Hatur nuhun tos nganjang ka Nature.com.Vérsi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan kawates pikeun CSS. Kanggo pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi mareuman modeu kasaluyuan dina Internet Explorer).Samentawis éta, pikeun mastikeun rojongan terus, urang bakal nembongkeun situs tanpa gaya na JavaScript.
Pentingna ngawaskeun conto lingkungan parantos diapresiasi pisan ti mimiti pandémik COVID-19, sareng sababaraha usaha ngawaskeun dilaksanakeun nganggo standar emas, sanaos téknik dumasar qPCR mahal. Solusi pikeun ngawaskeun conto cai lingkungan di nagara-nagara berpendapatan rendah sareng sedeng. Dina karya ieu, urang nunjukkeun deteksi éléktrokimia amplikon anu dicandak tina Phi6 phage anu diisolasi tina conto cai danau spiked (pangganti populér pikeun SARS-CoV-2), nganggo ENIG pikeun ngalengkepan éléktroda PCB tanpa modifikasi permukaan.kelamin. Réspon sénsor éléktrokimia dicirian sacara saksama pikeun dua fragmen DNA anu panjangna béda (\({117}\,\hbox {bp}\) jeung \({503}\,\hbox {bp}\)), jeung pangaruh uyah dina PCR master mixes on métilén bulao (MB) -DNA interaksi.Hasil kami némbongkeun yén panjang fragmen DNA nyata nangtukeun sensitipitas éléktrokimia sarta demonstrate dina karya ieu yén kamampuhan pikeun ngadeteksi amplicons panjang tanpa purifikasi gél produk PCR nyaeta penting pikeun pangukuran in situ sampel cai.Solusi pinuh otomatis pikeun viral load bodes ogé.
Panyebaran virus waterborne geus dipikawanoh salaku bahya kaséhatan masarakat saprak 1940s, kalawan bukti mimiti transmisi waterborne polio jeung hépatitis E1. The World Health Organization (WHO) geus digolongkeun sababaraha patogén viral waterborne tina sedeng nepi ka luhur significance kaséhatan 2. Traditional virus métode deteksi ngandelkeun téhnik basis qPCR emas-baku, nu kacida sénsitip sarta husus, tapi merlukeun tanaga terampil pikeun nguji di laboratorium ngagunakeun instrumen mahal. Tapi, di nagara-nagara berpendapatan rendah jeung tengah (LMICs) kalawan sumberdaya kawates, manusa. nguji sampel kamungkinan bakal nyokot precedence leuwih lingkungan sampel cai monitoring.Ku alatan éta, métode béaya rendah alternatif anu diperlukeun pikeun sustainable, real-time ngawaskeun sampel cai jeung wastewater di nagara-panghasilan low- jeung tengah salaku warnings awal wabah panyakit munculna, Ku kituna ngajagi aranjeunna tina dampak sosial ékonomi parna tina pandémik virus.Biosensor éléktrokimia béaya rendah pikeun asam nukléat tiasa nyayogikeun solusi poténsial pikeun kabutuhan anu teu kacumponan ieu. permukaan jeung hibridisasi nalika runtuyan cocog aya dina sampel. Ieu lajeng bisa dirobah jadi sinyal ku rupa téhnik éléktrokimia ngagunakeun mediator rédoks kayaning beusi kalium / ferrocyanide. Métiléna biru (MB) mangrupa salah sahiji molekul rédoks-aktif misalna, nu boga geus dilaporkeun interkalate kana DNA untai ganda (dsDNA) salian ti beungkeutan leuwih nonspecific na ka single-stranded DNA5,6. Sifat interkalating MB pikeun ngabentuk kompléx MB-DNA ngajadikeun aranjeunna pilihan populér salaku mediator rédoks dina sababaraha DNA éléktrokimia. konfigurasi sensor5,6,7,8,9. Sanajan intercalation of MB kana DNA nyaeta nonspecific, sarta spésifisitas sensor éléktrokimia ieu gumantung sakitu legana dina purity tina primers dipaké pikeun PCR atawa amplifikasi isothermal, éta ogé cocog pikeun ngalaksanakeun nyata. -waktu qPCR basis éléktrokimia atawa fluoresensi isothermal amplifikasi salaku alternatif pikeun pangukuran konsentrasi DNA 9 .Dina hiji palaksanaan misalna, Won et al. Beungeut éléktroda emas ieu dirobah kalawan 6-mercapto-1-hexanol (MCH) pikeun real-time pangukuran amplikon PCR kalawan MB ngagunakeun diferensial pulsa voltammetry (DPV)9.Dina kasus séjén, Ramirez dkk.Deteksi SARS-CoV-2 dina cai limbah ku RT-LAMP réaksi maké MB kalawan éléktroda dicitak layar. Éléktroda platinum ogé geus dipaké salaku éléktroda di situ dina platform PCR microfluidic dirancang electrochemically ngadeteksi amplicons salila réaksi 8 .Sadaya studi ieu merlukeun modifikasi permukaan éléktroda, implying ngaronjat produksi jeung biaya operasi alatan sarat gudang husus pikeun stabilitas éléktroda functionalized ieu.
