Kryoampullerbrukes ofte til kryogen lagring av cellelinjer og annet kritisk biologisk materiale, i Dewar-tanker fylt med flytende nitrogen.

Det er flere stadier involvert i vellykket konservering av celler i flytende nitrogen. Selv om grunnprinsippet er langsom frysing, avhenger den nøyaktige teknikken som brukes av celletypen og kryobeskyttelsesmiddelet som brukes. Det er flere sikkerhetshensyn og beste praksis å ta hensyn til når man lagrer celler ved så lave temperaturer.

Dette innlegget har som mål å gi en oversikt over hvordan kryoampuller oppbevares i flytende nitrogen.

Hva er kryoampuller

Kryoampuller er små, lukkede ampuller som er utformet for oppbevaring av flytende prøver ved ekstremt lave temperaturer. De sikrer at celler som er bevart i kryobeskyttelsesmiddel ikke kommer i direkte kontakt med flytende nitrogen, noe som minimerer risikoen for cellefrakturer samtidig som de drar nytte av den ekstreme kjøleeffekten av flytende nitrogen.

Ampullene er vanligvis tilgjengelige i en rekke volumer og design – de kan være innvendig eller utvendig gjenget med flat eller avrundet bunn. Sterile og ikke-sterile formater er også tilgjengelige.

Hvem brukerCyrovialerå lagre celler i flytende nitrogen

En rekke NHS- og private laboratorier, samt forskningsinstitusjoner som spesialiserer seg på navlestrengsblodbankvirksomhet, epitelcellebiologi, immunologi og stamcellebiologi, bruker kryoampuller for å kryokonservere celler.

Celler som er bevart på denne måten inkluderer B- og T-celler, CHO-celler, hematopoietiske stam- og progenitorceller, hybridomer, tarmceller, makrofager, mesenkymale stam- og progenitorceller, monocytter, myelom, NK-celler og pluripotente stamceller.

Oversikt over hvordan du oppbevarer kryoampuller i flytende nitrogen

Kryopreservering er en prosess som bevarer celler og andre biologiske konstruksjoner ved å kjøle dem ned til svært lave temperaturer. Celler kan lagres i flytende nitrogen i årevis uten tap av cellelevedyktighet. Dette er en oversikt over prosedyrene som brukes.

Celleforberedelse

Den nøyaktige metoden for å preparere prøver vil variere avhengig av celletypen, men generelt samles cellene inn og sentrifugeres for å utvikle en cellerik pellet. Denne pelleten resuspenderes deretter i supernatanten blandet med kryobeskyttelsesmiddel eller et kryokonserveringsmedium.

Kryopreservasjonsmedium

Dette mediet brukes til å bevare celler i de lave temperaturmiljøene de vil bli utsatt for ved å hemme dannelsen av intra- og ekstracellulære krystaller og dermed celledød. Deres rolle er å gi et trygt og beskyttende miljø for celler og vev under fryse-, lagrings- og tiningsprosessene.

Et medium som ferskfrossent plasma (FFP), heparinisert plasmalyttløsning eller serumfrie løsninger uten animalske komponenter blandes med kryobeskyttelsesmidler som dimetylsulfoksid (DMSO) eller glyserol.

Den gjenoppløste prøvepelleten alikvoteres i polypropylen-kryoampuller, som f.eks.Suzhou Ace Biomedical-selskapets kryogene oppbevaringsampuller.

Det er viktig å ikke overfylle kryoflaskene, da dette vil øke risikoen for sprekkdannelser og mulig utslipp av innhold (1).

Kontrollert frysehastighet

Generelt brukes en langsom kontrollert frysehastighet for vellykket kryokonservering av celler.

Etter at prøvene er alikvotert i kryogene ampuller, plasseres de på våt is eller i et kjøleskap ved 4 °C, og fryseprosedyren startes innen 5 minutter. Som en generell veiledning avkjøles cellene med en hastighet på -1 til -3 per minutt (2). Dette oppnås ved hjelp av en programmerbar kjøler eller ved å plassere ampullene i en isolert boks plassert i en fryser med kontrollert hastighet på -70 °C til -90 °C.

