Криопробиркиобычно используются для криогенного хранения клеточных линий и других критически важных биологических материалов в сосудах Дьюара, заполненных жидким азотом.

Успешное сохранение клеток в жидком азоте включает несколько этапов. Хотя основным принципом является медленное замораживание, точная используемая техника зависит от типа клеток и используемого криопротектора. Существует несколько соображений безопасности и передовых методов, которые следует учитывать при хранении клеток при таких низких температурах.

Целью данной публикации является предоставление обзора того, как криопробирки хранятся в жидком азоте.

Что такое криопробирки

Криопробирки — это небольшие, закрытые колпачками флаконы, предназначенные для хранения жидких образцов при экстремально низких температурах. Они гарантируют, что клетки, сохраненные в криопротекторе, не вступят в прямой контакт с жидким азотом, что сводит к минимуму риск клеточных разрывов, при этом по-прежнему используя экстремальный охлаждающий эффект жидкого азота.

Флаконы обычно доступны в различных объемах и конструкциях – они могут быть с внутренней или внешней резьбой, с плоским или закругленным дном. Также доступны стерильные и нестерильные форматы.

Кто используетCyrovialsдля хранения клеток в жидком азоте

Ряд лабораторий Национальной службы здравоохранения и частных лабораторий, а также научно-исследовательских институтов, специализирующихся на банках пуповинной крови, биологии эпителиальных клеток, иммунологии и биологии стволовых клеток, используют криопробирки для криоконсервации клеток.

Клетки, сохраненные таким образом, включают В- и Т-клетки, клетки CHO, гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники, гибридомы, кишечные клетки, макрофаги, мезенхимальные стволовые клетки и клетки-предшественники, моноциты, миелому, NK-клетки и плюрипотентные стволовые клетки.

Обзор того, как хранить криопробирки в жидком азоте

Криоконсервация — это процесс, который сохраняет клетки и другие биологические конструкции путем охлаждения их до очень низких температур. Клетки могут храниться в жидком азоте годами без потери жизнеспособности клеток. Это краткое описание применяемых процедур.

Подготовка клеток

Точный метод подготовки образцов будет зависеть от типа клеток, но в целом клетки собираются и центрифугируются для получения богатого клетками осадка. Затем этот осадок ресуспендируется в супернатанте, смешанном с криопротектором или средой для криоконсервации.

Среда для криоконсервации

Эта среда используется для сохранения клеток в условиях низких температур, которым они будут подвергаться, путем ингибирования образования внутри- и внеклеточных кристаллов и, следовательно, гибели клеток. Их роль заключается в обеспечении безопасной, защитной среды для клеток и тканей во время процессов замораживания, хранения и размораживания.

Среду, такую ​​как свежезамороженная плазма (СЗП), гепаринизированный раствор плазмолита или растворы без сыворотки и компонентов животного происхождения, смешивают с криопротекторами, такими как диметилсульфоксид (ДМСО) или глицерин.

Повторно разжиженный образец аликвотируют в полипропиленовые криопробирки, такие какКриогенные флаконы для хранения компании Suzhou Ace Biomedical.

Важно не переполнять криопробирки, так как это увеличит риск их растрескивания и возможного выброса содержимого (1).

Контролируемая скорость замораживания

Как правило, для успешной криоконсервации клеток применяется медленная контролируемая скорость замораживания.

После того, как образцы аликвотированы в криогенные флаконы, их помещают на влажный лед или в холодильник с температурой 4℃, и процедура замораживания начинается в течение 5 минут. Как правило, клетки охлаждаются со скоростью от -1 до -3 в минуту (2). Это достигается с помощью программируемого охладителя или путем помещения флаконов в изолированную коробку, помещенную в морозильник с контролируемой скоростью от –70°C до –90°C.

Перевод на жидкий азот

Затем замороженные криогенные флаконы переносятся в резервуар с жидким азотом на неопределенный срок при условии поддержания температуры ниже -135 ℃.

Эти сверхнизкие температуры могут быть получены путем погружения в жидкую или парообразную фазу азота.

Жидкая или паровая фаза?

Известно, что хранение в жидкой фазе азота позволяет поддерживать низкую температуру с абсолютной стабильностью, но часто не рекомендуется по следующим причинам:

• Необходимость в больших объемах (глубине) жидкого азота, что является потенциальной опасностью. Ожоги или удушье из-за этого являются реальным риском.
• Задокументированы случаи перекрестного заражения инфекционными агентами, такими как аспергилл, гепатит В и вирусное распространение через среду жидкого азота (2,3)
• Потенциал утечки жидкого азота во флаконы во время погружения. При извлечении из хранилища и нагревании до комнатной температуры азот быстро расширяется. Следовательно, флакон может разбиться при извлечении из хранилища жидкого азота, создавая опасность как от летящих обломков, так и от воздействия содержимого (1, 4).

По этим причинам хранение при сверхнизкой температуре чаще всего осуществляется в паровой фазе азота. Когда образцы необходимо хранить в жидкой фазе, следует использовать специализированные криофлексные трубки.

Недостатком паровой фазы является то, что может возникнуть вертикальный градиент температуры, что приводит к колебаниям температуры от -135℃ до -190℃. Это требует тщательного и усердного мониторинга уровней жидкого азота и колебаний температуры (5).

Многие производители рекомендуют криопробирки, пригодные для хранения при температуре до -135 ℃ или для использования только в паровой фазе.