Skéma tina alur kerja pikeun deteksi éléktrokimia tina amplikon anu dicandak tina partikel virus kentel dina conto cai danau.
Kami nembe nunjukkeun sensing éléktrokimia tina amplikon SARS-CoV-2 kalayan éléktroda papan sirkuit dicitak (PCB) béaya rendah dumasar kana DPV sareng voltammétri siklik (CV) ngainduksi ku adsorpsi kompléx MB-DNA dina permukaan éléktroda anu teu dirobih) parobahan dina puncak. ayeuna11.Kami ngalaporkeun yén fragmen DNA anu langkung panjang (N1-N2, \({943}\, \hbox) kabentuk nganggo N1 anu disarankeun CDC maju sareng primer ngabalikkeun N2 dibandingkeun sareng fragmen anu langkung pondok {bp}\)) nunjukkeun linearitas anu langkung saé dina réspon sénsor. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) kabentuk maké N1 maju jeung N1 reverse primer sets.Studi ieu dilaporkeun ngagunakeun éncér DNA disiapkeun dina cai nuclease-gratis. Platform ieu ogé dipaké pikeun ngadeteksi SARS-CoV. -2 amplicons dina sampel cai limbah simulasi (diala ku spiking total sampel RNA jeung SARS-CoV-2 RNA). Kusabab RNA rentan ka shearing salila isolasi jeung processing hilir, 12,13 hese ngagedekeun fragmen leuwih panjang kalayan sampel hétérogén ieu. Ku alatan éta, démo éléktrokimia sensing of SARS-CoV-2 amplicon dina cai limbah diwatesan kana pondok \(72\,\hbox {bp}\) fragmen N1.
Dina karya ieu, urang nalungtik feasibility of ENIG PCB basis éléktrokimia sensing of phage Phi6 kentel tur diisolasi tina sampel cai danau (Gbr. 1). Phi6 phages anu comparable dina ukuran (80-100 nm) jeung SARS-CoV-2 jeung ogé mibanda mémbran lipid jeung protéin spike.Ku sabab kitu, bacteriophage Phi6 mangrupakeun surrogate populér pikeun SARS-CoV-2 jeung virus RNA patogén enveloped séjén14,15.RNA diisolasi tina partikel fag dipaké salaku citakan pikeun sintésis cDNA dituturkeun ku PCR pikeun meunangkeun dua fragmen DNA tina 117 jeung 503 pasangan basa panjangna. Dibikeun tantangan amplifying \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 fragmen dina karya urang saméméhna, urang sasaran fragmen panjang panengah (\(117). \,\hbox {bp}\) jeung \(503 \,\hbox {bp}\)), dumasar kana primers sadia. Réspon sénsor éléktrokimia sacara sistematis ditalungtik dina rentang konsentrasi anu lega (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) ka \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Pikeun duanana fragmen dina ayana MB, pangaruh uyah dina réspon sensor geus dicirikeun sarta cross-validated ku ukuran spectrophotometric. Kontribusi utama karya ieu nyaéta kieu:
Panjang fragmen DNA sareng ayana uyah dina sampel mangaruhan pisan sensitipitas.Hasilna nunjukkeun yén kagiatan éléktrokimia gumantung kana mékanisme béda tina interaksi MB, DNA, sareng sénsor dina réspon voltammétri, gumantung kana konsentrasi sareng panjang DNA, sareng Fragmen anu langkung panjang nunjukkeun sensitipitas anu langkung luhur, sanaos uyah gaduh pangaruh négatip kana interaksi éléktrostatik antara. MB jeung DNA.
Konsentrasi DNA nangtukeun mékanisme interaksi MB-DNA dina éléktroda unmodified. {l}}}\), kami niténan yén réspon arus éléktrokimia utamana ditangtukeun ku adsorpsi MB-DNA dina éléktroda, sedengkeun dina konsentrasi handap Dina konsentrasi DNA anu luhur, réspon arus éléktrokimia ditangtukeun ku inhibisi sterik rédoks. aktivitas alatan sisipan MB antara pasangan basa DNA.
ENIG PCB-Based Éléktrokimia Sensing Asam Nukléat Viral dina Sampel Cai Tasik Observasi ieu disahkeun ku deteksi éléktrokimia tina Phi6-ditambahkeun \(503\,\hbox {bp}\) fragmen DNA dicandak tina sampel cai ti Tasik Powai, Kampus IIT Sukabumi. Hasil phage.