Overføring til flytende nitrogen

De frosne kryogeniske hetteglassene overføres deretter til en tank med flytende nitrogen i ubestemte perioder, forutsatt at en temperatur på under -135 ℃ opprettholdes.

Disse ultralave temperaturene kan oppnås ved nedsenking i flytende eller dampfase nitrogen.

Flytende eller dampfase?

Lagring i flytende fase nitrogen er kjent for å opprettholde den kalde temperaturen med absolutt konsistens, men anbefales ofte ikke av følgende grunner:

• Behovet for store mengder (dybde) flytende nitrogen, som er en potensiell fare. Brannskader eller kvelning på grunn av dette er en reell risiko.
• Dokumenterte tilfeller av krysskontaminering med smittestoffer som aspergillus, hep B og virusspredning via flytende nitrogenmedium (2,3)
• Potensialet for at flytende nitrogen lekker inn i ampullene under nedsenking. Når nitrogenet tas ut av lagring og varmes opp til romtemperatur, utvider det seg raskt. Følgelig kan ampullen knuse når den tas ut av lagringen av flytende nitrogen, noe som skaper en fare fra både flygende avfall og eksponering for innholdet (1, 4).

Av disse grunnene er lagring ved ultralav temperatur vanligvis i nitrogen i dampfase. Når prøver må lagres i flytende fase, bør spesialisert kryofleksislange brukes.

Ulempen med dampfasen er at det kan oppstå en vertikal temperaturgradient som resulterer i temperatursvingninger mellom -135 ℃ og -190 ℃. Dette krever nøye og grundig overvåking av nivåene av flytende nitrogen og temperaturvariasjoner (5).

Mange produsenter anbefaler at kryoampuller er egnet for oppbevaring ned til -135 ℃ eller kun for bruk i dampfase.

Tining av kryopreserverte celler

Tiningsprosedyren er stressende for en frossen kultur, og riktig håndtering og teknikk er nødvendig for å sikre optimal levedyktighet, gjenoppretting og funksjonalitet for cellene. De nøyaktige tineprotokollene vil avhenge av spesifikke celletyper. Rask tining anses imidlertid som standard for å:

• Reduser enhver påvirkning på cellulær gjenoppretting
• Bidra til å redusere eksponeringstiden for de oppløste stoffene som finnes i frysemediet
• Minimer eventuelle skader ved iskrystallisering

Vannbad, perlebad eller spesialiserte automatiserte instrumenter brukes ofte til å tine prøver.

Vanligvis tines én cellelinje om gangen i 1–2 minutter, ved å forsiktig virvle dem i et vannbad på 37 ℃ til det er bare litt is igjen i flasken før de vaskes i et forvarmet vekstmedium.

For noen celler, som pattedyrembryoer, er langsom oppvarming avgjørende for deres overlevelse.

Cellene er nå klare for cellekultur, celleisolering, eller i tilfelle hematopoietiske stamceller – levedyktighetsstudier for å garantere integriteten til donorstamcellene før myeloablativ behandling.

Det er vanlig praksis å ta små alikvoter av den forvaskede prøven som brukes til å utføre en celletelling for å bestemme cellekonsentrasjoner for plating i kultur. Deretter kan du vurdere resultatene av celleisoleringsprosedyrene og bestemme cellelevedyktigheten.

Beste praksis for oppbevaring av kryoampuller

Vellykket kryokonservering av prøver lagret i kryoampuller avhenger av mange elementer i protokollen, inkludert riktig oppbevaring og journalføring.

