Криовиалесе обично користе за криогено складиштење ћелијских линија и других критичних биолошких материјала, у Дјуаровим посудама напуњеним течним азотом.

Постоји неколико фаза у успешном очувању ћелија у течном азоту. Иако је основни принцип споро замрзавање, тачна техника која се користи зависи од типа ћелија и коришћеног криопротектора. Постоји неколико безбедносних разматрања и најбољих пракси које треба узети у обзир приликом складиштења ћелија на тако ниским температурама.

Овај пост има за циљ да пружи преглед начина складиштења криовиола у течном азоту.

Шта су криовиале

Криовиале су мале, затворене бочице дизајниране за чување течних узорака на изузетно ниским температурама. Оне осигуравају да ћелије конзервиране у криопротектору не дођу у директан контакт са течним азотом, минимизирајући ризик од ћелијских ломова, а истовремено имају користи од екстремног ефекта хлађења течног азота.

Бочице су обично доступне у различитим запреминама и дизајнима – могу бити са унутрашњим или спољашњим навојем и равним или заобљеним дном. Такође су доступни стерилни и нестерилни формати.

Ко користиСировијалсчување ћелија у течном азоту

Низ лабораторија Националне здравствене службе (NHS) и приватних лабораторија, као и истраживачке институције специјализоване за складиштење крви из пупчане врпце, биологију епителних ћелија, имунологију и биологију матичних ћелија користе криовиале за криопрезервацију ћелија.

Ћелије конзервиране на овај начин укључују Б и Т ћелије, CHO ћелије, хематопоетске матичне и прогениторске ћелије, хибридоме, цревне ћелије, макрофаге, мезенхималне матичне и прогениторске ћелије, моноците, мијелом, NK ћелије и плурипотентне матичне ћелије.

Преглед начина чувања криовиала у течном азоту

Криопрезервација је процес којим се ћелије и други биолошки конструкти чувају хлађењем на веома ниске температуре. Ћелије се могу чувати у течном азоту годинама без губитка ћелијске виталности. Ово је преглед примењених поступака.

Припрема ћелија

Тачан метод за припрему узорака варираће у зависности од типа ћелије, али генерално, ћелије се сакупљају и центрифугирају да би се развио талог богат ћелијама. Овај талог се затим ресуспендује у супернатанту помешаном са криопротектантом или медијумом за криопрезервацију.

Криопрезервациони медијум

Овај медијум се користи за очување ћелија у окружењима ниских температура којима ће бити изложене инхибирањем формирања интра и екстрацелуларних кристала и самим тим ћелијске смрти. Њихова улога је да обезбеде безбедно, заштитно окружење за ћелије и ткива током процеса замрзавања, складиштења и одмрзавања.

Медијум као што је свеже замрзнута плазма (СЗП), раствор хепаринизованог плазмалита или раствори без серума и животињских компоненти помешани су са криопротектантима као што су диметил сулфоксид (ДМСО) или глицерол.

Реликвифицирани узорак пелета се аликвотира у полипропиленске криовиоле као што суКомпанија Suzhou Ace Biomedical, криогене бочице за складиштење.

Важно је да се криовиале не препуне јер ће то повећати ризик од пуцања и могућег испуштања садржаја (1).

Контролисана стопа замрзавања

Генерално, за успешну криопрезервацију ћелија користи се спора контролисана брзина замрзавања.

Након што се узорци аликвотирају у криогене бочице, стављају се на влажни лед или у фрижидер на 4℃ и поступак замрзавања започиње у року од 5 минута. Као општа смерница, ћелије се хладе брзином од -1 до -3 у минути (2). Ово се постиже коришћењем програмабилног хладњака или стављањем бочица у изоловану кутију смештену у замрзивач са контролисаном брзином на -70°C до -90°C.

Пренос у течни азот

Замрзнуте криогене бочице се затим преносе у резервоар са течним азотом на неодређено време, под условом да се одржава температура мања од -135℃.

Ове ултраниске температуре могу се постићи урањањем у течни или гасовити азот.

Течна или парна фаза?

Познато је да складиштење у течној фази азота одржава хладну температуру са апсолутном конзистентношћу, али се често не препоручује из следећих разлога:

• Потреба за великим количинама (дубина) течног азота што представља потенцијалну опасност. Опекотине или гушење услед овога су стваран ризик.
• Документовани случајеви унакрсне контаминације инфективним агенсима као што су аспергилус, хепатитис Б и ширење вируса путем течног азотног медијума (2,3)
• Могућност цурења течног азота у бочице током урањања. Када се извади из складишта и загреје на собну температуру, азот се брзо шири. Сходно томе, бочица се може разбити када се извади из складишта течног азота, стварајући опасност и од летећих крхотина и од излагања садржају (1, 4).

Из ових разлога, складиштење на ултраниским температурама најчешће се врши у азоту у парној фази. Када се узорци морају чувати у течној фази, треба користити специјализоване криофлекс цеви.

Мана парне фазе је што може доћи до вертикалног температурног градијента који резултира температурним флуктуацијама између -135℃ и -190℃. То захтева пажљиво и марљиво праћење нивоа течног азота и температурних варијација (5).

Многи произвођачи препоручују да су криовиале погодне за складиштење до -135℃ или за употребу само у парној фази.