Biaya palaksanaan anu murah sareng poténsial pikeun integrasi kana sistem ngawaskeun otomatis pinuh, oligonukleotida atanapi aptamer dina éléktroda anu umurna langkung panjang.
Phage Phi6 nyaéta virus dsRNA enveloped tina kulawarga Cytoviridae anu nginféksi Pseudomonas syringae. Génom Phi6 phage aya dina bentuk 3 fragmen: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07). \,\hbox {Kb}\)) jeung L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\)) 16,17. Kusabab Phi6 phage nginféksi galur Pseudomonas BSL-1 non-patogenik, éta aman dipaké. sarta bisa gampang tumuwuh di laboratorium.Phage Phi6 jeung host na Pseudomonas syringae dibeuli ti Felix d'Herelle Reference Center pikeun Virus Baktéri, Laval University, Kanada (nomer katalog puseur rujukan nyaéta HER-102 jeung HER-1102, mungguh) .Phi6 phage jeung host na anu revived sakumaha diarahkeun ku puseur rujukan.Phage Phi6 ieu dimurnikeun ku lysis pelat jeung élusi pikeun ménta titers final kalawan \ (\ ngeunaan 10 ^ {12} \, {\ hbox {PFU} / \ hbox { ml}}\) (unit pembentuk plak/ mililiter).RNA diisolasi tina partikel fag anu dimurnikeun ngagunakeun Kit Pemurnian RNA Total GenElute™ Universal (Sigma-Aldrich) nurutkeun parentah produsén. 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) dilisiskeun sarta lisat dimuat kana kolom spin pikeun ngidinan RNA ngabeungkeut kolom résin .RNA tuluy diélusi dina larutan élusi \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) disadiakeun ku kit.Estimasi konsentrasi RNA ku absorbance dina \(260\,\hbox {nm}\).RNA disimpen dina aliquots dina \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) dugi ka dianggo salajengna.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Kit Sintésis cDNA iScript (Bio -Rad Laboratories) dipaké salaku citakan pikeun sintésis cDNA nuturkeun parentah produsén urang. Sakeudeung, réaksi sintésis cDNA diwangun ku 3 léngkah: priming di \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\), transkripsi balikan \({20}\,{\hbox {min}}\) di \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), jeung sabalikna Recorder aya dina \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) pikeun \({1}\,{\hbox {min }}\).Nalika dijalankeun dina gél agarose 1%, cDNA némbongkeun tilu pita pakait jeung ekspektasi tilu fragmen RNA (data teu ditémbongkeun). Primer handap ieu dipaké pikeun ngagedékeun dua fragmen DNA tina 117 jeung 503 bp panjangna, ngagunakeun cDNA salaku témplat pikeun PCR dina siklus termal miniPCR® mini8:
Primer pikeun \(117\,\hbox {bp}\) jeung \(503\,\hbox {bp}\) pakait jeung 1476-1575 nukléotida bagéan M jeung 458-943 nukléotida tina ruas L, masing-masing asam. .Sadaya produk PCR amplified anu electrophoresed on 1% gels agarose, sarta DNA target amplified ieu dimurnikeun maké GeneJET gél ékstraksi Kit (Thermo Fisher ilmiah).
Hiji danau di kampus IIT Sukabumi (Powai Lake, Powai, Sukabumi) dipaké pikeun nambahkeun partikel fag. Cai situ disaring ngaliwatan mémbran \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) pikeun miceun partikel ditunda, lajeng Phi6 phage ditambahkeun.Tambahkeun \({1}\,{\hbox {ml}}\) tina \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) ka \({100}\ ,{\hbox {ml}}\) cai situ disaring, dina \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).A aliquot leutik éta Ditangtayungan pikeun pangukuran viral load ku assay plak. Urang nguji dua métode béda pikeun konsentrasi spiked partikel virus Phi6: (1) metoda adsorpsi-présipitasi aluminium hidroksida,19 nu geus disahkeun pikeun konsentrasi sababaraha virus RNA enveloped tina sampel lingkungan, jeung (2) ) Metode konsentrasi virus dumasar poliétilén glikol (PEG) diadaptasi tina Banjir et al.20 .Kusabab efisiensi recovery sahiji metodeu basis PEG kapanggih leuwih hade tinimbang metoda aluminium hidroksida, metoda basis PEG ieu dipaké pikeun konsentrasi partikel Phi6 ti sampel cai danau.
