Kryohætteglasbruges almindeligvis til kryogen opbevaring af cellelinjer og andre kritiske biologiske materialer i dewar-tanke fyldt med flydende nitrogen.

Der er flere trin involveret i vellykket konservering af celler i flydende nitrogen. Selvom det grundlæggende princip er langsom frysning, afhænger den præcise teknik, der anvendes, af celletypen og det anvendte kryobeskyttelsesmiddel. Der er flere sikkerhedshensyn og bedste praksis, der skal tages i betragtning ved opbevaring af celler ved så lave temperaturer.

Dette indlæg har til formål at give et overblik over, hvordan kryohætteglas opbevares i flydende nitrogen.

Hvad er kryohætteglas

Kryoglas er små hætteglas med låg, der er designet til opbevaring af flydende prøver ved ekstremt lave temperaturer. De sikrer, at celler, der er opbevaret i kryobeskyttelsesmiddel, ikke kommer i direkte kontakt med flydende nitrogen, hvilket minimerer risikoen for cellebrud, samtidig med at de stadig drager fordel af den ekstreme køleeffekt af flydende nitrogen.

Hætteglassene fås normalt i en række forskellige volumener og designs – de kan have indvendig eller udvendig gevind med flad eller afrundet bund. Sterile og ikke-sterile formater er også tilgængelige.

Hvem brugerCyrovialerat opbevare celler i flydende nitrogen

En række NHS- og private laboratorier samt forskningsinstitutioner med speciale i navlestrengsblodbankvirksomhed, epitelcellebiologi, immunologi og stamcellebiologi bruger kryohætteglas til at kryopræservere celler.

Celler, der er bevaret på denne måde, omfatter B- og T-celler, CHO-celler, hæmatopoietiske stam- og progenitorceller, hybridomer, tarmceller, makrofager, mesenkymale stam- og progenitorceller, monocytter, myelom, NK-celler og pluripotente stamceller.

Oversigt over opbevaring af kryohætteglas i flydende nitrogen

Kryopræservering er en proces, der bevarer celler og andre biologiske konstruktioner ved at afkøle dem til meget lave temperaturer. Celler kan opbevares i flydende nitrogen i årevis uden tab af cellelevedygtighed. Dette er en oversigt over de anvendte procedurer.

Celleforberedelse

Den præcise metode til fremstilling af prøver vil variere afhængigt af celletypen, men generelt opsamles og centrifugeres cellerne for at udvikle en cellerig pellet. Denne pellet resuspenderes derefter i supernatanten blandet med kryobeskyttelsesmiddel eller et kryopræserveringsmedium.

Kryopræserveringsmedium

Dette medium anvendes til at bevare celler i de lave temperaturmiljøer, de vil blive udsat for, ved at hæmme dannelsen af ​​intra- og ekstracellulære krystaller og dermed celledød. Deres rolle er at skabe et sikkert og beskyttende miljø for celler og væv under frysnings-, opbevarings- og optøningsprocesserne.

Et medium såsom frisk frossen plasma (FFP), hepariniseret plasmalytopløsning eller serumfri opløsninger uden animalske komponenter blandes med kryobeskyttelsesmidler såsom dimethylsulfoxid (DMSO) eller glycerol.

Den genopløste prøvepellet alikvoteres i polypropylen-kryohætteglas, såsomSuzhou Ace Biomedical Company Kryogene Opbevaringsflasker.

Det er vigtigt ikke at overfylde kryohætteglassene, da dette vil øge risikoen for revner og mulig frigivelse af indhold (1).

Kontrolleret frysehastighed

Generelt anvendes en langsom, kontrolleret frysehastighed til vellykket kryopræservering af celler.

Efter at prøverne er aliquoteret i kryogene hætteglas, placeres de på våd is eller i et 4℃ køleskab, og fryseproceduren startes inden for 5 minutter. Som en generel vejledning afkøles cellerne med en hastighed på -1 til -3 pr. minut (2). Dette opnås ved hjælp af en programmerbar køler eller ved at placere hætteglassene i en isoleret kasse placeret i en -70°C til -90°C fryser med kontrolleret hastighed.

