Kryoviálysa bežne používajú na kryogénne skladovanie bunkových línií a iných kritických biologických materiálov v Dewarových nádobách naplnených tekutým dusíkom.

Úspešné uchovávanie buniek v tekutom dusíku zahŕňa niekoľko fáz. Hoci základným princípom je pomalé zmrazenie, presná použitá technika závisí od typu buniek a použitého kryoprotektantu. Pri skladovaní buniek pri takýchto nízkych teplotách je potrebné zvážiť niekoľko bezpečnostných aspektov a osvedčených postupov.

Tento príspevok má za cieľ poskytnúť prehľad o tom, ako sa kryoampuľky skladujú v tekutom dusíku.

Čo sú kryoviály

Kryoviálky sú malé uzatvárateľné ampulky určené na skladovanie tekutých vzoriek pri extrémne nízkych teplotách. Zabezpečujú, aby bunky uchovávané v kryoprotektante neprišli do priameho kontaktu s tekutým dusíkom, čím sa minimalizuje riziko bunkových zlomenín a zároveň sa stále využíva extrémny chladiaci účinok tekutého dusíka.

Liekovky sú zvyčajne dostupné v rôznych objemoch a prevedeniach – môžu mať vnútorný alebo vonkajší závit s plochým alebo zaobleným dnom. K dispozícii sú aj sterilné a nesterilné prevedenia.

Kto používaCyrovialsskladovať bunky v tekutom dusíku

Kryoakustičky na kryokonzerváciu buniek používa celý rad laboratórií NHS a súkromných laboratórií, ako aj výskumných inštitúcií špecializujúcich sa na bankovníctvo pupočníkovej krvi, biológiu epitelových buniek, imunológiu a biológiu kmeňových buniek.

Medzi bunky konzervované týmto spôsobom patria B a T bunky, CHO bunky, hematopoetické kmeňové a progenitorové bunky, hybridómy, črevné bunky, makrofágy, mezenchymálne kmeňové a progenitorové bunky, monocyty, myelóm, NK bunky a pluripotentné kmeňové bunky.

Prehľad skladovania kryoampuliek v tekutom dusíku

Kryokonzervácia je proces, ktorý uchováva bunky a iné biologické konštrukty ich ochladením na veľmi nízke teploty. Bunky je možné skladovať v tekutom dusíku roky bez straty ich životaschopnosti. Toto je prehľad použitých postupov.

Príprava buniek

Presná metóda prípravy vzoriek sa bude líšiť v závislosti od typu buniek, ale vo všeobecnosti sa bunky zozbierajú a centrifugujú, aby sa vytvorila peleta bohatá na bunky. Táto peleta sa potom resuspenduje v supernatante zmiešanom s kryoprotektantom alebo kryokonzervačným médiom.

Kryokonzervačné médium

Toto médium sa používa na ochranu buniek v prostredí s nízkou teplotou, ktorému budú vystavené, a to inhibíciou tvorby intracelulárnych a extracelulárnych kryštálov, a tým aj bunkovej smrti. Ich úlohou je poskytnúť bezpečné a ochranné prostredie pre bunky a tkanivá počas procesov mrazenia, skladovania a rozmrazovania.

Médium, ako je čerstvo zmrazená plazma (FFP), roztok heparinizovaného plazmalytu alebo roztoky bez séra a živočíšnych zložiek, sa zmieša s kryoprotektantami, ako je dimetylsulfoxid (DMSO) alebo glycerol.

Znovu skvapalnená vzorka pelety sa rozdelí do polypropylénových kryoampuliek, ako napríkladKryogénne skladovacie fľaštičky spoločnosti Suzhou Ace Biomedical.

Je dôležité nepreplniť kryoampuľky, pretože to zvýši riziko prasknutia a možného úniku obsahu (1).

Kontrolovaná rýchlosť mrazenia

Vo všeobecnosti sa na úspešnú kryokonzerváciu buniek používa pomalá kontrolovaná rýchlosť mrazenia.

Po rozdelení vzoriek do kryogénnych liekoviek sa tieto umiestnia na mokrý ľad alebo do chladničky s teplotou 4 °C a proces mrazenia sa začne do 5 minút. Vo všeobecnosti sa bunky chladia rýchlosťou -1 až -3 za minútu (2). Toto sa dosiahne pomocou programovateľného chladiča alebo umiestnením liekoviek do izolovanej škatule umiestnenej v mrazničke s riadenou teplotou -70 °C až -90 °C.

