Kryoflaskoranvänds vanligtvis för kryogen lagring av cellinjer och andra kritiska biologiska material, i Dewar-kärl fyllda med flytande kväve.

Det finns flera steg involverade i framgångsrik konservering av celler i flytande kväve. Medan grundprincipen är långsam frysning, beror den exakta tekniken som används på celltyp och kryoskyddsmedel. Det finns flera säkerhetsaspekter och bästa praxis att ta hänsyn till vid förvaring av celler vid så låga temperaturer.

Det här inlägget syftar till att ge en översikt över hur kryoflaskor förvaras i flytande kväve.

Vad är kryoflaskor

Kryokärl är små, förseglade kärl utformade för att förvara flytande prover vid extremt låga temperaturer. De säkerställer att celler som konserverats i kryoskyddsmedel inte kommer i direkt kontakt med flytande kväve, vilket minimerar risken för cellfrakturer samtidigt som de drar nytta av den extrema kyleffekten av flytande kväve.

Flaskorna finns vanligtvis i en mängd olika volymer och utföranden – de kan vara invändigt eller utvändigt gängade med platta eller rundade botten. Sterila och icke-sterila format finns också tillgängliga.

Vem använderCyrovialeratt förvara celler i flytande kväve

En rad NHS- och privata laboratorier, såväl som forskningsinstitutioner som specialiserar sig på navelsträngsblodsbanker, epitelcellsbiologi, immunologi och stamcellsbiologi, använder kryoflaskor för att kryokonservera celler.

Celler som bevaras på detta sätt inkluderar B- och T-celler, CHO-celler, hematopoetiska stam- och progenitorceller, hybridom, tarmceller, makrofager, mesenkymala stam- och progenitorceller, monocyter, myelom, NK-celler och pluripotenta stamceller.

Översikt över hur man förvarar kryoflaskor i flytande kväve

Kryokonservering är en process som bevarar celler och andra biologiska konstruktioner genom att kyla dem till mycket låga temperaturer. Celler kan lagras i flytande kväve i åratal utan att förlora cellviabilitet. Detta är en översikt över de procedurer som används.

Cellpreparering

Den exakta metoden för att framställa prover varierar beroende på celltyp, men i allmänhet samlas cellerna in och centrifugeras för att utveckla en cellrik pellet. Denna pellet resuspenderas sedan i supernatanten blandad med kryoskyddsmedel eller ett kryokonserveringsmedium.

Kryokonserveringsmedium

Detta medium används för att bevara celler i de lågtemperaturmiljöer de utsätts för genom att hämma bildandet av intra- och extracellulära kristaller och därmed celldöd. Deras roll är att tillhandahålla en säker och skyddande miljö för celler och vävnader under frysnings-, lagrings- och upptiningsprocesserna.

Ett medium såsom färskfryst plasma (FFP), heparinierad plasmalytlösning eller serumfria lösningar utan animaliska komponenter blandas med kryoskyddsmedel såsom dimetylsulfoxid (DMSO) eller glycerol.

Den återflytande provpelleten alikvoteras i polypropenkryoflaskor såsomSuzhou Ace Biomedical Company Kryogena förvaringsflaskor.

Det är viktigt att inte överfylla kryoflaskorna eftersom det ökar risken för sprickbildning och eventuellt utsläpp av innehåll (1).

Kontrollerad fryshastighet

I allmänhet används en långsam kontrollerad fryshastighet för framgångsrik kryokonservering av celler.

Efter att proverna har fördelats i kryogena flaskor placeras de på våt is eller i ett kylskåp vid 4 °C och frysningsproceduren påbörjas inom 5 minuter. Som en allmän riktlinje kyls cellerna med en hastighet av -1 till -3 per minut (2). Detta uppnås med hjälp av en programmerbar kylare eller genom att placera flaskorna i en isolerad låda placerad i en frys med kontrollerad hastighet från -70 °C till -90 °C.

Överföring till flytande kväve

De frysta kryogena flaskorna överförs sedan till en tank med flytande kväve under obestämda perioder, förutsatt att en temperatur på mindre än -135 ℃ bibehålls.

Dessa ultralåga temperaturer kan erhållas genom nedsänkning i flytande eller ångfas av kväve.

Flytande eller ångfas?

Lagring i flytande kvävefas är känt för att bibehålla den kalla temperaturen med absolut jämnhet, men rekommenderas ofta inte av följande skäl:

• Behovet av stora volymer (djupgående) flytande kväve är en potentiell fara. Brännskador eller kvävning på grund av detta är en verklig risk.
• Dokumenterade fall av korskontaminering med smittämnen som aspergillus, hep B och virusspridning via flytande kväve (2,3)
• Risken för att flytande kväve läcker in i flaskorna under nedsänkning. När kvävet tas ut ur förvaring och värms upp till rumstemperatur expanderar det snabbt. Följaktligen kan flaskan splittras när den tas ut ur förvaringen av flytande kväve, vilket skapar en risk för både flygande skräp och exponering för innehållet (1, 4).

Av dessa skäl sker lagring vid ultralåg temperatur oftast i kväve i ångfas. När prover måste förvaras i flytande fas bör specialiserade kryoflexslangar användas.

Nackdelen med ångfasen är att en vertikal temperaturgradient kan uppstå vilket resulterar i temperaturfluktuationer mellan -135 ℃ och -190 ℃. Detta kräver noggrann och noggrann övervakning av nivåerna av flytande kväve och temperaturvariationer (5).

