Kriofiolkisą powszechnie stosowane do kriogenicznego przechowywania linii komórkowych i innych ważnych materiałów biologicznych w naczyniach Dewara wypełnionych ciekłym azotem.

Istnieje kilka etapów skutecznego konserwowania komórek w ciekłym azocie. Podczas gdy podstawową zasadą jest powolne zamrażanie, dokładna technika zależy od rodzaju komórki i użytego krioochronnego środka. Istnieje kilka kwestii bezpieczeństwa i najlepszych praktyk, które należy wziąć pod uwagę podczas przechowywania komórek w tak niskich temperaturach.

Niniejszy wpis ma na celu przedstawienie ogólnego opisu sposobu przechowywania kriofiolek w ciekłym azocie.

Czym są Cryovials

Cryovials to małe, zakręcane fiolki przeznaczone do przechowywania próbek cieczy w ekstremalnie niskich temperaturach. Zapewniają one, że komórki zachowane w krioochronnym środku nie mają bezpośredniego kontaktu z ciekłym azotem, minimalizując ryzyko pęknięć komórkowych, a jednocześnie korzystając z ekstremalnego efektu chłodzenia ciekłego azotu.

Fiolki są zazwyczaj dostępne w różnych objętościach i wzorach – mogą być gwintowane wewnętrznie lub zewnętrznie z płaskim lub zaokrąglonym dnem. Dostępne są również formaty sterylne i niesterylne.

Kto używaCyrovialowiePrzechowywanie komórek w ciekłym azocie

Kriofiolki są wykorzystywane przez szereg laboratoriów prywatnych i państwowej służby zdrowia, a także instytucje badawcze specjalizujące się w bankowaniu krwi pępowinowej, biologii komórek nabłonkowych, immunologii i biologii komórek macierzystych w celu krioprezerwacji komórek.

Do komórek zakonserwowanych w ten sposób zalicza się: limfocyty B i T, komórki CHO, komórki macierzyste układu krwiotwórczego i komórki progenitorowe, hybrydomy, komórki jelitowe, makrofagi, komórki macierzyste mezenchymalne i komórki progenitorowe, monocyty, szpiczaki, komórki NK oraz pluripotentne komórki macierzyste.

Przegląd sposobu przechowywania kriofiolek w ciekłym azocie

Kriokonserwacja to proces, który konserwuje komórki i inne konstrukcje biologiczne poprzez chłodzenie ich do bardzo niskich temperatur. Komórki można przechowywać w ciekłym azocie przez lata bez utraty żywotności komórek. Oto zarys stosowanych procedur.

Przygotowanie komórek

Dokładna metoda przygotowywania próbek będzie się różnić w zależności od rodzaju komórek, ale generalnie komórki są zbierane i wirowane w celu uzyskania bogatego w komórki osadu. Następnie osad ten jest zawieszany w supernatancie zmieszanym z krioochronnym środkiem lub medium krioprezwatywnym.

Medium krioprezerwacyjne

Medium to jest stosowane do konserwacji komórek w środowiskach o niskiej temperaturze, którym będą poddawane, poprzez hamowanie tworzenia się kryształów wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych, a tym samym śmierci komórek. Ich rolą jest zapewnienie bezpiecznego, ochronnego środowiska dla komórek i tkanek podczas procesów zamrażania, przechowywania i rozmrażania.

Medium takie jak świeżo mrożone osocze (FFP), roztwór plazmy z dodatkiem heparyny lub roztwory bez surowicy i składników zwierzęcych miesza się z krioochronnymi substancjami, takimi jak dimetylosulfotlenek (DMSO) lub glicerol.

Ponownie upłynniony pelet próbki jest alikwotowany do kriogenicznych probówek polipropylenowych, takich jakFirma Suzhou Ace Biomedical produkująca fiolki do przechowywania kriogenicznego.

Ważne jest, aby nie przepełniać kriofiolek, ponieważ zwiększa to ryzyko pęknięcia i ewentualnego wycieku zawartości (1).

Kontrolowana szybkość zamarzania

Ogólnie rzecz biorąc, w celu skutecznej krioprezerwacji komórek stosuje się powolną, kontrolowaną szybkość zamrażania.

Po podzieleniu próbek na alikwoty do kriogenicznych fiolek, umieszcza się je na mokrym lodzie lub w lodówce o temperaturze 4℃, a procedurę zamrażania rozpoczyna się w ciągu 5 minut. Jako ogólną wskazówkę, komórki są chłodzone z szybkością od -1 do -3 na minutę (2). Osiąga się to za pomocą programowalnej chłodziarki lub umieszczając fiolki w izolowanym pudełku umieszczonym w zamrażarce o kontrolowanej szybkości od –70°C do –90°C.