Одмрзавање криопрезервираних ћелија

Поступак одмрзавања је стресан за замрзнуту културу и потребно је правилно руковање и техника како би се осигурала оптимална виталност, опоравак и функционалност ћелија. Тачни протоколи одмрзавања зависиће од специфичних типова ћелија. Међутим, брзо одмрзавање се сматра стандардним за:

• Смањите било какав утицај на ћелијски опоравак
• Помаже у смањењу времена излагања раствореним супстанцама присутним у медијуму за замрзавање
• Минимизирајте било какву штету од рекристализације леда

За одмрзавање узорака се обично користе водена купатила, купатила са перлама или специјализовани аутоматизовани инструменти.

Најчешће се ћелијска линија одмрзава по једна, током 1-2 минута, нежним мешањем у воденом купатилу на 37℃ док у бочици не остане само мало леда пре него што се оперу у претходно загрејаном медијуму за раст.

За неке ћелије као што су ембриони сисара, споро загревање је неопходно за њихов опстанак.

Ћелије су сада спремне за ћелијску културу, изолацију ћелија или, у случају хематопоетских матичних ћелија – студије виталности како би се гарантовао интегритет донорских матичних ћелија пре мијелоаблативне терапије.

Уобичајена је пракса да се узму мали аликвоти претходно испраног узорка који се користи за бројање ћелија како би се одредиле концентрације ћелија за пресађивање у културу. Затим можете проценити резултате поступака изолације ћелија и утврдити виталност ћелија.

Најбоље праксе за складиштење криовиала

Успешна криопрезервација узорака складиштених у криовиалама зависи од многих елемената у протоколу, укључујући правилно складиштење и вођење евиденције.

• Поделите ћелије између локација за складиштење– Ако запремине дозвољавају, поделите ћелије између бочица и чувајте их на одвојеним местима како бисте смањили ризик од губитка узорка због кварова опреме.
• Спречите унакрсну контаминацију– Одаберите стерилне криогене бочице за једнократну употребу или аутоклавирајте пре следеће употребе
• Користите бочице одговарајуће величине за своје ћелије– бочице долазе у различитим запреминама између 1 и 5 мл. Избегавајте препуњавање бочица како бисте смањили ризик од пуцања.
• Изаберите криогене бочице са унутрашњим или спољашњим навојем– Неки универзитети препоручују бочице са унутрашњим навојем из безбедносних разлога – оне такође могу спречити контаминацију током пуњења или када се чувају у течном азоту.
• Спречите цурење- Користите двоструко убризгане заптивке обликоване у затварач са навојем или О-прстенове да бисте спречили цурење и контаминацију.
• Користите 2Д баркодове и обележите бочице– да би се осигурала следљивост, бочице са великим површинама за писање омогућавају да свака бочица буде адекватно обележена. 2Д баркодови могу помоћи у управљању складиштењем и вођењу евиденције. Поклопци са кодирањем у боји су корисни за лакшу идентификацију.
• Адекватно одржавање складишта- Да би се осигурало да се ћелије не изгубе, посуде за складиштење треба стално да прате температуру и нивое течног азота. Требало би да буду постављени аларми који ће упозоравати кориснике на грешке.

Мере предострожности

Течни азот је постао уобичајена пракса у савременим истраживањима, али носи ризик од озбиљних повреда ако се користи неправилно.

Треба носити одговарајућу личну заштитну опрему (ЛЗО) како би се смањио ризик од промрзлина, опекотина и других нежељених инцидената при руковању течним азотом. Носите

• Криогене рукавице
• Лабораторијски мантил
• Штитник за цело лице отпоран на ударце који такође покрива врат
• Ципеле са затвореним прстима
• Пластична кецеља отпорна на прскање

Фрижидере са течним азотом треба поставити у добро проветреним просторијама како би се смањио ризик од гушења – испуштени азот испарава и истискује атмосферски кисеоник. Складишта велике запремине треба да имају системе за алармирање ниског нивоа кисеоника.

Рад у паровима при руковању течним азотом је идеалан и његова употреба ван редовног радног времена треба да буде забрањена.

Криовиале за подршку вашем радном току

Компанија Suzhou Ace Biomedical нуди широк избор производа који задовољавају ваше потребе за криопрезервацијом различитих врста ћелија. Портфолио укључује низ епрувета, као и низ стерилних криовиала.

Наше криовиоле су:

• Лабораторијски затварач са навојем 0,5 мл 1,5 мл 2,0 мл криовијална криогена бочица, криогена бочица са конусним дном, криоепрувета са заптивком

  ● Спецификација 0,5 мл, 1,5 мл, 2,0 мл, са сукњом или без сукње
  ● Конусни или самостојећи дизајн, стерилни или нестерилни су доступни
  ● Цеви са завртним затварачем направљене су од полипропилена медицинског квалитета
  ● ПП криотубе бочице се могу више пута замрзавати и одмрзавати
  ●Дизајн спољног поклопца може смањити вероватноћу контаминације током обраде узорка.
  ● Криогене епрувете са навојним поклопцем Универзални навоји за употребу
  ● Цеви одговарају већини уобичајених ротора
  ● Криогене цеви са О-прстеновима одговарају стандардним кутијама за замрзавање од 1 инча и 2 инча, 48, 81, 96 и 100 бунара
  ● Може се аутоклавирати до 121°C и замрзавати до -86°C

  БРОЈ ДЕЛА	МАТЕРИЈАЛ	ЗАПРЕМИНА	ЗАПБОЈА	PCS/ТОРБА	ТОРБЕ/КУТИЈА
  ACT05-BL-N	PP	0,5 мл	Црна, жута, плава, црвена, љубичаста, бела	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 мл	Црна, жута, плава, црвена, љубичаста, бела	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 мл	Црна, жута, плава, црвена, љубичаста, бела	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 мл	Црна, жута, плава, црвена, љубичаста, бела	500	10