Overførsel til flydende nitrogen

De frosne kryogene hætteglas overføres derefter til en tank med flydende nitrogen i ubestemte perioder, forudsat at en temperatur på under -135 ℃ opretholdes.

Disse ultralave temperaturer kan opnås ved nedsænkning i flydende eller dampfase af nitrogen.

Flydende eller dampfase?

Opbevaring i flydende fase af nitrogen er kendt for at opretholde den kolde temperatur med absolut konsistens, men anbefales ofte ikke af følgende årsager:

• Behovet for store mængder (dybde) flydende nitrogen, hvilket er en potentiel fare. Forbrændinger eller kvælning på grund af dette er en reel risiko.
• Dokumenterede tilfælde af krydskontaminering med infektiøse agenser såsom aspergillus, hep B og virusspredning via flydende nitrogenmedium (2,3)
• Potentialet for lækage af flydende nitrogen ind i hætteglassene under nedsænkning i dem. Når nitrogenet tages ud af opbevaring og opvarmes til stuetemperatur, udvider det sig hurtigt. Derfor kan hætteglassene splintres, når de tages ud af opbevaringen af ​​flydende nitrogen, hvilket skaber en fare fra både flyvende genstande og eksponering for indholdet (1, 4).

Af disse grunde foregår opbevaring ved ultralav temperatur oftest i nitrogen i dampfase. Når prøver skal opbevares i flydende fase, bør der anvendes specialiserede kryofleksible slanger.

Ulempen ved dampfasen er, at der kan forekomme en vertikal temperaturgradient, hvilket resulterer i temperaturudsving mellem -135 ℃ og -190 ℃. Dette kræver omhyggelig og omhyggelig overvågning af niveauet af flydende nitrogen og temperaturvariationer (5).

Mange producenter anbefaler, at kryohætteglas er egnede til opbevaring ned til -135 ℃ eller kun til brug i dampfase.

Optøning af dine kryopræserverede celler

Optøningsproceduren er stressende for en frossen kultur, og korrekt håndtering og teknik er nødvendig for at sikre optimal levedygtighed, genopretning og funktionalitet af cellerne. De nøjagtige optøningsprotokoller vil afhænge af specifikke celletyper. Hurtig optøning betragtes dog som standard for at:

• Reducer enhver påvirkning af cellulær genopretning
• Hjælp med at reducere eksponeringstiden for de opløste stoffer, der er til stede i frysemediet
• Minimér eventuelle skader ved isomkrystallisering

Vandbade, perlebade eller specialiserede automatiserede instrumenter bruges almindeligvis til at optø prøver.

Hyppigtst optøs 1 cellelinje ad gangen i 1-2 minutter ved forsigtigt at hvirvle dem rundt i et 37℃ vandbad, indtil der er kun en lille smule is tilbage i hætteglasset, før de vaskes i et forvarmet vækstmedium.

For nogle celler, såsom pattedyrsfostre, er langsom opvarmning afgørende for deres overlevelse.

Cellerne er nu klar til celledyrkning, celleisolering eller, i tilfælde af hæmatopoietiske stamceller, levedygtighedsundersøgelser for at garantere donorstamcellernes integritet før myeloablativ behandling.

Det er normal praksis at tage små alikvoter af den forvaskede prøve, der bruges til at udføre en celletælling, for at bestemme cellekoncentrationer til udpladning i kultur. Du kan derefter vurdere resultaterne af celleisoleringsprocedurerne og bestemme cellernes levedygtighed.

Bedste praksis for opbevaring af kryohætteglas

Den vellykkede kryopræservering af prøver opbevaret i kryohætteglas afhænger af mange elementer i protokollen, herunder korrekt opbevaring og journalføring.

