Kriovialese pogosto uporabljajo za kriogeno shranjevanje celičnih linij in drugih kritičnih bioloških materialov v Dewarjevih posodah, napolnjenih s tekočim dušikom.

Uspešno shranjevanje celic v tekočem dušiku poteka v več fazah. Čeprav je osnovno načelo počasno zamrzovanje, je natančna uporabljena tehnika odvisna od vrste celic in uporabljenega krioprotektanta. Pri shranjevanju celic pri tako nizkih temperaturah je treba upoštevati več varnostnih vidikov in najboljših praks.

Ta objava želi podati pregled shranjevanja kriovial v tekočem dušiku.

Kaj so krioviale

Krioviale so majhne, ​​zaprte viale, namenjene shranjevanju tekočih vzorcev pri izjemno nizkih temperaturah. Zagotavljajo, da celice, shranjene v krioprotektantu, ne pridejo v neposreden stik s tekočim dušikom, kar zmanjšuje tveganje za celične zlome, hkrati pa še vedno koristi ekstremni hladilni učinek tekočega dušika.

Viale so običajno na voljo v različnih prostorninah in izvedbah – lahko imajo notranji ali zunanji navoj z ravnim ali zaobljenim dnom. Na voljo so tudi sterilne in nesterilne oblike.

Kdo uporabljaCyrovialsza shranjevanje celic v tekočem dušiku

Krioviale za krioprezervacijo celic uporabljajo številni laboratoriji NHS in zasebni laboratoriji ter raziskovalne ustanove, specializirane za shranjevanje popkovnične krvi, biologijo epitelijskih celic, imunologijo in biologijo matičnih celic.

Celice, shranjene na ta način, vključujejo celice B in T, celice CHO, hematopoetske matične in progenitorske celice, hibridome, črevesne celice, makrofage, mezenhimske matične in progenitorske celice, monocite, mielom, NK celice in pluripotentne matične celice.

Pregled shranjevanja kriovial v tekočem dušiku

Kriokonzervacija je postopek, ki ohranja celice in druge biološke strukture z ohlajanjem na zelo nizke temperature. Celice je mogoče shranjevati v tekočem dušiku več let, ne da bi pri tem izgubile sposobnost preživetja. To je oris uporabljenih postopkov.

Priprava celic

Natančna metoda za pripravo vzorcev se razlikuje glede na vrsto celic, vendar se na splošno celice zberejo in centrifugirajo, da se razvije s celicami bogata peleta. Ta peleta se nato resuspendira v supernatantu, pomešanem s krioprotektantom ali krioprezervacijskim medijem.

Krioprezervacijski medij

Ta medij se uporablja za ohranjanje celic v okolju z nizkimi temperaturami, ki jim bodo izpostavljene, tako da zavira nastajanje znotraj- in zunajceličnih kristalov ter s tem celično smrt. Njihova vloga je zagotavljanje varnega, zaščitnega okolja za celice in tkiva med postopki zamrzovanja, shranjevanja in odmrzovanja.

Gojišče, kot je sveže zamrznjena plazma (FFP), raztopina hepariniziranega plazmalita ali raztopine brez seruma in živalskih komponent, se zmeša s krioprotektanti, kot sta dimetilsulfoksid (DMSO) ali glicerol.

Ponovno utekočinjen vzorec pelete se alikvotno razdeli v polipropilenske krioepruvete, kot jeSuzhou Ace Biomedical company kriogene viale za shranjevanje.

Pomembno je, da kriovialk ne prepolnite, saj se s tem poveča tveganje za razpoke in morebitno iztekanje vsebine (1).

Nadzorovana stopnja zamrzovanja

Na splošno se za uspešno krioprezervacijo celic uporablja počasna nadzorovana hitrost zamrzovanja.

Ko so vzorci alikvotirani v kriogene viale, se postavijo na moker led ali v hladilnik pri 4 °C in postopek zamrzovanja se začne v 5 minutah. Na splošno velja, da se celice hladijo s hitrostjo od -1 do -3 na minuto (2). To se doseže z uporabo programabilnega hladilnika ali z namestitvijo vial v izolirano škatlo, nameščeno v zamrzovalniku s kontrolirano hitrostjo pri -70 °C do -90 °C.

