Criotubossão comumente usados ​​para armazenamento criogênico de linhagens celulares e outros materiais biológicos críticos, em recipientes dewar cheios de nitrogênio líquido.

Existem várias etapas envolvidas na preservação bem-sucedida de células em nitrogênio líquido. Embora o princípio básico seja o congelamento lento, a técnica exata empregada depende do tipo de célula e do crioprotetor utilizado. Há diversas considerações de segurança e práticas recomendadas a serem consideradas ao armazenar células em temperaturas tão baixas.

Esta postagem tem como objetivo dar uma visão geral de como os criotubos são armazenados em nitrogênio líquido.

O que são criotubos

Criotubos são pequenos frascos com tampa projetados para armazenar amostras líquidas em temperaturas extremamente baixas. Eles garantem que as células preservadas em crioprotetor não entrem em contato direto com o nitrogênio líquido, minimizando o risco de fraturas celulares e, ao mesmo tempo, se beneficiando do efeito de resfriamento extremo do nitrogênio líquido.

Os frascos geralmente estão disponíveis em diversos volumes e designs – podem ter rosca interna ou externa e fundo plano ou arredondado. Formatos estéreis e não estéreis também estão disponíveis.

Quem usaCyrovialspara armazenar células em nitrogênio líquido

Vários laboratórios do NHS e privados, bem como instituições de pesquisa especializadas em bancos de sangue de cordão umbilical, biologia de células epiteliais, imunologia e biologia de células-tronco usam criotubos para criopreservar células.

As células preservadas dessa maneira incluem células B e T, células CHO, células-tronco e progenitoras hematopoiéticas, hibridomas, células intestinais, macrófagos, células-tronco e progenitoras mesenquimais, monócitos, mieloma, células NK e células-tronco pluripotentes.

Visão geral de como armazenar criotubos em nitrogênio líquido

A criopreservação é um processo que preserva células e outras estruturas biológicas por meio do resfriamento a temperaturas muito baixas. As células podem ser armazenadas em nitrogênio líquido por anos sem perda de viabilidade celular. Este é um resumo dos procedimentos empregados.

Preparação de células

O método exato de preparação das amostras varia de acordo com o tipo de célula, mas, em geral, as células são coletadas e centrifugadas para formar um pellet rico em células. Este pellet é então ressuspenso no sobrenadante misturado com crioprotetor ou meio de criopreservação.

Meio de Criopreservação

Este meio é utilizado para preservar células nos ambientes de baixa temperatura aos quais serão submetidas, inibindo a formação de cristais intra e extracelulares e, consequentemente, a morte celular. Sua função é fornecer um ambiente seguro e protetor para células e tecidos durante os processos de congelamento, armazenamento e descongelamento.

Um meio como plasma fresco congelado (FFP), solução de plasma heparinizado ou soluções sem soro e sem componentes animais é misturado com crioprotetores como dimetilsulfóxido (DMSO) ou glicerol.

O pellet de amostra reliquefeito é aliquotado em criotubos de polipropileno, comoFrascos de armazenamento criogênico da empresa Suzhou Ace Biomedical.

É importante não encher demais os criotubos, pois isso aumentará o risco de rachaduras e possível liberação de conteúdo (1).

Taxa de congelamento controlada

Em geral, uma taxa de congelamento lenta e controlada é empregada para a criopreservação bem-sucedida de células.

Após as amostras serem aliquotadas em frascos criogênicos, elas são colocadas em gelo úmido ou em um refrigerador a 4°C e o procedimento de congelamento é iniciado em até 5 minutos. Como regra geral, as células são resfriadas a uma taxa de -1 a -3 por minuto (2). Isso é obtido usando um refrigerador programável ou colocando os frascos em uma caixa isolada em um freezer com taxa controlada de -70°C a -90°C.

Transferência para nitrogênio líquido

Os frascos criogênicos congelados são então transferidos para um tanque de nitrogênio líquido por períodos indefinidos, desde que seja mantida uma temperatura inferior a -135°C.