Metodeu PEG anu digunakeun nyaéta kieu: PEG 8000 sareng \(\hbox {NaCl}\) ditambahkeun kana sampel cai danau Phi6-spiked pikeun meunangkeun 8 % PEG 8000 sareng \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Sampel diinkubasi dina shaker\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), tuluy disentrifugasi dina \(4700 \,\hbox {g}\) nyaéta \({45}\,{\hbox {min}}\).Buang supernatan jeung ditunda deui pellet dina \({1}\, {\hbox {ml}}\) dina supernatant sarua.Sakabeh percobaan spiking jeung konsentrasi virus anu dipigawé dina triplicate.After konsentrasi, a aliquot leutik ieu ditangtayungan pikeun pangukuran efisiensi recovery ku assay plak.RNA ieu diisolasi sakumaha ditétélakeun saméméhna tur eluted. dina panyangga élusi anu disayogikeun kit\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).Kusabab konsentrasi RNA bakal rupa-rupa ti sampel ka sampel dina rangkep tilu, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) tina RNA dipaké pikeun sakabéh tilu paduli konsentrasi na sintésis cDNA sampel.sintésis cDNA dipigawé sakumaha ditétélakeun saméméhna.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA dipaké salaku citakan pikeun \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR pikeun 35 siklus pikeun ngagedékeun \ (117\,\hbox {bp}\) jeung \(503\,\hbox { bp}\) fragmen. Sampel ieu digambarkeun salaku "1: 1", nyaéta tanpa éncér. A kontrol no-template (NTC) diatur salaku kontrol négatip, sedengkeun cDNA disintésis maké RNA diisolasi tina fag dimurnikeun diatur. salaku témplat pikeun kontrol positif (PC). PCR kuantitatif (qPCR) ieu dipigawé dina instrumen Stratagene Mx3000P RT-PCR maké Brilliant III Ultra-Fast SYBR Héjo QPCR Master Campur (Agilent Technologies). Réaksi anu nyetél dina triplicate sakumaha saméméhna. Dijelaskeun.Bambang siklus (Ct) dirékam pikeun sakabéh sampel. Sajaba ti éta, sampel éncér éta \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) ngagunakeun cDNA éncér 1:100 dina cai situ disaring salaku \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR pikeun 35 siklus. Sampel ieu digambarkeun salaku "1:100″.
The éléktroda PCB anu fabricated maké béaya rendah sadia komersil Electroless nikel Immersion Emas (ENIG) prosés tanpa merlukeun plating emas tambahan. ENIG PCB spésifikasi éléktroda diwincik dina work11.For éléktroda ENIG PCB kami saméméhna, métode beberesih éléktroda tradisional kayaning. Solusi piranha atanapi voltammétri siklik asam sulfat henteu disarankeun sabab tiasa nyababkeun kulit lapisan emas ipis (ketebalan \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) sareng ngalaan lapisan tambaga anu aya dina dasarna. nepi ka korosi 21, 22, 23, 24, 25. Ku kituna, bersihkeun éléktroda ku lawon bébas lint dibasahi ku IPA. }\) MB dina \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({1}\,{\hbox {h}}\) pikeun gampang diselapkeun.Dina karya urang saméméhna , urang katalungtik yén sensitipitas jeung linearity sensor anu ningkat ku ngaronjatna konsentrasi MB 11 .Dumasar optimizations dilaporkeun dina karya urang saméméhna, kami dipaké \ ({50} \, {\ upmu \ hbox {M}} \) MB Konséntrasi pikeun nyelapkeun DNA dina ulikan ieu.Detéksi éléktrokimia DNA untai ganda (ds-DNA) bisa dihontal ngagunakeun interkalator anionik atawa kationik.Sanajan interkalator anionik ngadeteksi DNA kalawan selektivitas anu leuwih hadé, maranéhna merlukeun inkubasi sapeuting, hasilna waktu deteksi leuwih panjang. sisi séjén, intercalators kationik kayaning MB merlukeun waktu inkubasi pondok, kurang leuwih \({1}\,{\ hbox {h}}\) pikeun deteksi éléktrokimia ds-DNA6. Unggal pangukuran ngawengku dispensing sampel pikeun diuji dina éléktroda\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), tuluy beberesih ku lawon nu dibasahi IPA, saencan neruskeun sampel nu séjén.hiji measurement.Each sampel ieu diuji dina 5 éléktroda béda iwal disebutkeun béda. Pangukuran DPV jeung CV anu dipigawé maké PalmSens Sensit Smart potentiostat, jeung software PSTrace dipaké pikeun konfigurasi potentiostat jeung akuisisi data, kaasup kalkulasi ayeuna puncak.Setélan handap dipaké. pikeun pangukuran DPV sareng CV:
DPV: Waktu Kasaimbangan = \(8\,\hbox {s}\), Lengkah Tegangan = \(3\,\hbox {mV}\), Tegangan Pulsa = \(25\,\hbox {mV}\), durasi pulsa = \(50\,\hbox {ms}\), laju scan = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Waktu Kasaimbangan = \(8\,\hbox {s}\), Lengkah Tegangan = \(3\,\hbox {mV}\), Laju Sapuan = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