Przeniesienie do ciekłego azotu

Zamrożone kriogeniczne fiolki są następnie przenoszone do zbiornika z ciekłym azotem na nieokreślony okres czasu, pod warunkiem utrzymania temperatury poniżej -135℃.

Tak niskie temperatury można uzyskać poprzez zanurzenie w ciekłym lub gazowym azocie.

Faza ciekła czy gazowa?

Wiadomo, że przechowywanie w fazie ciekłej azotu pozwala utrzymać niską temperaturę z zachowaniem całkowitej stałości, jednak często nie jest zalecane z następujących powodów:

• Potrzeba dużych objętości (głębokości) ciekłego azotu, co stanowi potencjalne zagrożenie. Oparzenia lub uduszenie z tego powodu stanowią realne ryzyko.
• Udokumentowane przypadki zakażeń krzyżowych czynnikami zakaźnymi, takimi jak aspergillus, wirus zapalenia wątroby typu B i wirus rozprzestrzeniający się za pośrednictwem ciekłego azotu (2,3)
• Możliwość wycieku ciekłego azotu do fiolek podczas zanurzania. Po wyjęciu z magazynu i ogrzaniu do temperatury pokojowej azot szybko się rozszerza. W konsekwencji fiolka może pęknąć po wyjęciu z magazynu ciekłego azotu, co stwarza zagrożenie zarówno ze strony latających odłamków, jak i narażenia na zawartość (1, 4).

Z tych powodów przechowywanie w ultraniskiej temperaturze odbywa się najczęściej w fazie gazowej azotu. Gdy próbki muszą być przechowywane w fazie ciekłej, należy użyć specjalistycznych rurek krioflex.

Wadą fazy parowej jest to, że może wystąpić pionowy gradient temperatury, powodujący wahania temperatury między -135℃ a -190℃. Wymaga to ostrożnego i pilnego monitorowania poziomów ciekłego azotu i wahań temperatury (5).

Wielu producentów zaleca, aby kriofiolki nadawały się do przechowywania w temperaturze do -135℃ lub do stosowania wyłącznie w fazie gazowej.

Rozmrażanie kriokonserwowanych komórek

Procedura rozmrażania jest stresująca dla zamrożonej kultury, a prawidłowa obsługa i technika są wymagane, aby zapewnić optymalną żywotność, odzyskiwanie i funkcjonalność komórek. Dokładne protokoły rozmrażania będą zależeć od konkretnych typów komórek. Jednak szybkie rozmrażanie jest uważane za standard w przypadku:

• Zmniejsz wpływ na regenerację komórkową
• Pomóż skrócić czas narażenia na substancje rozpuszczone obecne w środowisku zamrażającym
• Zminimalizuj wszelkie uszkodzenia spowodowane rekrystalizacją lodu

Do rozmrażania próbek powszechnie stosuje się łaźnie wodne, łaźnie perełkowe lub specjalistyczne zautomatyzowane urządzenia.

Najczęściej rozmraża się jedną linię komórkową na raz przez 1–2 minuty, delikatnie mieszając ją w łaźni wodnej o temperaturze 37°C, aż w fiolce pozostanie tylko odrobina lodu. Następnie komórki są płukane w podgrzanym wcześniej podłożu hodowlanym.

W przypadku niektórych komórek, na przykład zarodków ssaków, powolne ogrzewanie jest niezbędne do ich przetrwania.

Komórki są teraz gotowe do hodowli komórkowej, izolacji komórek lub, w przypadku komórek macierzystych układu krwiotwórczego, do badań żywotności, aby zagwarantować integralność komórek macierzystych dawcy przed terapią mieloablacyjną.

Zwykłą praktyką jest pobieranie małych alikwotów wstępnie umytej próbki używanej do liczenia komórek w celu określenia stężeń komórek do posiewu w hodowli. Następnie można ocenić wyniki procedur izolacji komórek i określić żywotność komórek.

Najlepsze praktyki przechowywania kriofiolek

Sukces krioprezerwacji próbek przechowywanych w kriofiolkach zależy od wielu elementów protokołu, w tym od prawidłowego przechowywania i prowadzenia dokumentacji.