Размораживание криоконсервированных клеток

Процедура размораживания является стрессовой для замороженной культуры, и для обеспечения оптимальной жизнеспособности, восстановления и функциональности клеток требуются правильное обращение и техника. Точные протоколы размораживания будут зависеть от конкретных типов клеток. Тем не менее, быстрое размораживание считается стандартным для:

• Уменьшить любое воздействие на клеточное восстановление
• Помогает сократить время воздействия растворенных веществ, присутствующих в замораживающей среде.
• Минимизировать ущерб от рекристаллизации льда

Для размораживания образцов обычно используются водяные бани, ванны с шариками или специализированные автоматизированные приборы.

Чаще всего размораживают одну линию клеток в течение 1–2 минут, осторожно перемешивая ее в водяной бане при температуре 37 ℃ до тех пор, пока во флаконе не останется лишь небольшое количество льда, после чего промывают в предварительно подогретой питательной среде.

Для некоторых клеток, таких как эмбрионы млекопитающих, медленное нагревание необходимо для их выживания.

Теперь клетки готовы к культивированию, выделению клеток или, в случае гемопоэтических стволовых клеток, к исследованиям жизнеспособности, чтобы гарантировать целостность донорских стволовых клеток перед миелоаблативной терапией.

Обычной практикой является взятие небольших аликвот предварительно промытого образца, используемого для подсчета клеток, чтобы определить концентрацию клеток для посева в культуру. Затем вы можете оценить результаты процедур выделения клеток и определить жизнеспособность клеток.

Лучшие практики хранения криопробирок

Успешная криоконсервация образцов, хранящихся в криопробирках, зависит от многих элементов протокола, включая правильное хранение и ведение записей.

• Разделить ячейки между местами хранения– Если объемы позволяют, разделите клетки между флаконами и храните их в отдельных местах, чтобы снизить риск потери образцов из-за сбоев оборудования.
• Предотвратить перекрестное загрязнение– Выбирайте одноразовые стерильные криогенные флаконы или автоклавируйте перед последующим использованием
• Используйте пробирки подходящего размера для ваших клеток.– флаконы выпускаются в диапазоне объемов от 1 до 5 мл. Избегайте переполнения флаконов, чтобы снизить риск растрескивания.
• Выберите криогенные флаконы с внутренней или внешней резьбой– Некоторые университеты рекомендуют использовать флаконы с внутренней резьбой в целях безопасности – они также могут предотвратить загрязнение во время наполнения или при хранении в жидком азоте.
• Предотвратить утечку- Используйте двухкомпонентные литьевые уплотнения, отлитые в винтовой крышке, или уплотнительные кольца для предотвращения утечек и загрязнения.
• Используйте 2D штрихкоды и маркируйте флаконы– для обеспечения прослеживаемости флаконы с большими областями для надписей позволяют адекватно маркировать каждый флакон. 2D-штрихкоды могут помочь в управлении хранением и ведении учета. Цветные колпачки полезны для более легкой идентификации.
• Адекватное обслуживание хранилища- Чтобы гарантировать, что ячейки не будут потеряны, емкости для хранения должны постоянно контролировать температуру и уровень жидкого азота. Должны быть установлены сигналы тревоги, чтобы предупреждать пользователей об ошибках.

Меры предосторожности

Жидкий азот стал обычной практикой в ​​современных исследованиях, однако при неправильном использовании он несет риск серьезных травм.

Необходимо надевать соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), чтобы свести к минимуму риск обморожения, ожогов и других неблагоприятных инцидентов при работе с жидким азотом.

• Криогенные перчатки
• Лабораторный халат
• Ударопрочный полнолицевой щиток, который также закрывает шею
• Туфли с закрытым носком
• Пластиковый фартук, защищающий от брызг

Холодильники с жидким азотом следует размещать в хорошо проветриваемых помещениях, чтобы свести к минимуму риск удушья — выделившийся азот испаряется и вытесняет атмосферный кислород. Большие хранилища должны быть оснащены системами сигнализации низкого уровня кислорода.

Идеальным вариантом при работе с жидким азотом является парная работа, а его использование вне рабочего времени должно быть запрещено.

Криопробирки для поддержки вашего рабочего процесса

Компания Suzhou Ace Biomedical предлагает широкий выбор продукции, которая отвечает вашим потребностям в криоконсервации для разных типов клеток. Портфолио включает в себя ряд пробирок, а также ряд стерильных криопробирок.

Наши криопробирки:

• Лабораторные завинчивающиеся крышки 0,5 мл 1,5 мл 2,0 мл криопробирки криогенные конические дно криопробирка с прокладкой

  ● Характеристики 0,5 мл, 1,5 мл, 2,0 мл, с юбкой или без юбки
  ● Доступны коническая или отдельно стоящая конструкция, стерильная или нестерильная
  ● Пробирки с винтовой крышкой изготовлены из полипропилена медицинского назначения.
  ● Криопробирки из полипропилена можно многократно замораживать и размораживать.
  ● Конструкция внешнего колпачка позволяет снизить вероятность загрязнения во время обработки образцов.
  ● Криогенные трубки с винтовой крышкой. Универсальная винтовая резьба для использования
  ● Трубки подходят для большинства распространенных роторов.
  ● Криогенные трубки с уплотнительным кольцом подходят для стандартных 1-дюймовых и 2-дюймовых морозильных боксов с 48, 81, 96 и 100 лунками.
  ● Автоклавируется при температуре до 121°C и замораживается при температуре до -86°C

  НОМЕР ДЕТАЛИ	МАТЕРИАЛ	ОБЪЕМ	КЭПЦВЕТ	ПКС/СУМКА	СУМКИ/ЧЕХЛЫ
  ACT05-BL-N	PP	0,5 мл	Черный, желтый, синий, красный, фиолетовый, белый	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 мл	Черный, желтый, синий, красный, фиолетовый, белый	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 мл	Черный, желтый, синий, красный, фиолетовый, белый	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0мл	Черный, желтый, синий, красный, фиолетовый, белый	500	10