Arus puncak dicandak tina voltammograms DNA dikomplekskeun sareng \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Voltammogram DPV sareng CV dicandak dina éléktroda ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB complexed kalawan DNA (dina konsentrasi 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) nyaéta 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) pikeun \(117\,\hbox {bp}\) jeung 0.03 -\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) pikeun \(503\,\hbox {bp}\)).Voltammograms wawakil ditémbongkeun dina Gambar S1 dina Émbaran Suplemén.Gambar 2 nembongkeun hasil Pangukuran DPV sareng CV (arus puncak) nganggo produk PCR anu dimurnikeun gél. Dibandingkeun sareng pangukuran CV, pangukuran DPV nunjukkeun sensitipitas anu langkung luhur (ayeuna salaku fungsi konsentrasi DNA) kusabab latar tukang arus kapasitif dina ukuran CV nyumputkeun arus Faradaic 26 .Data Pikeun unggal kotak dina boxplot ngandung pangukuran tina 5 éléktroda. Sadaya pangukuran nganggo set éléktroda anu sami pikeun ngahindarkeun kasalahan pangukuran kusabab variasi éléktroda-ka-éléktroda. Urang niténan tren anu ningkat dina DPV sareng CV diukur arus puncak pikeun konsentrasi DNA anu handap. , panjang (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ dibandingkeun jeung \(117) ) fragment.This konsisten jeung trend ekspektasi adsorption éléktroda dilaporkeun dina work.The urang saméméhna adsorption tina kompléks MB-DNA facilitates mindahkeun muatan dina éléktroda, nu nyumbang kana kanaékan arus puncak.Ulikan lianna geus ditémbongkeun pangaruh ukuran oligonucleotide jeung runtuyan on MB-DNA intercalation27,28,29,30. The guanin -cytosine (GC) eusi dua amplicons (\(117\,\hbox {bp}\) jeung \(503\,\hbox {bp}\)) kira-kira 50%, nunjukkeun yén observasi bédana alatan mun panjang amplicon. Tapi, pikeun konsentrasi DNA nu leuwih luhur (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), pikeun \(503\,\hbox {bp} \) jeung \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) pikeun \(117\,\hbox {bp}\)), urang niténan dua amplifikasi The arus puncak subs diréduksi dina duanana DPV na CV measurements.This sabab MB saturates na intercalates antara pasangan basa DNA, hasilna inhibisi steric tina aktivitas rédoks sahiji grup reducible di MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Uyah anu aya dina campuran master PCR ngaganggu interaksi éléktrostatik antara MB sareng DNA, janten ku nambihan \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) sareng \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB produk dimurnikeun gél pikeun diajar pangaruh uyah dina interaksi MB-DNA.Sakumaha ditémbongkeun dina Gambar 3, urang niténan yén pikeun konsentrasi DNA nu leuwih luhur (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) jeung \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}} \) pikeun \ (117 \, \ hbox {bp} \)), dina DPV sareng CV Penambahan uyah henteu mangaruhan sacara signifikan kana pangukuran (tingali Gambar S2 dina Émbaran Suplemén pikeun voltammograms perwakilan). konsentrasi DNA handap, tambahan uyah greatly ngurangan sensitipitas, hasilna euweuh parobahan signifikan dina arus jeung DNA concentration.Epék négatip sarupa uyah on interaksi MB-DNA sarta intercalation geus saméméhna dilaporkeun ku peneliti séjén33,34.\(\hbox { Kation Mg}^{2+}\) ngiket kana tulang tonggong fosfat négatif DNA, ku kituna ngahalangan interaksi éléktrostatik antara MB jeung DNA. Dina konsentrasi DNA nu leuwih luhur, inhibisi stérik MBs rédoks-aktip ngahasilkeun arus puncak nu leuwih handap, jadi interaksi éléktrostatik. henteu mangaruhan sacara signifikan réspon sénsor. Titik konci nyaéta yén biosensor ieu langkung cocog pikeun ngadeteksi konsentrasi DNA anu langkung luhur (jarang \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) atanapi langkung luhur), pikeun pinuh- Otomatis ngolah sampel cai lingkungan, dimana purifikasi gél produk PCR bisa jadi teu meujeuhna.
Wewengkon handapeun kurva serapan pikeun rentang panjang gelombang 600–700 \(\hbox {nm}\) pikeun rupa-rupa konsentrasi DNA dikomplekskeun jeung \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) kalawan jeung tanpa uyah (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) kalawan jeung tanpa uyah (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Konséntrasi DNA pakait jeung \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) sampel MB No DNA.
