ vào hộp cách nhiệt được đặt trong tủ đông có tốc độ được kiểm soát từ -70°C đến –90°C.

Chuyển sang Nitơ lỏng

Các lọ đông lạnh sau đó được chuyển vào bể chứa nitơ lỏng trong thời gian không xác định với điều kiện nhiệt độ được duy trì dưới -135℃.

Nhiệt độ cực thấp này có thể đạt được bằng cách ngâm trong nitơ ở dạng lỏng hoặc hơi.

Trạng thái lỏng hay hơi?

Việc lưu trữ trong nitơ pha lỏng được biết là có thể duy trì nhiệt độ lạnh ở mức tuyệt đối, nhưng thường không được khuyến khích vì những lý do sau:

• Nhu cầu về khối lượng lớn (độ sâu) nitơ lỏng là mối nguy hiểm tiềm tàng. Bỏng hoặc ngạt thở do điều này là một rủi ro thực sự.
• Các trường hợp được ghi nhận về sự lây nhiễm chéo bởi các tác nhân truyền nhiễm như aspergillus, viêm gan B và sự lây lan của vi-rút qua môi trường nitơ lỏng (2,3)
• Khả năng nitơ lỏng rò rỉ vào lọ trong quá trình ngâm. Khi lấy ra khỏi nơi lưu trữ và làm ấm đến nhiệt độ phòng, nitơ sẽ nhanh chóng nở ra. Do đó, lọ có thể vỡ khi lấy ra khỏi nơi lưu trữ nitơ lỏng, tạo ra mối nguy hiểm từ cả mảnh vỡ bay và tiếp xúc với nội dung (1, 4).

Vì những lý do này, lưu trữ ở nhiệt độ cực thấp thường là nitơ pha hơi. Khi mẫu phải được lưu trữ ở pha lỏng, nên sử dụng ống cryoflex chuyên dụng.

Nhược điểm của pha hơi là có thể xảy ra sự chênh lệch nhiệt độ theo chiều dọc dẫn đến sự dao động nhiệt độ giữa -135℃ và -190℃. Điều này đòi hỏi phải theo dõi cẩn thận và siêng năng mức nitơ lỏng và các biến động nhiệt độ (5).

Nhiều nhà sản xuất khuyến cáo rằng lọ đông lạnh thích hợp để bảo quản ở nhiệt độ xuống tới -135℃ hoặc chỉ sử dụng ở dạng hơi.

Rã đông tế bào đông lạnh của bạn

Quy trình rã đông gây căng thẳng cho nuôi cấy đông lạnh và cần có kỹ thuật và cách xử lý phù hợp để đảm bảo khả năng sống, phục hồi và chức năng tối ưu của tế bào. Các giao thức rã đông chính xác sẽ phụ thuộc vào các loại tế bào cụ thể. Tuy nhiên, rã đông nhanh được coi là tiêu chuẩn để:

• Giảm thiểu mọi tác động đến quá trình phục hồi tế bào
• Giúp giảm thời gian tiếp xúc với các chất tan có trong môi trường đông lạnh
• Giảm thiểu mọi thiệt hại do kết tinh lại băng

Bồn nước, bồn hạt hoặc các dụng cụ tự động chuyên dụng thường được sử dụng để rã đông mẫu.

Thông thường, mỗi dòng tế bào được rã đông trong vòng 1-2 phút bằng cách nhẹ nhàng xoay trong bồn nước 37℃ cho đến khi chỉ còn một ít đá trong lọ trước khi rửa trong môi trường nuôi cấy đã được làm ấm trước.

Đối với một số tế bào như phôi động vật có vú, sự nóng lên chậm là điều cần thiết cho sự sống còn của chúng.

Các tế bào hiện đã sẵn sàng để nuôi cấy, phân lập tế bào hoặc trong trường hợp tế bào gốc tạo máu – nghiên cứu khả năng sống để đảm bảo tính toàn vẹn của tế bào gốc của người hiến tặng trước khi điều trị hủy tủy.

Thực hành bình thường là lấy một lượng nhỏ mẫu đã rửa trước dùng để đếm tế bào nhằm xác định nồng độ tế bào để cấy trong nuôi cấy. Sau đó, bạn có thể đánh giá kết quả của quy trình phân lập tế bào và xác định khả năng sống của tế bào.

Thực hành tốt nhất để lưu trữ ống nghiệm đông lạnh

Việc bảo quản lạnh mẫu trong lọ đông lạnh thành công phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong quy trình, bao gồm cả việc bảo quản và ghi chép hồ sơ đúng cách.

