Κρυοφιαλίδιαχρησιμοποιούνται συνήθως για την κρυογονική αποθήκευση κυτταρικών σειρών και άλλων κρίσιμων βιολογικών υλικών, σε δοχεία Dewar γεμάτα με υγρό άζωτο.

Υπάρχουν διάφορα στάδια που εμπλέκονται στην επιτυχή συντήρηση των κυττάρων σε υγρό άζωτο. Ενώ η βασική αρχή είναι η αργή κατάψυξη, η ακριβής τεχνική που χρησιμοποιείται εξαρτάται από τον τύπο κυττάρου και το κρυοπροστατευτικό που χρησιμοποιείται. Υπάρχουν αρκετές παράμετροι ασφαλείας και βέλτιστες πρακτικές που πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την αποθήκευση κυττάρων σε τόσο χαμηλές θερμοκρασίες.

Αυτή η ανάρτηση στοχεύει να δώσει μια επισκόπηση του τρόπου αποθήκευσης των κρυοφιαλιδίων σε υγρό άζωτο.

Τι είναι τα κρυοβολικά

Τα κρυοφιαλίδια είναι μικρά, πωματισμένα φιαλίδια σχεδιασμένα για την αποθήκευση υγρών δειγμάτων σε εξαιρετικά χαμηλές θερμοκρασίες. Διασφαλίζουν ότι τα κύτταρα που διατηρούνται σε κρυοπροστατευτικό δεν έρχονται σε άμεση επαφή με το υγρό άζωτο, ελαχιστοποιώντας τον κίνδυνο κυτταρικών καταγμάτων, ενώ παράλληλα επωφελούνται από την εξαιρετική ψυκτική δράση του υγρού αζώτου.

Τα φιαλίδια διατίθενται συνήθως σε μια σειρά από όγκους και σχέδια – μπορούν να έχουν εσωτερικό ή εξωτερικό σπείρωμα με επίπεδο ή στρογγυλεμένο πυθμένα. Διατίθενται επίσης αποστειρωμένες και μη αποστειρωμένες μορφές.

Ποιος χρησιμοποιείΚυροβιάλγια την αποθήκευση κυττάρων σε υγρό άζωτο

Μια σειρά από εργαστήρια του NHS και ιδιωτικά εργαστήρια, καθώς και ερευνητικά ιδρύματα που ειδικεύονται στις τράπεζες αίματος ομφάλιου λώρου, στη βιολογία επιθηλιακών κυττάρων, στην ανοσολογία και στη βιολογία βλαστοκυττάρων χρησιμοποιούν κρυοφιαλίδια για την κρυοσυντήρηση κυττάρων.

Τα κύτταρα που διατηρούνται με αυτόν τον τρόπο περιλαμβάνουν Β και Τ κύτταρα, κύτταρα CHO, αιμοποιητικά βλαστικά και προγονικά κύτταρα, υβριδώματα, εντερικά κύτταρα, μακροφάγα, μεσεγχυματικά βλαστικά και προγονικά κύτταρα, μονοκύτταρα, μυέλωμα, κύτταρα NK και πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα.

Επισκόπηση του τρόπου αποθήκευσης κρυοφιαλιδίων σε υγρό άζωτο

Η κρυοσυντήρηση είναι μια διαδικασία που διατηρεί τα κύτταρα και άλλα βιολογικά κατασκευάσματα ψύχοντάς τα σε πολύ χαμηλές θερμοκρασίες. Τα κύτταρα μπορούν να αποθηκευτούν σε υγρό άζωτο για χρόνια χωρίς απώλεια της κυτταρικής βιωσιμότητας. Αυτή είναι μια περίληψη των διαδικασιών που χρησιμοποιούνται.

Παρασκευή κυττάρων

Η ακριβής μέθοδος για την παρασκευή δειγμάτων ποικίλλει ανάλογα με τον τύπο κυττάρου, αλλά γενικά, τα κύτταρα συλλέγονται και φυγοκεντρούνται για να αναπτυχθεί ένα πλούσιο σε κύτταρα ίζημα. Αυτό το ίζημα στη συνέχεια επαναιωρείται στο υπερκείμενο υγρό αναμεμειγμένο με κρυοπροστατευτικό ή μέσο κρυοσυντήρησης.