Många tillverkare rekommenderar att kryoflaskor är lämpliga för förvaring ner till -135 ℃ eller endast för användning i ångfas.

Upptining av dina kryokonserverade celler

Upptiningsproceduren är stressig för en fryst kultur, och korrekt hantering och teknik krävs för att säkerställa optimal livskraft, återhämtning och funktionalitet hos cellerna. De exakta upptiningsprotokollen beror på specifika celltyper. Snabb upptining anses dock vara standard för att:

• Minska eventuell påverkan på cellulär återhämtning
• Hjälper till att minska exponeringstiden för de lösta ämnena som finns i frysmediet
• Minimera eventuella skador genom isåterkristallisering

Vattenbad, pärlbad eller specialiserade automatiserade instrument används ofta för att tina prover.

Vanligtvis tinas en cellinje åt gången i 1–2 minuter, genom att försiktigt virvla runt dem i ett 37℃ vattenbad tills det finns bara en liten mängd is kvar i flaskan innan de tvättas i ett förvärmt tillväxtmedium.

För vissa celler, såsom däggdjursembryon, är långsam uppvärmning avgörande för deras överlevnad.

Cellerna är nu redo för cellodling, cellisolering eller, när det gäller hematopoetiska stamceller, viabilitetsstudier för att garantera donatorstamcellernas integritet före myeloablativ behandling.

Det är normal praxis att ta små alikvoter av det förtvättade provet som används för att utföra en cellräkning för att bestämma cellkoncentrationer för utplattning i kultur. Du kan sedan bedöma resultaten av cellisoleringsprocedurerna och bestämma cellernas viabilitet.

Bästa praxis för förvaring av kryoflaskor

En lyckad kryokonservering av prover som lagras i kryoflaskor beror på många element i protokollet, inklusive korrekt förvaring och journalföring.

• Dela celler mellan lagringsplatser– Om volymerna tillåter, dela cellerna mellan ampullerna och förvara dem på separata platser för att minska risken för provförlust på grund av utrustningsfel.
• Förhindra korskontaminering– Välj sterila kryogena engångsflaskor eller autoklav före efterföljande användning
• Använd lämpligt stora flaskor för dina celler– injektionsflaskorna finns i volymer mellan 1 och 5 ml. Undvik att överfylla injektionsflaskorna för att minska risken för sprickbildning.
• Välj invändigt eller utvändigt gängade kryogena flaskor– Invändigt gängade flaskor rekommenderas av vissa universitet av säkerhetsskäl – de kan också förhindra kontaminering under fyllning eller vid förvaring i flytande kväve.
• Förhindra läckage- Använd dubbelinjicerade tätningar gjutna i skruvlocket eller O-ringarna för att förhindra läckage och kontaminering.
• Använd 2D-streckkoder och märk flaskor– för att säkerställa spårbarhet möjliggör flaskor med stora skrivytor att varje flaska kan märkas på ett adekvat sätt. 2D-streckkoder kan underlätta lagringshantering och dokumentation. Färgkodade korkar är användbara för enklare identifiering.
• Tillräckligt underhåll av förvaring- För att säkerställa att celler inte går förlorade bör lagringskärl ständigt övervaka temperaturen och nivåerna av flytande kväve. Larm bör installeras för att varna användare om fel.

Säkerhetsåtgärder

Flytande kväve har blivit vanlig praxis inom modern forskning men medför risk för allvarliga skador om det används felaktigt.

Lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) bör bäras för att minimera risken för frostskador, brännskador och andra negativa händelser vid hantering av flytande kväve.

• Kryogena handskar
• Laboratorierock
• Slagtåligt helmaskskydd som även täcker halsen
• Slutna skor
• Stänkskyddande plastförkläde

Kylskåp med flytande kväve bör placeras i välventilerade utrymmen för att minimera risken för kvävning – utströmmande kväve förångas och tränger undan luftens syre. Stora butiker bör ha larmsystem för låg syrehalt.

Att arbeta parvis vid hantering av flytande kväve är idealiskt och dess användning utanför normal arbetstid bör förbjudas.

Kryoflaskor som stödjer ditt arbetsflöde

Suzhou Ace Biomedical erbjuder ett brett utbud av produkter som uppfyller dina behov av kryokonservering för olika typer av celler. Portföljen inkluderar ett sortiment av rör samt ett sortiment av sterila kryoflaskor.

Våra kryoflaskor är:

• Labskruvkork 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kryovial Kryogena ampuller Konisk botten kryorör med packning

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml specifikation, med kjol eller utan kjol
  ● Konisk eller fristående design, steril eller icke-steril finns tillgängliga
  ● Skruvkorkrören är tillverkade av medicinsk polypropen
  ● PP-kryorörflaskor kan frysas och tinas upprepade gånger
  ● Den externa lockkonstruktionen kan minska sannolikheten för kontaminering under provbehandling.
  ● Skruvkork för kryogena rör Universella gängor för användning
  ● Rör passar de flesta vanliga rotorer
  ● Kryogena rör med o-ring passar till standard 1-tums och 2-tums, 48-brunns, 81-brunns, 96-brunns och 100-brunns frysboxar
  ● Autoklaverbar till 121 °C och frysbar till -86 °C

  ARTIKELNUMMER	MATERIAL	VOLYM	LOCKFÄRG	PCS/VÄSKA	VÄSKOR/FODRAL
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Svart, gul, blå, röd, lila, vit	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Svart, gul, blå, röd, lila, vit	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Svart, gul, blå, röd, lila, vit	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Svart, gul, blå, röd, lila, vit	500	10