Pikeun pariksa deui hasil di luhur, urang ngalakukeun pangukuran optik nganggo spéktrofotométer UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), sampel \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) digunakeun pikeun tiap Measurement.The signature serepan nurun kalawan ngaronjatna konsentrasi DNA, sakumaha bisa ditempo ti trend wewengkon handapeun kurva serapan pikeun rentang panjang gelombang \(600\,\hbox {nm}\) ka \(700\,\hbox { nm}\), sakumaha ditémbongkeun dina Gbr. 4 (spéktrum nyerep ditémbongkeun dina Gbr. S3 dina Émbaran Suplemén).Pikeun sampel kalawan konsentrasi DNA kirang ti \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), teu aya béda anu signifikan dina uptake antara sampel nu ngandung DNA jeung MB wungkul (pikeun \(503\,\hbox {bp}\) jeung \(117\,\hbox {bp}\ ) fragmen panjang), nunjukkeun henteuna inhibisi steric MB rédoks-aktif. Dina konsentrasi DNA anu langkung luhur, urang ningali panurunan bertahap dina sinyal nyerep sareng nyatet panurunan anu langkung handap dina nyerep ku ayana uyah. interaksi jeung inhibisi steric kalawan base stacking dina DNA hybrids.Hasil kami konsisten jeung laporan dina literatur ngeunaan studi spéktroskopi of MB-DNA intercalation nu pakait hypochromaticity jeung ngurangan tingkat énergi dina \(\pi\)-\(\pi ^*\ ) transisi éléktronik alatan interkalasi Lapisan 36, 37, 38.
Éléktroforésis gél agarose Phi6: produk PCR panjangna \(117\,\hbox {bp}\) jeung \(503\,\hbox {bp}\) tina sampel cai danau.M-DNA marker;kontrol NTC-no-témplat, primers ngandung amplicons pakait;PC kontrol positif;1, 2, 3-undiluted (1: 1) spiked sampel cai danau dina triplicate.A band katempo dina \(\ kira-kira 50 \,\ hbox {bp}\) alatan oligonucleotides henteu dipaké dina \(503\,\ hbox {bp}\) jalur.
Urang dievaluasi utilitas sensor ngagunakeun sampel cai Powai Lake spiked kalawan Phi6 phage.The konsentrasi RNA diisolasi tina sampel cai phage-spiked ranged ti 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), sedengkeun anu diisolasi tina suspénsi fag anu dimurnikeun RNA diperkirakeun \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) kalayan efisiensi pamulihan kirang langkung 1 %.RNA ditranskripsi balik kana cDNA sarta dipaké salaku citakan pikeun PCR jeung qPCR. Ukuran produk dikonfirmasi ku éléktroforésis gél agarose (Gambar 5) saméméh nguji jeung sensor. Sampel ieu teu gél dimurnikeun sahingga ngandung sakabéh komponén PCR salaku ogé amplicons of interest.Nilai Ct dirékam salila qPCR (Table 1) ditémbongkeun pakait jeung konsentrasi RNA diisolasi tina sampel cai spiked pakait. Nilai Ct nembongkeun jumlah siklus diperlukeun pikeun sinyal fluoresensi ngaleuwihan ambang atawa sinyal latar tukang.Nilai Ct luhur nunjukkeun konsentrasi citakan handap sarta sabalikna.Nilai Ct sampel NTC saluhur ekspektasi.Beda dina \(\kira-kira 3\) nilai Ct antara kontrol positif jeung sampel test salajengna nunjukkeun yén unggal sampel test boga kira 1% template dibandingkeun jeung kontrol positif. Kami saméméhna geus ngabahas yén amplicons panjang ngakibatkeun sensitipitas hadé. Amplifikasi fragmen panjang terasing tina sampel lingkungan hétérogén téh nangtang tinangtu kalemahan. Konsentrasi virus anu rendah sareng degradasi RNA. Nanging, kalayan pengayaan virus sareng protokol amplifikasi PCR, kami tiasa suksés ngagedékeun fragmen \(503\,\hbox {bp}\) pikeun sensing éléktrokimia.