Μέσο κρυοσυντήρησης

Αυτό το μέσο χρησιμοποιείται για τη διατήρηση των κυττάρων σε περιβάλλοντα χαμηλής θερμοκρασίας στα οποία θα υποβληθούν, αναστέλλοντας τον σχηματισμό ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών κρυστάλλων και, ως εκ τούτου, τον κυτταρικό θάνατο. Ο ρόλος τους είναι να παρέχουν ένα ασφαλές, προστατευτικό περιβάλλον για τα κύτταρα και τους ιστούς κατά τη διάρκεια των διαδικασιών κατάψυξης, αποθήκευσης και απόψυξης.

Ένα μέσο όπως φρέσκο ​​κατεψυγμένο πλάσμα (FFP), ηπαρινισμένο διάλυμα πλασμαλύτη ή διαλύματα χωρίς ορό, χωρίς ζωικά συστατικά, αναμειγνύεται με κρυοπροστατευτικά όπως διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ή γλυκερόλη.

Το επαναυγροποιημένο σφαιρίδιο δείγματος κατανέμεται σε κρυοφιαλίδια πολυπροπυλενίου όπωςΚρυογονικά φιαλίδια αποθήκευσης Suzhou Ace Biomedical company.

Είναι σημαντικό να μην υπερχειλίζετε τα κρυοφιαλίδια, καθώς αυτό θα αυξήσει τον κίνδυνο ρωγμών και την πιθανή απελευθέρωση περιεχομένου (1).

Ελεγχόμενος ρυθμός κατάψυξης

Γενικά, για την επιτυχή κρυοσυντήρηση των κυττάρων χρησιμοποιείται αργός ελεγχόμενος ρυθμός κατάψυξης.

Αφού τα δείγματα χωριστούν σε κρυογονικά φιαλίδια, τοποθετούνται σε υγρό πάγο ή σε ψυγείο στους 4℃ και η διαδικασία κατάψυξης ξεκινά εντός 5 λεπτών. Γενικά, τα κύτταρα ψύχονται με ρυθμό -1 έως -3 ανά λεπτό (2). Αυτό επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας προγραμματιζόμενο ψύκτη ή τοποθετώντας τα φιαλίδια σε μονωμένο κουτί τοποθετημένο σε καταψύκτη ελεγχόμενου ρυθμού από –70°C έως –90°C.

Μεταφορά σε υγρό άζωτο

Τα κατεψυγμένα κρυογονικά φιαλίδια μεταφέρονται στη συνέχεια σε δεξαμενή υγρού αζώτου για αόριστο χρονικό διάστημα, υπό την προϋπόθεση ότι διατηρείται θερμοκρασία μικρότερη από -135℃.

Αυτές οι εξαιρετικά χαμηλές θερμοκρασίες μπορούν να επιτευχθούν με εμβάπτιση στο άζωτο σε υγρή ή αέρια φάση.

Υγρή ή Ατμώδης Φάση;

Η αποθήκευση σε άζωτο υγρής φάσης είναι γνωστό ότι διατηρεί τη χαμηλή θερμοκρασία με απόλυτη σταθερότητα, αλλά συχνά δεν συνιστάται για τους ακόλουθους λόγους:

• Η ανάγκη για μεγάλους όγκους (βάθος) υγρού αζώτου, η οποία αποτελεί πιθανό κίνδυνο. Τα εγκαύματα ή η ασφυξία λόγω αυτού αποτελούν πραγματικό κίνδυνο.
• Τεκμηριωμένες περιπτώσεις διασταυρούμενης μόλυνσης από μολυσματικούς παράγοντες όπως ο ασπεργίλλος, η ηπατίτιδα Β και ιικής εξάπλωσης μέσω του υγρού αζώτου (2,3)
• Υπάρχει πιθανότητα διαρροής υγρού αζώτου στα φιαλίδια κατά την εμβάπτιση. Όταν αφαιρεθεί από την αποθήκευση και θερμανθεί σε θερμοκρασία δωματίου, το άζωτο διαστέλλεται ταχέως. Κατά συνέπεια, το φιαλίδιο μπορεί να θρυμματιστεί όταν αφαιρεθεί από την αποθήκευση υγρού αζώτου, δημιουργώντας κίνδυνο τόσο από ιπτάμενα υπολείμματα όσο και από έκθεση στο περιεχόμενο (1, 4).

Για αυτούς τους λόγους, η αποθήκευση σε εξαιρετικά χαμηλή θερμοκρασία γίνεται συνήθως σε άζωτο σε αέρια φάση. Όταν τα δείγματα πρέπει να αποθηκευτούν στην υγρή φάση, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται εξειδικευμένοι σωλήνες κρυο-εύκαμπτοι.

Το μειονέκτημα της αέριας φάσης είναι ότι μπορεί να εμφανιστεί μια κατακόρυφη θερμοκρασιακή κλίση με αποτέλεσμα διακυμάνσεις θερμοκρασίας μεταξύ -135℃ και -190℃. Αυτό απαιτεί προσεκτική και επιμελή παρακολούθηση των επιπέδων υγρού αζώτου και των διακυμάνσεων της θερμοκρασίας (5).

Πολλοί κατασκευαστές συνιστούν τα κρυοφιαλίδια να είναι κατάλληλα για αποθήκευση έως -135℃ ή για χρήση μόνο στην αέρια φάση.

Απόψυξη των κρυοσυντηρημένων κυττάρων σας

Η διαδικασία απόψυξης είναι αγχωτική για μια κατεψυγμένη καλλιέργεια και απαιτείται σωστός χειρισμός και τεχνική για να διασφαλιστεί η βέλτιστη βιωσιμότητα, ανάκτηση και λειτουργικότητα των κυττάρων. Τα ακριβή πρωτόκολλα απόψυξης θα εξαρτηθούν από τους συγκεκριμένους τύπους κυττάρων. Ωστόσο, η ταχεία απόψυξη θεωρείται τυπική για:

• Μειώστε τυχόν επιπτώσεις στην κυτταρική αποκατάσταση
• Βοηθά στη μείωση του χρόνου έκθεσης στις διαλυμένες ουσίες που υπάρχουν στο μέσο κατάψυξης
• Ελαχιστοποιήστε τυχόν ζημιές μέσω ανακρυστάλλωσης πάγου

Λουτρά νερού, λουτρά με χάντρες ή εξειδικευμένα αυτοματοποιημένα όργανα χρησιμοποιούνται συνήθως για την απόψυξη δειγμάτων.

Τις περισσότερες φορές, αποψύχεται 1 κυτταρική σειρά κάθε φορά για 1-2 λεπτά, αναδεύοντας απαλά σε υδατόλουτρο στους 37℃ μέχρι να μείνει έστω και μια μικρή ποσότητα πάγου στο φιαλίδιο, προτού πλυθούν σε προθερμασμένο μέσο ανάπτυξης.

Για ορισμένα κύτταρα, όπως τα έμβρυα θηλαστικών, η αργή θέρμανση είναι απαραίτητη για την επιβίωσή τους.

Τα κύτταρα είναι πλέον έτοιμα για κυτταροκαλλιέργεια, απομόνωση κυττάρων ή, στην περίπτωση των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων, για μελέτες βιωσιμότητας για να διασφαλιστεί η ακεραιότητα των βλαστικών κυττάρων του δότη πριν από τη μυελοαφαιρετική θεραπεία.