• Del celler mellom lagringssteder– Hvis volumet tillater det, fordel cellene mellom hetteglassene og oppbevar dem på separate steder for å redusere risikoen for prøvetap på grunn av utstyrsfeil.
• Forhindre krysskontaminering– Velg sterile kryogeniske ampuller til engangsbruk eller autoklav før senere bruk
• Bruk ampuller av passende størrelse til cellene dine– hetteglassene finnes i volumer mellom 1 og 5 ml. Unngå å overfylle hetteglassene for å redusere risikoen for sprekkdannelser.
• Velg kryogeniske ampuller med innvendig eller utvendig gjenge– Noen universiteter anbefaler innvendige gjengede ampuller av sikkerhetsmessige årsaker – de kan også forhindre kontaminering under fylling eller ved lagring i flytende nitrogen.
• Forhindre lekkasje- Bruk bi-injiserte tetninger støpt inn i skrukorken eller O-ringene for å forhindre lekkasje og forurensning.
• Bruk 2D-strekkoder og merk hetteglass– for å sikre sporbarhet, gjør ampuller med store skriveflater det mulig å merke hvert ampulle tilstrekkelig. 2D-strekkoder kan hjelpe med lagringshåndtering og journalføring. Fargekodede korker er nyttige for enklere identifisering.
• Tilstrekkelig vedlikehold av lagring- For å sikre at celler ikke går tapt, bør lagringsbeholdere kontinuerlig overvåke temperaturen og nivåene av flytende nitrogen. Alarmer bør monteres for å varsle brukere om feil.

Sikkerhetsregler

Flytende nitrogen har blitt vanlig praksis i moderne forskning, men medfører risiko for alvorlig skade hvis det brukes feil.

Riktig personlig verneutstyr (PPE) bør brukes for å minimere risikoen for frostskader, brannskader og andre uønskede hendelser ved håndtering av flytende nitrogen. Bruk

• Kryogene hansker
• Laboratoriefrakk
• Slagsikkert heldekkende ansiktsskjerm som også dekker nakken
• Lukkede sko
• Sprutsikkert plastforkle

Flytende nitrogenkjøleskap bør plasseres i godt ventilerte områder for å minimere risikoen for kvelning – nitrogen som slipper ut fordamper og fortrenger atmosfærisk oksygen. Store lagre bør ha alarmsystemer for lavt oksygeninnhold.

Det er ideelt å jobbe to og to når man håndterer flytende nitrogen, og bruk utenom vanlig arbeidstid bør forbys.

Kryoampuller som støtter arbeidsflyten din

Suzhou Ace Biomedical tilbyr et bredt utvalg av produkter som dekker dine behov for kryopreservering for ulike typer celler. Porteføljen inkluderer en rekke rør samt en rekke sterile kryoampuller.

Våre kryoampuller er:

• Lab-skrukork 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kryogeniske ampuller Kryorør med konisk bunn og pakning

  ● Spesifikasjon på 0,5 ml, 1,5 ml og 2,0 ml, med skjørt eller uten skjørt
  ● Konisk eller frittstående design, steril eller ikke-steril er tilgjengelig
  ● Skrukorker er laget av medisinsk polypropylen
  ● PP-kryorørampuller kan fryses og tines gjentatte ganger
  ● Utformingen av den utvendige hetten kan redusere sannsynligheten for kontaminering under prøvebehandling.
  ● Kryogenrør med skrukork Universalgjenger for bruk
  ● Rør passer til de fleste vanlige rotorer
  ● O-ringrør for kryogenrør passer til standard 1-tommers og 2-tommers frysebokser med 48 brønner, 81 brønner, 96 brønner og 100 brønner
  ● Autoklaverbar til 121 °C og frysbar til -86 °C

  DEL NR.	MATERIALE	VOLUM	LOKKFARGE	PCS/BAG	VESKER/ETUER
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Svart, gul, blå, rød, lilla, hvit	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Svart, gul, blå, rød, lilla, hvit	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Svart, gul, blå, rød, lilla, hvit	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Svart, gul, blå, rød, lilla, hvit	500	10