• Chia ô giữa các vị trí lưu trữ– Nếu thể tích cho phép, hãy chia tế bào vào các lọ và lưu trữ chúng ở những vị trí riêng biệt để giảm nguy cơ mất mẫu do hỏng thiết bị.
• Ngăn ngừa lây nhiễm chéo– Lựa chọn lọ đông lạnh vô trùng dùng một lần hoặc nồi hấp trước khi sử dụng lần sau
• Sử dụng lọ có kích thước phù hợp cho tế bào của bạn– lọ có nhiều thể tích từ 1 đến 5ml. Tránh đổ quá đầy lọ để giảm nguy cơ nứt.
• Chọn lọ đông lạnh có ren bên trong hoặc bên ngoài– Một số trường đại học khuyến nghị sử dụng lọ có ren bên trong vì lý do an toàn – chúng cũng có thể ngăn ngừa nhiễm bẩn trong quá trình chiết rót hoặc khi bảo quản trong nitơ lỏng.
• Ngăn ngừa rò rỉ- Sử dụng phớt kép đúc vào nắp vặn hoặc vòng đệm chữ O để tránh rò rỉ và nhiễm bẩn.
• Sử dụng mã vạch 2D và nhãn lọ– để đảm bảo khả năng truy xuất nguồn gốc, các lọ có vùng viết lớn cho phép dán nhãn đầy đủ cho từng lọ. Mã vạch 2D có thể giúp quản lý lưu trữ và lưu giữ hồ sơ. Nắp mã màu hữu ích để nhận dạng dễ dàng hơn.
• Bảo trì lưu trữ đầy đủ- Để đảm bảo tế bào không bị mất, các bình chứa phải liên tục theo dõi nhiệt độ và mức nitơ lỏng. Cần lắp đặt báo động để cảnh báo người dùng về lỗi.

Biện pháp phòng ngừa an toàn

Nitơ lỏng đã trở thành phương pháp phổ biến trong nghiên cứu hiện đại nhưng có nguy cơ gây thương tích nghiêm trọng nếu sử dụng không đúng cách.

Nên đeo thiết bị bảo vệ cá nhân (PPE) phù hợp để giảm thiểu nguy cơ tê cóng, bỏng và các sự cố bất lợi khác khi xử lý nitơ lỏng. Mặc

• Găng tay đông lạnh
• Áo khoác phòng thí nghiệm
• Tấm chắn toàn mặt chống va đập cũng bao phủ cả cổ
• Giày mũi kín
• Tạp dề nhựa chống nước bắn

Tủ lạnh nitơ lỏng nên được đặt ở những nơi thông gió tốt để giảm thiểu nguy cơ ngạt thở – nitơ thoát ra sẽ bốc hơi và thay thế oxy trong khí quyển. Các kho chứa khối lượng lớn nên có hệ thống báo động oxy thấp.

Làm việc theo cặp khi xử lý nitơ lỏng là lý tưởng nhất và nên cấm sử dụng ngoài giờ làm việc bình thường.

Ống nghiệm đông lạnh hỗ trợ quy trình làm việc của bạn

Công ty Suzhou Ace Biomedical cung cấp nhiều loại sản phẩm đáp ứng nhu cầu bảo quản đông lạnh của bạn cho các loại tế bào khác nhau. Danh mục sản phẩm bao gồm nhiều loại ống cũng như nhiều loại lọ đông lạnh vô trùng.

Các lọ đông lạnh của chúng tôi bao gồm:

• Nắp vặn phòng thí nghiệm 0,5mL 1,5mL 2,0mL Lọ đông lạnh Lọ đông lạnh đáy nón có miếng đệm

  ● Quy cách 0,5ml,1,5ml,2,0ml, có váy hoặc không có váy
  ● Thiết kế hình nón hoặc tự đứng, vô trùng hoặc không vô trùng đều có sẵn
  ● Ống nắp vặn được làm bằng polypropylen cấp y tế
  ● Lọ đựng mẫu PP Cryotube có thể đông lạnh và rã đông nhiều lần
  ●Thiết kế nắp bên ngoài có thể giảm khả năng nhiễm bẩn trong quá trình xử lý mẫu.
  ● Ống đông lạnh có nắp vặn Ren vít thông dụng để sử dụng
  ● Ống phù hợp với hầu hết các rôto thông dụng
  ● Ống vòng chữ O ống đông lạnh phù hợp với hộp đông lạnh tiêu chuẩn 1 inch và 2 inch, 48 giếng, 81 giếng, 96 giếng và 100 giếng
  ● Có thể khử trùng ở nhiệt độ 121°C và đông lạnh ở nhiệt độ -86°C

  PHẦN SỐ	VẬT LIỆU	ÂM LƯỢNG	Mũ lưỡi traiMÀU SẮC	Máy tính/CÁI TÚI	TÚI/HỘP
  ACT05-BL-N	PP	0,5ML	Đen, Vàng, Xanh, Đỏ, Tím, Trắng	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5ML	Đen, Vàng, Xanh, Đỏ, Tím, Trắng	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5ML	Đen, Vàng, Xanh, Đỏ, Tím, Trắng	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0ML	Đen, Vàng, Xanh, Đỏ, Tím, Trắng	500	10