Prevod na tekutý dusík

Zmrazené kryogénne fľaštičky sa potom na neurčitý čas prenesú do nádrže s kvapalným dusíkom za predpokladu, že sa udržiava teplota nižšia ako -135 ℃.

Tieto ultranízke teploty sa dajú dosiahnuť ponorením do kvapalného alebo plynného dusíka.

Kvapalná alebo plynná fáza?

Je známe, že skladovanie v kvapalnom dusíku udržiava nízku teplotu s absolútnou konzistentnosťou, ale často sa neodporúča z nasledujúcich dôvodov:

• Potreba veľkých objemov (hĺbka) tekutého dusíka, čo predstavuje potenciálne nebezpečenstvo. Popáleniny alebo udusenie v dôsledku toho predstavujú skutočné riziko.
• Zdokumentované prípady krížovej kontaminácie infekčnými agensmi, ako je aspergillus, hepatitída B a šírenie vírusu cez médium tekutého dusíka (2,3)
• Možnosť úniku tekutého dusíka do liekoviek počas ponorenia. Po vybratí zo skladu a ohriatí na izbovú teplotu sa dusík rýchlo rozpína. V dôsledku toho sa liekovka môže po vybratí zo skladu s tekutým dusíkom rozbiť, čo predstavuje nebezpečenstvo v dôsledku odlietajúcich úlomkov a vystavenia sa obsahu (1, 4).

Z týchto dôvodov sa skladovanie pri ultranízkych teplotách najčastejšie vykonáva v plynnej fáze dusíka. Ak sa vzorky musia skladovať v kvapalnej fáze, mali by sa použiť špeciálne kryoflexné trubice.

Nevýhodou plynnej fázy je, že môže dôjsť k vertikálnemu teplotnému gradientu, ktorý vedie k teplotným výkyvom medzi -135 ℃ a -190 ℃. To si vyžaduje starostlivé a dôkladné monitorovanie hladín kvapalného dusíka a teplotných zmien (5).

Mnoho výrobcov odporúča kryoampuľky na skladovanie do -135 ℃ alebo na použitie iba v plynnej fáze.

Rozmrazovanie kryokonzervovaných buniek

Postup rozmrazovania je pre zmrazenú kultúru stresujúci a na zabezpečenie optimálnej životaschopnosti, regenerácie a funkčnosti buniek je potrebná správna manipulácia a technika. Presné protokoly rozmrazovania budú závisieť od konkrétnych typov buniek. Rýchle rozmrazovanie sa však považuje za štandardné pre:

• Znížte akýkoľvek vplyv na obnovu buniek
• Pomáhajú skrátiť čas expozície rozpusteným látkam prítomným v mraziacom médiu
• Minimalizujte akékoľvek poškodenie rekryštalizáciou ľadu

Na rozmrazovanie vzoriek sa bežne používajú vodné kúpele, guľôčkové kúpele alebo špecializované automatizované prístroje.

Najčastejšie sa rozmrazuje jedna bunková línia naraz počas 1 – 2 minút jemným miešaním vo vodnom kúpeli s teplotou 37 °C, kým v liekovke nezostane len kúsok ľadu, a potom sa premyjú v predhriatom rastovom médiu.

Pre niektoré bunky, ako napríklad embryá cicavcov, je pomalé otepľovanie nevyhnutné pre ich prežitie.

Bunky sú teraz pripravené na bunkovú kultúru, izoláciu buniek alebo v prípade hematopoetických kmeňových buniek – na štúdie životaschopnosti, aby sa zaručila integrita darcovských kmeňových buniek pred myeloablatívnou terapiou.

Bežnou praxou je odobrať malé alikvotné podiely predpremytej vzorky použitej na spočítanie buniek s cieľom stanoviť ich koncentrácie na kultiváciu. Následne môžete vyhodnotiť výsledky postupov izolácie buniek a určiť životaschopnosť buniek.

Najlepšie postupy pre skladovanie kryoskúmaviek

Úspešná kryokonzervácia vzoriek uložených v kryoskúmavkách závisí od mnohých prvkov protokolu vrátane správneho skladovania a vedenia záznamov.