Prenos v tekoči dušik

Zamrznjene kriogene viale se nato za nedoločen čas prenesejo v rezervoar s tekočim dušikom, če se vzdržuje temperatura pod -135 ℃.

Te ultra nizke temperature je mogoče doseči s potopitvijo v tekoči ali parni dušik.

Tekoča ali parna faza?

Znano je, da shranjevanje v tekočem dušiku vzdržuje hladno temperaturo z absolutno konstantnostjo, vendar se pogosto ne priporoča iz naslednjih razlogov:

• Potreba po velikih količinah (globina) tekočega dušika, kar je potencialna nevarnost. Opekline ali zadušitev zaradi tega so resnično tveganje.
• Dokumentirani primeri navzkrižne kontaminacije z povzročitelji okužb, kot sta aspergillus, hepatitis B in širjenje virusa prek tekočega dušikovega medija (2,3)
• Možnost uhajanja tekočega dušika v viale med potapljanjem. Ko se dušik vzame iz skladišča in segreje na sobno temperaturo, se hitro razširi. Posledično se lahko viala, ko jo vzamemo iz skladišča tekočega dušika, razbije, kar povzroči nevarnost tako zaradi letečih ostankov kot zaradi izpostavljenosti vsebini (1, 4).

Zaradi teh razlogov se shranjevanje pri ultra nizkih temperaturah najpogosteje izvaja v dušiku v parni fazi. Kadar je treba vzorce shranjevati v tekoči fazi, je treba uporabiti specializirane kriofleksne cevi.

Slaba stran parne faze je, da lahko pride do vertikalnega temperaturnega gradienta, ki povzroči temperaturna nihanja med -135 ℃ in -190 ℃. To zahteva skrbno in skrbno spremljanje ravni tekočega dušika in temperaturnih nihanj (5).

Mnogi proizvajalci priporočajo, da so krioviale primerne za shranjevanje do -135 ℃ ali samo za uporabo v parni fazi.

Odtajanje krioprezerviranih celic

Postopek odmrzovanja je za zamrznjeno kulturo stresen, zato je za zagotovitev optimalne viabilnosti, okrevanja in funkcionalnosti celic potrebno pravilno ravnanje in tehnika. Natančni protokoli odmrzovanja bodo odvisni od posameznih vrst celic. Vendar pa hitro odmrzovanje velja za standardno za:

• Zmanjšajte kakršen koli vpliv na celično obnovo
• Pomagajte skrajšati čas izpostavljenosti topljencem, prisotnim v zamrzovalnem mediju
• Zmanjšajte morebitno škodo zaradi rekristalizacije ledu

Za odtajanje vzorcev se običajno uporabljajo vodne kopeli, kopeli s kroglicami ali specializirani avtomatizirani instrumenti.

Najpogosteje se celična linija odtajava 1-2 minuti, tako da se nežno vrti v vodni kopeli s temperaturo 37 ℃, dokler v viali ne ostane le še majhen košček ledu, preden se spere v predhodno ogretem rastnem mediju.

Za nekatere celice, kot so zarodki sesalcev, je počasno segrevanje bistvenega pomena za njihovo preživetje.

Celice so zdaj pripravljene za celično kulturo, izolacijo celic ali v primeru hematopoetskih matičnih celic – študije viabilnosti, da se zagotovi celovitost donorskih matičnih celic pred mieloablativno terapijo.

Običajna praksa je, da se za štetje celic vzamejo majhni alikvoti predhodno opranega vzorca, s katerim se določi koncentracija celic za nasaditev v kulturo. Nato lahko ocenite rezultate postopkov izolacije celic in določite njihovo viabilnost.

Najboljše prakse za shranjevanje kriovial

Uspešna krioprezervacija vzorcev, shranjenih v kriovialah, je odvisna od številnih elementov protokola, vključno s pravilnim shranjevanjem in vodenjem evidenc.