• Podziel komórki pomiędzy lokalizacjami pamięci masowej– Jeżeli pozwalają na to objętości, rozdziel komórki między fiolki i przechowuj je w oddzielnych miejscach, aby zmniejszyć ryzyko utraty próbki z powodu awarii sprzętu.
• Zapobiegaj zakażeniom krzyżowym– Przed kolejnym użyciem wybierz jednorazowe sterylne fiolki kriogeniczne lub autoklaw
• Używaj fiolek o odpowiedniej wielkości do swoich komórek– fiolki są dostępne w zakresie objętości od 1 do 5 ml. Unikaj przepełniania fiolek, aby zmniejszyć ryzyko pęknięcia.
• Wybierz fiolki kriogeniczne z gwintem wewnętrznym lub zewnętrznym– Niektóre uniwersytety zalecają stosowanie fiolek z wewnętrznym gwintem ze względów bezpieczeństwa – mogą one również zapobiegać zanieczyszczeniom podczas napełniania lub przechowywania w ciekłym azocie.
• Zapobiegaj wyciekom- Aby zapobiec przeciekom i zanieczyszczeniom, należy stosować uszczelki dwuwtryskowe formowane w nakrętce lub pierścienie uszczelniające.
• Użyj kodów kreskowych 2D i etykietuj fiolki– aby zapewnić identyfikowalność, fiolki z dużymi powierzchniami do pisania umożliwiają odpowiednie oznakowanie każdej fiolki. Kody kreskowe 2D mogą pomóc w zarządzaniu magazynem i prowadzeniu dokumentacji. Kolorowe zatyczki są przydatne do łatwiejszej identyfikacji.
• Właściwa konserwacja magazynu- Aby mieć pewność, że komórki nie zostaną utracone, zbiorniki magazynowe powinny stale monitorować temperaturę i poziom ciekłego azotu. Należy zamontować alarmy, aby ostrzegać użytkowników o błędach.

Środki ostrożności

Ciekły azot stał się powszechną praktyką w nowoczesnych badaniach, ale jego nieprawidłowe użycie niesie ze sobą ryzyko poważnych obrażeń.

Należy nosić odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (PPE), aby zminimalizować ryzyko odmrożeń, oparzeń i innych niekorzystnych zdarzeń podczas pracy z ciekłym azotem. Noś

• Rękawice kriogeniczne
• Fartuch laboratoryjny
• Pełna osłona twarzy odporna na uderzenia, która zakrywa również szyję
• Buty z zamkniętymi palcami
• Fartuch plastikowy odporny na zachlapanie

Lodówki z ciekłym azotem powinny być umieszczone w dobrze wentylowanych pomieszczeniach, aby zminimalizować ryzyko uduszenia – uwolniony azot odparowuje i wypiera tlen atmosferyczny. Magazyny o dużej objętości powinny mieć systemy alarmowe niskiego poziomu tlenu.

Podczas obchodzenia się z ciekłym azotem najlepszym rozwiązaniem jest praca w parach. Jego używanie poza normalnymi godzinami pracy powinno być zabronione.

Kriofiolki wspomagające Twój przepływ pracy

Firma Suzhou Ace Biomedical oferuje szeroki wybór produktów, które spełniają Twoje potrzeby krioprezerwacji dla różnych typów komórek. Portfolio obejmuje szereg probówek, a także szereg sterylnych kriofiolek.

Nasze kriofiolki to:

• Zakrętka laboratoryjna 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml Kriogeniczna fiolka Kriogeniczna probówka z dnem stożkowym i uszczelką

  ● Specyfikacja 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, ze spódnicą lub bez spódnicy
  ● Dostępne są wersje stożkowe lub wolnostojące, sterylne lub niejałowe
  ● Tubki z zakrętką wykonane są z polipropylenu klasy medycznej
  ● Fiolki krioprobowe PP można wielokrotnie zamrażać i rozmrażać
  ●Zewnętrzna konstrukcja nasadki pozwala ograniczyć prawdopodobieństwo zanieczyszczenia podczas obróbki próbki.
  ● Kriogeniczne probówki z zakrętką Uniwersalne gwinty do stosowania
  ● Rury pasują do większości popularnych wirników
  ● Rurki kriogeniczne z pierścieniem uszczelniającym pasują do standardowych pudełek zamrażalniczych o średnicy 1 cala i 2 cali, 48, 81, 96 i 100 studzienek
  ● Możliwość sterylizacji w autoklawie w temperaturze do 121°C i mrożenia w temperaturze do -86°C

  NR CZĘŚCI	TWORZYWO	TOM	CZAPKAKOLOR	SZT./TORBA	TORBY/ETUI
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Czarny,Żółty,Niebieski,Czerwony,Fioletowy,Biały	500	10
  AKT15-BL-N	PP	1,5 ml	Czarny,Żółty,Niebieski,Czerwony,Fioletowy,Biały	500	10
  AKT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Czarny,Żółty,Niebieski,Czerwony,Fioletowy,Biały	500	10
  AKT20-BL-N	PP	2,0 ml	Czarny,Żółty,Niebieski,Czerwony,Fioletowy,Biały	500	10