• Rozdelenie buniek medzi úložné miesta– Ak to objemy dovoľujú, rozdeľte bunky do liekoviek a uskladnite ich na oddelených miestach, aby ste znížili riziko straty vzorky v dôsledku zlyhania zariadenia.
• Zabráňte krížovej kontaminácii– Pred ďalším použitím zvoľte jednorazové sterilné kryogénne fľaštičky alebo autoklávujte
• Používajte fľaštičky vhodnej veľkosti pre vaše bunky– injekčné liekovky sa dodávajú v objemoch od 1 do 5 ml. Aby ste znížili riziko prasknutia, vyhnite sa preplneniu liekoviek.
• Vyberte si kryogénne vialky s vnútorným alebo vonkajším závitom– Niektoré univerzity odporúčajú z bezpečnostných dôvodov liekovky s vnútorným závitom – môžu tiež zabrániť kontaminácii počas plnenia alebo pri skladovaní v tekutom dusíku.
• Zabráňte úniku- Na zabránenie úniku a kontaminácie použite dvojito vstrekované tesnenia zaliate do skrutkovacieho uzáveru alebo O-krúžkov.
• Používajte 2D čiarové kódy a označujte fľaštičky– na zabezpečenie sledovateľnosti umožňujú liekovky s veľkými popisnými plochami dostatočné označenie každej liekovky. 2D čiarové kódy môžu pomôcť pri správe skladovania a vedení záznamov. Farebne odlíšené uzávery sú užitočné pre jednoduchšiu identifikáciu.
• Primeraná údržba skladovacích priestorov- Aby sa predišlo strate buniek, v skladovacích nádobách by sa mala neustále monitorovať teplota a hladina tekutého dusíka. Mali by byť nainštalované alarmy, ktoré upozornia používateľov na chyby.

Bezpečnostné opatrenia

Tekutý dusík sa stal bežnou praxou v modernom výskume, ale pri nesprávnom použití so sebou nesie riziko vážneho zranenia.

Pri manipulácii s kvapalným dusíkom by sa mali nosiť vhodné osobné ochranné prostriedky (OOP), aby sa minimalizovalo riziko omrzlín, popálenín a iných nežiaducich udalostí. Noste

• Kryogénne rukavice
• Laboratórny plášť
• Nárazuvzdorný celotvárový štít, ktorý zakrýva aj krk
• Topánky s uzavretou špičkou
• Plastová zástera odolná voči striekajúcej vode

Chladničky s tekutým dusíkom by mali byť umiestnené v dobre vetraných priestoroch, aby sa minimalizovalo riziko udusenia – unikajúci dusík sa odparuje a vytláča atmosférický kyslík. Veľkoobjemové sklady by mali mať poplašné systémy na signalizáciu nízkeho obsahu kyslíka.

Pri manipulácii s kvapalným dusíkom je ideálna práca vo dvojiciach a jeho používanie mimo bežnej pracovnej doby by malo byť zakázané.

Kryoampuľky na podporu vášho pracovného postupu

Spoločnosť Suzhou Ace Biomedical ponúka široký výber produktov, ktoré spĺňajú vaše potreby kryokonzervácie rôznych typov buniek. Portfólio zahŕňa rad skúmaviek, ako aj rad sterilných kryoampuliek.

Naše kryoampuľky sú:

• Laboratórny skrutkovací uzáver 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kryogénne liekovky, kryogénne liekovky s kužeľovým dnom, kryoskúmavka s tesnením

  ● Špecifikácia 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, so sukňou alebo bez sukne
  ● K dispozícii je kužeľový alebo samostatne stojaci dizajn, sterilný alebo nesterilný
  ● Skúmavky so závitovým uzáverom sú vyrobené z polypropylénu lekárskej kvality
  ● Kryoskúmkové liekovky z PP je možné opakovane zmrazovať a rozmrazovať
  ● Dizajn vonkajšieho uzáveru môže znížiť pravdepodobnosť kontaminácie počas spracovania vzorky.
  ● Kryogénne skúmavky so závitovým uzáverom Univerzálne závity na použitie
  ● Rúry pasujú na väčšinu bežných rotorov
  ● Kryogénne trubice s O-krúžkami sú vhodné pre štandardné mraziace boxy s priemerom 1 a 2 palce, 48, 81, 96 a 100 jamiek
  ● Autoklávovateľné do 121 °C a mraziteľné do -86 °C

  ČÍSLO DIELU	MATERIÁL	OBJEM	SPPFARBA	KS/TAŠKA	TAŠKY/PUDRE
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Čierna, žltá, modrá, červená, fialová, biela	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Čierna, žltá, modrá, červená, fialová, biela	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Čierna, žltá, modrá, červená, fialová, biela	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Čierna, žltá, modrá, červená, fialová, biela	500	10