• Razdeli celice med lokacijami shranjevanja– Če količine dopuščajo, celice razdelite med viale in jih shranite na ločenih mestih, da zmanjšate tveganje izgube vzorca zaradi okvar opreme.
• Preprečite navzkrižno kontaminacijo– Pred nadaljnjo uporabo se odločite za sterilne kriogene viale za enkratno uporabo ali avtoklavirajte.
• Za celice uporabite ustrezno velike viale.– Viale so na voljo v različnih prostorninah med 1 in 5 ml. Da bi zmanjšali tveganje za razpoke, se izogibajte prepolnjevanju vial.
• Izberite kriogene viale z notranjim ali zunanjim navojem– Nekatere univerze priporočajo viale z notranjim navojem zaradi varnostnih ukrepov – preprečijo lahko tudi kontaminacijo med polnjenjem ali shranjevanjem v tekočem dušiku.
• Preprečite puščanje- Za preprečevanje puščanja in kontaminacije uporabite dvojno vbrizgana tesnila, vlita v navojni pokrovček ali O-tesnila.
• Uporabite dvodimenzionalne črtne kode in označite viale– za zagotovitev sledljivosti viale z velikimi površinami za pisanje omogočajo ustrezno označevanje vsake viale. 2D-črtne kode lahko pomagajo pri upravljanju skladiščenja in vodenju evidenc. Barvno kodirani pokrovčki so uporabni za lažjo identifikacijo.
• Ustrezno vzdrževanje skladiščenja- Da se celice ne izgubijo, je treba v shranjevalnih posodah nenehno spremljati temperaturo in raven tekočega dušika. Namestiti je treba alarme, ki uporabnike opozarjajo na napake.

Varnostni ukrepi

Tekoči dušik je postal običajna praksa v sodobnih raziskavah, vendar nosi tveganje resnih poškodb, če se uporablja nepravilno.

Za zmanjšanje tveganja ozeblin, opeklin in drugih neželenih dogodkov pri ravnanju s tekočim dušikom je treba nositi ustrezno osebno zaščitno opremo (OZO).

• Kriogene rokavice
• Laboratorijski plašč
• Udarno odporen celoobrazni ščitnik, ki pokriva tudi vrat
• Čevlji z zaprtimi prsti
• Plastični predpasnik, odporen proti brizganju

Hladilnike s tekočim dušikom je treba namestiti v dobro prezračevanih prostorih, da se zmanjša tveganje zadušitve – uhajajoči dušik upari in izpodrine atmosferski kisik. Skladišča z veliko prostornino morajo imeti alarmne sisteme za nizko vsebnost kisika.

Delo v parih pri ravnanju s tekočim dušikom je idealno, njegova uporaba izven običajnega delovnega časa pa bi morala biti prepovedana.

Krioviale za podporo vašemu delovnemu procesu

Podjetje Suzhou Ace Biomedical ponuja širok izbor izdelkov, ki ustrezajo vašim potrebam po krioprezervaciji različnih vrst celic. Portfelj vključuje vrsto epruvet in vrsto sterilnih krioepruvet.

Naše krioepruvete so:

• Laboratorijski navojni pokrovček 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kriovialne kriogene viale s stožčastim dnom, kriogena epruveta s tesnilom

  ● Specifikacija 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, z ali brez krila
  ● Na voljo sta stožčasta ali samostoječa zasnova, sterilna ali nesterilna
  ● Tube z navojnim zamaškom so izdelane iz medicinskega polipropilena
  ● Viale iz krioepruvet PP je mogoče večkrat zamrzniti in odtajati
  ● Zasnova zunanjega pokrovčka lahko zmanjša verjetnost kontaminacije med obdelavo vzorca.
  ● Kriogene epruvete z navojnim pokrovčkom Univerzalni navoji za uporabo
  ● Cevi ustrezajo večini običajnih rotorjev
  ● Kriogene cevi z O-tesnili ustrezajo standardnim 1-palčnim in 2-palčnim, 48-vdolbinskim, 81-vdolbinskim, 96-vdolbinskim in 100-vdolbinskim zamrzovalnim škatlam
  ● Avtoklaviranje do 121 °C in zamrzovanje do -86 °C

  ŠT. DEL	MATERIAL	GLASNOST	SKPBARVA	KOSOV/VREČKA	VREČKE/ETUF
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Črna, rumena, modra, rdeča, vijolična, bela	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Črna, rumena, modra, rdeča, vijolična, bela	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Črna, rumena, modra, rdeča, vijolična, bela	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Črna, rumena, modra, rdeča, vijolična, bela	500	10