Είναι συνήθης πρακτική να λαμβάνετε μικρά κλάσματα του προπλυμένου δείγματος που χρησιμοποιείται για την εκτέλεση καταμέτρησης κυττάρων, ώστε να προσδιοριστούν οι συγκεντρώσεις κυττάρων για καλλιέργεια. Στη συνέχεια, μπορείτε να αξιολογήσετε τα αποτελέσματα των διαδικασιών απομόνωσης κυττάρων και να προσδιορίσετε τη βιωσιμότητα των κυττάρων.

Βέλτιστες πρακτικές για την αποθήκευση κρυοφιαλιδίων

Η επιτυχής κρυοσυντήρηση δειγμάτων που αποθηκεύονται σε κρυοφιαλίδια εξαρτάται από πολλά στοιχεία του πρωτοκόλλου, όπως η σωστή αποθήκευση και η τήρηση αρχείων.

• Διαχωρισμός κελιών μεταξύ θέσεων αποθήκευσης– Εάν οι όγκοι το επιτρέπουν, χωρίστε τα κύτταρα μεταξύ των φιαλιδίων και αποθηκεύστε τα σε ξεχωριστές θέσεις για να μειώσετε τον κίνδυνο απώλειας δείγματος λόγω βλαβών του εξοπλισμού.
• Αποτρέψτε τη διασταυρούμενη μόλυνση– Επιλέξτε αποστειρωμένα κρυογονικά φιαλίδια ή αυτόκλειστο μιας χρήσης πριν από την επόμενη χρήση
• Χρησιμοποιήστε φιαλίδια κατάλληλου μεγέθους για τα κελιά σας– τα φιαλίδια διατίθενται σε ποσότητες μεταξύ 1 και 5 ml. Αποφύγετε την υπερπλήρωση των φιαλιδίων για να μειώσετε τον κίνδυνο ρωγμών.
• Επιλέξτε κρυογονικά φιαλίδια με εσωτερικό ή εξωτερικό σπείρωμα– Ορισμένα πανεπιστήμια συνιστούν φιαλίδια με εσωτερικό σπείρωμα για μέτρα ασφαλείας – μπορούν επίσης να αποτρέψουν τη μόλυνση κατά την πλήρωση ή όταν αποθηκεύονται σε υγρό άζωτο.
• Αποτρέψτε τη διαρροή- Χρησιμοποιήστε διπλής έγχυσης στεγανοποιήσεις ενσωματωμένες στο βιδωτό καπάκι ή στους δακτυλίους Ο για την αποφυγή διαρροών και μόλυνσης.
• Χρησιμοποιήστε δισδιάστατους γραμμωτούς κώδικες και επισημάνετε τα φιαλίδια– για να διασφαλιστεί η ιχνηλασιμότητα, τα φιαλίδια με μεγάλες περιοχές γραφής επιτρέπουν την επαρκή επισήμανση κάθε φιαλιδίου. Οι δισδιάστατοι γραμμωτοί κώδικες μπορούν να βοηθήσουν στη διαχείριση της αποθήκευσης και την τήρηση αρχείων. Τα χρωματικά κωδικοποιημένα καπάκια είναι χρήσιμα για ευκολότερη αναγνώριση.
• Επαρκής συντήρηση αποθήκευσης- Για να διασφαλιστεί ότι δεν θα χαθούν κύτταρα, τα δοχεία αποθήκευσης θα πρέπει να παρακολουθούν συνεχώς τη θερμοκρασία και τα επίπεδα υγρού αζώτου. Θα πρέπει να τοποθετούνται συναγερμοί για να ειδοποιούν τους χρήστες για σφάλματα.

Προφυλάξεις ασφαλείας

Το υγρό άζωτο έχει γίνει κοινή πρακτική στη σύγχρονη έρευνα, αλλά ενέχει τον κίνδυνο σοβαρού τραυματισμού εάν χρησιμοποιηθεί εσφαλμένα.

Πρέπει να φοράτε τον κατάλληλο ατομικό προστατευτικό εξοπλισμό (ΜΑΠ) για να ελαχιστοποιήσετε τον κίνδυνο κρυοπαγημάτων, εγκαυμάτων και άλλων ανεπιθύμητων συμβάντων κατά τον χειρισμό υγρού αζώτου.