Gambar 6 nembongkeun hasil sénsor éléktrokimia tina amplicon fragmén \(503\,\hbox {bp}\), duanana ngagunakeun cDNA undiluted salaku citakan (1:1) jeung cDNA diluted 100-melu salaku citakan (1:100) dipigawé PCR. , Dibandingkeun NTC jeung PC (tingali Gambar S4 dina Émbaran Suplemén pikeun voltammograms wawakil). Unggal kotak dina boxplot dina Gambar 6 ngandung ukuran tina tilu sampel dina 5 éléktroda. Éléktroda sarua dipaké pikeun ngukur sakabéh sampel ulah kasalahan alatan éléktroda. -to-éléktroda variasi. Dibandingkeun jeung ukuran CV, ukuran DPV némbongkeun résolusi hadé pikeun ngabedakeun test na PC sampel ti NTCs sabab, sakumaha disebutkeun saméméhna, arus Faradaic disumputkeun alatan arus kapasitif tukang dina latter.For amplicons panjang, urang observasi yen. kontrol négatif (NTC) nyababkeun arus puncak CV sareng DPV anu langkung luhur dibandingkeun kontrol anu positif, sedengkeun sampel tés anu positif sareng anu henteu diluted nunjukkeun jangkungna puncak anu sami tina arus puncak DPV. ) sampel test na PC bisa jelas direngsekeun tina kaluaran sensor pikeun sampel NTC, sedengkeun resolusi pikeun 1: 100 sampel éncér kirang pronounced. Pikeun éncér 100-melu cDNA, urang teu niténan pita sagala salila éléktroforésis gél. (jalur teu ditémbongkeun dina Gambar 5), sarta pakait DPV na CV puncak arus éta sarupa jeung nu dipiharep pikeun NTC.Hasil pikeun \ (117 \, \ hbox {bp} \) sempalan ditémbongkeun dina Émbaran Suplemén. kontrol ngainduksi respon éléktrokimia ti sensor PCB alatan adsorption MB bébas dina éléktroda jeung interaksi MB jeung oligonucleotide Primer single-stranded. arus puncak sampel uji dibandingkeun jeung arus puncak diala ku kontrol négatip pikeun ngahontal diferensial (relatif) pangukuran39,40 pikeun mengklasifikasikan sampel tés positif atawa négatif.
(a) DPV, jeung (b) CV puncak arus pikeun deteksi éléktrokimia tina \(503\,\hbox {bp}\) fragmen dina cai danau samples.Test sampel diukur dina triplicate tur dibandingkeun euweuh kontrol template (NTC) jeung kontrol positif (PC).
Papanggihan urang ngagambarkeun mékanisme béda mangaruhan kinerja sénsor éléktrokimia pikeun amplicons tina panjangna béda pikeun DNA béda, kalawan konsentrasi diverifikasi ku ukuran optik maké spectrophotometer UV / Vis. Observasi kami underscore wawasan yén fragmen DNA panjang nepi ka \(\approx\) \(500\,\hbox {bp}\) tiasa dideteksi kalayan sensitipitas anu langkung luhur sareng yén ayana uyah dina sampel henteu sensitipitas konsentrasi DNA anu mangaruhan sensitipitas anu langkung luhur (jarang \({\hbox {ng}/{\upmu \ hbox {l}}} \) jeung saluhureuna).Sajaba ti éta, urang nalungtik pangaruh tipena béda sampel, kaasup amplicons gél-dimurnikeun kalawan jeung tanpa uyah ditambahkeun, sarta tambahan sampel cai danau dina DPV na ukuran CV.Kami ningali yén DPV nyayogikeun résolusi anu langkung saé, sabab arus kapasitif latar ogé mangaruhan pangukuran CV, janten kirang sénsitip.
Amplifikasi fragmen panjang gumantung kana integritas RNA génomik viral. Sababaraha studi geus ditémbongkeun yén amplifikasi fragmen panjang teu salawasna efisien alatan degradasi RNA di lingkungan jeung potensi splicing salila isolasi11,41,42,43,44 .Urang katalungtik yén métode konsentrasi virus basis PEG éta leuwih éféktif dina concentrating phage Phi-6 spiked dina sampel cai danau ti metoda konsentrasi virus dumasar-aluminium hidroksida. Kamampuhan pikeun ngadeteksi fragmen DNA panjang kabuktian nungkulan sarat pikeun multiplex PCR. pikeun ngagedékeun sababaraha témplat panjang anu langkung pondok sareng ngirangan kamungkinan spésifik silang.
Sampel biologis langka, ku kituna perlu mendesain biosensor anu merlukeun sampel minimal pikeun nguji. Éléktroda ENIG PCB dipaké dina ulikan ieu ngan diperlukeun \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) sampel pikeun nguji pikeun nutupan wewengkon éféktif tina éléktroda. Sajaba ti éta, éléktroda sarua bisa dipaké deui sanggeus beberesih saméméh dispensing sampel salajengna. Sampel amplified teu merlukeun tambahan sagala bahan kimia lian ti métilén bulao, nu mangrupa murah. sarta ilahar dipaké kimiawi. Kusabab unggal éléktroda waragad ngeunaan $0,55 (atawa INR 40) pikeun pabrik, biosensor ieu bisa jadi alternatif ongkos-éféktif pikeun téhnologi deteksi aya. Table 2 nembongkeun ngabandingkeun karya ieu kalawan sensor séjén dilaporkeun dina literatur pikeun lila. fragmen DNA dina sampel hétérogén.