Essas temperaturas ultrabaixas podem ser obtidas por imersão em nitrogênio na fase líquida ou de vapor.

Fase líquida ou vapor?

Sabe-se que o armazenamento em nitrogênio em fase líquida mantém a temperatura fria com consistência absoluta, mas geralmente não é recomendado pelos seguintes motivos:

• A necessidade de grandes volumes (profundidade) de nitrogênio líquido representa um risco potencial. Queimaduras ou asfixia devido a isso são um risco real.
• Casos documentados de contaminação cruzada por agentes infecciosos como aspergillus, hepatite B e disseminação viral através do meio de nitrogênio líquido (2,3)
• Possibilidade de vazamento de nitrogênio líquido para os frascos durante a imersão. Quando removido do armazenamento e aquecido à temperatura ambiente, o nitrogênio se expande rapidamente. Consequentemente, o frasco pode se estilhaçar ao ser removido do armazenamento de nitrogênio líquido, criando um risco tanto devido a detritos voadores quanto à exposição ao conteúdo (1, 4).

Por essas razões, o armazenamento em temperaturas ultrabaixas é mais comumente realizado em nitrogênio na fase de vapor. Quando as amostras precisam ser armazenadas na fase líquida, recomenda-se o uso de tubos crioflexíveis especializados.

A desvantagem da fase de vapor é que pode ocorrer um gradiente vertical de temperatura, resultando em flutuações de temperatura entre -135°C e -190°C. Isso exige um monitoramento cuidadoso e diligente dos níveis de nitrogênio líquido e das variações de temperatura (5).

Muitos fabricantes recomendam que os criotubos sejam adequados para armazenamento em temperaturas de até -135°C ou para uso somente na fase de vapor.

Descongelando suas células criopreservadas

O procedimento de descongelamento é estressante para uma cultura congelada, e manuseio e técnica adequados são necessários para garantir a viabilidade, recuperação e funcionalidade ideais das células. Os protocolos exatos de descongelamento dependerão dos tipos específicos de células. No entanto, o descongelamento rápido é considerado padrão para:

• Diminua qualquer impacto na recuperação celular
• Ajuda a reduzir o tempo de exposição aos solutos presentes no meio de congelamento
• Minimize qualquer dano causado pela recristalização do gelo

Banhos-maria, banhos de esferas ou instrumentos automatizados especializados são comumente usados ​​para descongelar amostras.

Mais frequentemente, uma linha celular é descongelada por vez por 1 a 2 minutos, agitando-as suavemente em um banho de água a 37°C até que reste apenas um pouco de gelo no frasco antes de serem lavadas em um meio de crescimento pré-aquecido.

Para algumas células, como embriões de mamíferos, o aquecimento lento é essencial para sua sobrevivência.

As células agora estão prontas para cultura celular, isolamento celular ou, no caso de células-tronco hematopoiéticas, estudos de viabilidade para garantir a integridade das células-tronco do doador antes da terapia mieloablativa.

É prática comum coletar pequenas alíquotas da amostra pré-lavada usada para realizar uma contagem de células e determinar as concentrações celulares para o cultivo em placa. Você pode então avaliar os resultados dos procedimentos de isolamento celular e determinar a viabilidade celular.

Boas práticas para o armazenamento de criotubos

O sucesso da criopreservação de amostras armazenadas em frascos criogênicos depende de muitos elementos do protocolo, incluindo armazenamento adequado e manutenção de registros.