• Opdel celler mellem lagerplaceringer– Hvis volumen tillader det, opdel cellerne mellem hætteglassene og opbevar dem på separate steder for at reducere risikoen for prøvetab på grund af udstyrsfejl.
• Forebyg krydskontaminering– Vælg sterile kryogene hætteglas til engangsbrug eller autoklav inden efterfølgende brug
• Brug hætteglas i den rigtige størrelse til dine celler– Hætteglassene fås i volumener mellem 1 og 5 ml. Undgå at overfylde hætteglassene for at mindske risikoen for revner.
• Vælg kryogeniske hætteglas med indvendig eller udvendig gevind– Nogle universiteter anbefaler hætteglas med indvendig gevind af sikkerhedsmæssige årsager – de kan også forhindre kontaminering under påfyldning eller ved opbevaring i flydende nitrogen.
• Forhindr lækage- Brug dobbeltsprøjtede tætninger støbt ind i skruelåget eller O-ringene for at forhindre lækage og kontaminering.
• Brug 2D-stregkoder og mærk hætteglas– for at sikre sporbarhed gør hætteglas med store skriveflader det muligt at mærke hvert hætteglas tilstrækkeligt. 2D-stregkoder kan hjælpe med opbevaringsstyring og registrering. Farvekodede låg er nyttige for nemmere identifikation.
• Tilstrækkelig vedligeholdelse af opbevaring- For at sikre, at celler ikke går tabt, bør opbevaringsbeholdere konstant overvåge temperaturen og niveauet af flydende nitrogen. Der bør installeres alarmer, der advarer brugerne om fejl.

Sikkerhedsforanstaltninger

Flydende nitrogen er blevet almindelig praksis i moderne forskning, men indebærer risiko for alvorlig skade, hvis det bruges forkert.

Der skal bæres passende personlige værnemidler (PPE) for at minimere risikoen for forfrysninger, forbrændinger og andre uønskede hændelser ved håndtering af flydende nitrogen.

• Kryogene handsker
• Laboratoriekittel
• Slagfast fuld ansigtsskærm, der også dækker halsen
• Lukkede sko
• Stænksikkert plastikforklæde

Køleskabe med flydende nitrogen bør placeres i godt ventilerede områder for at minimere risikoen for kvælning – udslip af nitrogen fordamper og fortrænger atmosfærisk ilt. Store butikker bør have alarmsystemer for lavt iltindhold.

Det er ideelt at arbejde parvis ved håndtering af flydende nitrogen, og brugen af ​​flydende nitrogen uden for normal arbejdstid bør forbydes.

Kryohætteglas til at understøtte din arbejdsgang

Suzhou Ace Biomedical tilbyder et bredt udvalg af produkter, der opfylder dine behov for kryopræservering af forskellige celletyper. Porteføljen omfatter en række rør samt en række sterile kryohætteglas.

Vores kryohætteglas er:

• Lab-skruelåg 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kryohætteglas kryogeniske hætteglas konisk bund kryorør med pakning

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml specifikation, med skørt eller uden skørt
  ● Konisk eller selvstående design, sterilt eller ikke-sterilt er begge tilgængelige
  ● Skruelågsrør er lavet af medicinsk polypropylen
  ● PP-kryorørflasker kan fryses og optøs gentagne gange
  ● Det udvendige hættedesign kan reducere sandsynligheden for kontaminering under prøvebehandling.
  ● Kryogenrør med skruelåg Universal gevind til brug
  ● Rør passer til de fleste almindelige rotorer
  ● Kryogene o-ringslanger passer til standard 1-tommer og 2-tommer, 48-brønds, 81-brønds, 96-brønds og 100-brønds frysebokse
  ● Autoklaverbar til 121 °C og frysbar til -86 °C

  DEL NR.	MATERIALE	BIND	KASKETFARVE	PCS/TASKE	TASKER/ETUER
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Sort, gul, blå, rød, lilla, hvid	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Sort, gul, blå, rød, lilla, hvid	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Sort, gul, blå, rød, lilla, hvid	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Sort, gul, blå, rød, lilla, hvid	500	10