Nunjukkeun yén protokol deteksi éléktrokimia berbasis MB ngandelkeun spésifisitas PCR, watesan utama metode ieu nyaéta poténsi amplifikasi non-spésifik dina sampel hétérogén sapertos cai limbah sareng cai danau atanapi nganggo primers-purity low. Pikeun ningkatkeun sensitipitas tina métode deteksi éléktrokimia pikeun deteksi DNA produk PCR unpurified maké éléktroda ENIG PCB unmodified, perlu leuwih hadé ngartos kasalahan diwanohkeun ku dNTPs henteu kapake sarta primers, sarta pikeun ngaoptimalkeun kaayaan réaksi jeung protokol assay.Parameter physicochemical tambahan kayaning pH, suhu, jeung biologis. Paménta oksigén (BOD) tina conto cai ogé kedah diukur pikeun ningkatkeun akurasi pangukuran.
Dina kacindekan, urang ngajukeun béaya rendah éléktrokimia ENIG sensor PCB pikeun deteksi virus dina lingkungan (cai cai) samples.Unlike éléktroda oligonucleotide immobilized atawa substrat custom pikeun sensing DNA anu merlukeun neundeun cryogenic pikeun ngajaga sensitipitas,53,54 téhnik kami ngagunakeun PCB unmodified. éléktroda kalayan umur rak panjang tur euweuh sarat gudang husus sahingga cocog pikeun ngembangkeun solusi pangukuran jeung ngolah sampel otomatis deployed di LMICs.The biosensor utilizes murah DNA-intercalating redox dyes (MB) pikeun deteksi gancang amplicons target.The Gedekeun nonspecific umum dina sampel lingkungan ngurangan spésifisitas métode sensing ieu alatan beungkeutan nonspésifik MBs ka oligonucleotides single- jeung ganda-stranded.Ku alatan éta, spésifisitas tés ieu gumantung kana optimasi primers jeung kaayaan réaksi PCR. sarta arus puncak DPV dicandak ti sampel diuji kudu diinterpretasi relatif ka réspon dicandak ti kontrol négatip (NTC) pikeun tiap test.The desain sensor éléktrokimia jeung métode dibere dina karya ieu bisa terpadu kalayan autosamplers pikeun ngembangkeun hiji pinuh otomatis tur low. -solusi biaya anu tiasa ngumpulkeun sareng nganalisa conto sareng ngirimkeun hasil sacara nirkabel deui ka laboratorium.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Métode pikeun konsentrasi awal virus tina sampel cai: review sarta meta-analysis studi panganyarna.J.Application.microorganism.115, kc. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne virus: Halangan pikeun cai nginum aman.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Epidemiologi cai limbah pikeun panjagaan skala ageung biaya-éféktif COVID-19 di nagara-nagara berpendapatan rendah sareng tengah: tantangan sareng kasempetan.Cai 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Métilén bulao salaku hiji discriminator éléktrokimia tina oligonucleotides tunggal jeung ganda-stranded immobilized dina substrat emas.Analyst 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Babandingan Kation na Anion Intercalators pikeun Transduksi éléktrokimia DNA Hybridization ku Long-Rentang Éléktron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ mindahkeun muatan ngaliwatan DNA: a selektif éléktrokimia DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138-2144 (2006).
Fang, TH et al.Real-waktos PCR alat microfluidic kalawan deteksi éléktrokimia sakaligus.biological sensor.Bioelectronics.24, 2131-2136 (2009).
Win, BY et al.Sinyal mékanisme ulikan sarta verifikasi kinerja hiji éléktrokimia real-time sistem PCR dumasar kana interaksi métilén bulao jeung DNA.Analyst 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop-dimédiasi isothermal basis Gedekeun sensor éléktrokimia pikeun deteksi sars-cov-2 dina samples wastewater.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Sénsor éléktrokimia tina amplikon SARS-CoV-2 sareng éléktroda PCB.Sénsor diaktipkeun.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Éfisién deteksi SARS-CoV-2 RNA dina fraksi padet wastewater.science.lingkungan umum.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Metode Analitik pikeun Deteksi SARS-CoV-2 dina Cai Limbah: Protokol sareng Perspektif Kahareup.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (a surrogate pikeun SARS-CoV-2) dina titik-titik ciduh ngejat disimpen dina surfaces kaca.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Kegigihan Lingkungan tina surrogate SARS-CoV-2 (Phi6) dina amoeba.J hirup bébas.Kaséhatan Cai 20, 83 (2021).
Mindich, L. bungkusan tepat tilu fragmén génomik tina ganda-stranded RNA bacteriophage\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Struktur sekundér fag DH RNA \(\varphi\)6 wewengkon bungkusan.RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - Protokol anu gancang sareng efisien pikeun nyiapkeun saham laboratorium bacteriophages.PeerJ 4, e2261 (2016).
waktos pos: May-27-2022