• Dividir células entre locais de armazenamento– Se os volumes permitirem, divida as células entre os frascos e armazene-os em locais separados para reduzir o risco de perda de amostra devido a falhas no equipamento.
• Prevenir contaminação cruzada– Opte por frascos criogênicos estéreis de uso único ou autoclave antes do uso subsequente
• Use frascos de tamanho apropriado para suas células– os frascos estão disponíveis em volumes entre 1 e 5 ml. Evite encher demais os frascos para reduzir o risco de rachaduras.
• Selecione frascos criogênicos com rosca interna ou externa– Frascos com rosca interna são recomendados por algumas universidades por medidas de segurança – eles também podem evitar contaminação durante o enchimento ou quando armazenados em nitrogênio líquido.
• Prevenir vazamentos- Utilize vedações bi-injetadas moldadas na tampa de rosca ou anéis de vedação para evitar vazamentos e contaminação.
• Use códigos de barras 2D e rotule os frascos– para garantir a rastreabilidade, frascos com grandes áreas de escrita permitem que cada frasco seja adequadamente etiquetado. Códigos de barras 2D podem auxiliar no gerenciamento de armazenamento e na manutenção de registros. Tampas codificadas por cores são úteis para facilitar a identificação.
• Manutenção adequada de armazenamento- Para garantir que as células não sejam perdidas, os recipientes de armazenamento devem monitorar constantemente a temperatura e os níveis de nitrogênio líquido. Alarmes devem ser instalados para alertar os usuários sobre erros.

Precauções de segurança

O nitrogênio líquido se tornou uma prática comum na pesquisa moderna, mas traz o risco de ferimentos graves se usado incorretamente.

Equipamentos de proteção individual (EPI) adequados devem ser usados ​​para minimizar o risco de congelamento, queimaduras e outros incidentes adversos durante o manuseio de nitrogênio líquido.

• Luvas criogênicas
• Jaleco de laboratório
• Proteção facial completa resistente a impactos que também cobre o pescoço
• Sapatos fechados
• Avental de plástico à prova de respingos

Refrigeradores de nitrogênio líquido devem ser instalados em áreas bem ventiladas para minimizar o risco de asfixia – o nitrogênio liberado vaporiza e desloca o oxigênio atmosférico. Grandes armazéns devem possuir sistemas de alarme de oxigênio baixo.

O ideal é trabalhar em duplas ao manusear nitrogênio líquido e seu uso fora do horário normal de trabalho deve ser proibido.

Frascos criogênicos para auxiliar seu fluxo de trabalho

A empresa Suzhou Ace Biomedical oferece uma ampla seleção de produtos que atendem às suas necessidades de criopreservação para diferentes tipos de células. O portfólio inclui uma variedade de tubos, bem como uma variedade de criotubos estéreis.

Nossos criotubos são:

• Tampa de Rosca de Laboratório 0,5 mL 1,5 mL 2,0 mL Criotubo Criogênico Fundo Cônico Criotubo com Junta

  ● Especificação de 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, com saia ou sem saia
  ● Design cônico ou autoportante, estéril ou não estéril, ambos disponíveis
  ● Os tubos com tampa de rosca são feitos de polipropileno de grau médico
  ● Os frascos de criotubo PP podem ser congelados e descongelados repetidamente
  ●O design da tampa externa pode reduzir a probabilidade de contaminação durante o tratamento da amostra.
  ● Tubos criogênicos com tampa de rosca Roscas universais para uso
  ● Os tubos se adaptam à maioria dos rotores comuns
  ● Os tubos de vedação do tubo criogênico se adaptam a caixas de freezer padrão de 1 e 2 polegadas, 48 ​​poços, 81 poços, 96 poços e 100 poços
  ● Autoclavável a 121°C e congelável a -86°C

  Nº DA PEÇA	MATERIAL	VOLUME	CAPCOR	PCS/BOLSA	SACOS/CAIXA
  ACT05-BL-N	PP	0,5ML	Preto, Amarelo, Azul, Vermelho, Roxo, Branco	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5ML	Preto, Amarelo, Azul, Vermelho, Roxo, Branco	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5ML	Preto, Amarelo, Azul, Vermelho, Roxo, Branco	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0ML	Preto, Amarelo, Azul, Vermelho, Roxo, Branco	500	10