• Κρυογονικά γάντια
• Εργαστηριακή ρόμπα
• Ασπίδα προσώπου ανθεκτική στις κρούσεις που καλύπτει και τον λαιμό
• Κλειστά παπούτσια
• Ποδιά από πλαστικό ανθεκτικό στα πιτσιλίσματα

Τα ψυγεία υγρού αζώτου θα πρέπει να τοποθετούνται σε καλά αεριζόμενους χώρους για την ελαχιστοποίηση του κινδύνου ασφυξίας – το διαφυγόν άζωτο εξατμίζεται και εκτοπίζει το ατμοσφαιρικό οξυγόνο. Οι μεγάλες αποθήκες θα πρέπει να διαθέτουν συστήματα συναγερμού χαμηλού οξυγόνου.

Η εργασία σε ζεύγη κατά τον χειρισμό υγρού αζώτου είναι ιδανική και η χρήση του εκτός των κανονικών ωρών εργασίας θα πρέπει να απαγορεύεται.

Κρυοβολβικά για την υποστήριξη της ροής εργασίας σας

Η εταιρεία Suzhou Ace Biomedical προσφέρει μια μεγάλη ποικιλία προϊόντων που καλύπτουν τις ανάγκες σας σε κρυοσυντήρηση για διαφορετικούς τύπους κυττάρων. Το χαρτοφυλάκιο περιλαμβάνει μια σειρά από σωληνάρια καθώς και μια σειρά από αποστειρωμένα κρυοφιαλίδια.

Τα κρυοφιαλίδια μας είναι:

• Κρυογονικά φιαλίδια εργαστηρίου με βιδωτό καπάκι 0,5mL 1,5mL 2,0mL, κρυογονικά φιαλίδια με κωνικό πυθμένα και φλάντζα

  ● Προδιαγραφές 0,5ml, 1,5ml, 2,0ml, με φούστα ή χωρίς φούστα
  ● Διατίθενται κωνικός ή αυτοστηριζόμενος σχεδιασμός, αποστειρωμένοι ή μη αποστειρωμένοι
  ● Οι σωλήνες με βιδωτό καπάκι είναι κατασκευασμένοι από πολυπροπυλένιο ιατρικής ποιότητας
  ● Τα φιαλίδια κρυοσωλήνων PP μπορούν να καταψυχθούν και να αποψυχθούν επανειλημμένα
  ● Ο σχεδιασμός του εξωτερικού καπακιού μπορεί να μειώσει την πιθανότητα μόλυνσης κατά την επεξεργασία του δείγματος.
  ● Κρυογονικοί σωλήνες με βιδωτό καπάκι Σπειρώματα γενικής χρήσης για χρήση
  ● Οι σωλήνες ταιριάζουν στους περισσότερους κοινούς ρότορες
  ● Οι κρυογονικοί σωλήνες o-ring ταιριάζουν σε τυπικά κουτιά κατάψυξης 1 ίντσας και 2 ιντσών, 48 φρεατίων, 81 φρεατίων, 96 φρεατίων και 100 φρεατίων
  ● Μπορεί να αποστειρωθεί σε αυτόκλειστο στους 121°C και να καταψυχθεί στους -86°C

  ΑΡΙΘΜΟΣ ΜΕΡΟΥΣ	ΥΛΙΚΟ	ΤΟΜΟΣ	ΚΑΠΑΚΙΧΡΩΜΑ	PCS/ΤΣΑΝΤΑ	ΤΣΑΝΤΕΣ/ΘΗΚΗ
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Μαύρο, Κίτρινο, Μπλε, Κόκκινο, Μωβ, Λευκό	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Μαύρο, Κίτρινο, Μπλε, Κόκκινο, Μωβ, Λευκό	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Μαύρο, Κίτρινο, Μπλε, Κόκκινο, Μωβ, Λευκό	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Μαύρο, Κίτρινο, Μπλε, Κόκκινο, Μωβ, Λευκό	500	10