Cryovialsworden vaak gebruikt voor de cryogene opslag van cellijnen en andere kritische biologische materialen, in dewarvaten gevuld met vloeibare stikstof.

Er zijn verschillende fasen betrokken bij het succesvol bewaren van cellen in vloeibare stikstof. Hoewel het basisprincipe langzaam invriezen is, hangt de exacte techniek af van het celtype en de gebruikte cryoprotectant. Er zijn verschillende veiligheidsoverwegingen en best practices om rekening mee te houden bij het bewaren van cellen bij zulke lage temperaturen.

Dit bericht geeft inzicht in hoe cryovials in vloeibare stikstof worden bewaard.

Wat zijn cryovials?

Cryovials zijn kleine, afgesloten flesjes die ontworpen zijn voor het bewaren van vloeibare monsters bij extreem lage temperaturen. Ze zorgen ervoor dat cellen die in cryoprotectant bewaard worden, niet in direct contact komen met de vloeibare stikstof. Dit minimaliseert het risico op celbreuken, terwijl de cellen toch profiteren van het extreem verkoelende effect van vloeibare stikstof.

De flesjes zijn meestal verkrijgbaar in verschillende volumes en uitvoeringen – ze kunnen inwendig of uitwendig schroefdraad hebben en een vlakke of afgeronde bodem. Er zijn ook steriele en niet-steriele varianten verkrijgbaar.

Wie gebruiktCyrovialenom cellen in vloeibare stikstof op te slaan

Een reeks NHS- en particuliere laboratoria, evenals onderzoeksinstellingen die gespecialiseerd zijn in navelstrengbloedbankieren, epitheelcelbiologie, immunologie en stamcelbiologie, gebruiken cryovials om cellen te cryopreserveren.

Tot de cellen die op deze manier worden bewaard, behoren B- en T-cellen, CHO-cellen, hematopoëtische stamcellen en voorlopercellen, hybridomen, darmcellen, macrofagen, mesenchymale stamcellen en voorlopercellen, monocyten, myeloom, NK-cellen en pluripotente stamcellen.

Overzicht van het bewaren van cryovials in vloeibare stikstof

Cryopreservatie is een proces waarbij cellen en andere biologische constructies worden geconserveerd door ze af te koelen tot zeer lage temperaturen. Cellen kunnen jarenlang in vloeibare stikstof worden bewaard zonder dat de levensvatbaarheid van de cellen afneemt. Hieronder volgt een overzicht van de gebruikte procedures.

Celvoorbereiding

De exacte methode voor het bereiden van de monsters varieert afhankelijk van het celtype, maar over het algemeen worden de cellen verzameld en gecentrifugeerd om een ​​celrijke pellet te ontwikkelen. Deze pellet wordt vervolgens geresuspendeerd in de supernatant gemengd met cryoprotectant of een cryopreservatiemedium.

Cryopreservatiemedium

Dit medium wordt gebruikt om cellen te conserveren in de lage temperaturen waaraan ze worden blootgesteld door de vorming van intra- en extracellulaire kristallen en daarmee celdood te remmen. Hun rol is om een ​​veilige, beschermende omgeving te bieden voor cellen en weefsels tijdens het invriezen, bewaren en ontdooien.

Een medium zoals vers bevroren plasma (FFP), gehepariniseerde plasmalytoplossing of serumvrije oplossingen zonder dierlijke bestanddelen wordt gemengd met cryoprotectanten zoals dimethylsulfoxide (DMSO) of glycerol.

Het opnieuw vloeibaar gemaakte monsterpellet wordt in porties verdeeld in cryovials van polypropyleen, zoalsSuzhou Ace Biomedical Company Cryogene opslagflessen.

Het is belangrijk om de cryovials niet te vol te doen, omdat dit het risico op scheuren en het mogelijk vrijkomen van inhoud vergroot (1).

Gecontroleerde vriessnelheid

Over het algemeen wordt een langzame, gecontroleerde vriessnelheid gebruikt voor succesvolle cryopreservatie van cellen.

Nadat de monsters in cryogene flesjes zijn verdeeld, worden ze op nat ijs of in een koelkast van 4 °C geplaatst en start de invriesprocedure binnen 5 minuten. Als algemene richtlijn geldt dat cellen worden gekoeld met een snelheid van -1 tot -3 per minuut (2). Dit wordt bereikt met behulp van een programmeerbare koeler of door flesjes in een geïsoleerde doos te plaatsen in een vriezer met een gecontroleerde snelheid van -70 °C tot -90 °C.

Overbrengen naar vloeibare stikstof

De bevroren cryogene flesjes worden vervolgens overgebracht naar een tank met vloeibare stikstof voor onbepaalde tijd, mits de temperatuur lager is dan -135℃.

Deze ultralage temperaturen kunnen worden bereikt door onderdompeling in de vloeibare of dampvormige stikstoffase.

Vloeibare of dampfase?

Het is bekend dat opslag in vloeibare stikstof de koude temperatuur absoluut constant houdt, maar dit wordt vaak niet aanbevolen om de volgende redenen:

• De noodzaak van grote hoeveelheden (diepte) vloeibare stikstof, wat een potentieel gevaar vormt. Brandwonden of verstikking als gevolg hiervan vormen een reëel risico.
• Gedocumenteerde gevallen van kruisbesmetting met infectieuze agentia zoals aspergillus, hepatitis B en virale verspreiding via vloeibaar stikstofmedium (2,3)
• De kans dat vloeibare stikstof tijdens onderdompeling in de flesjes lekt. Wanneer de fles uit de opslag wordt gehaald en tot kamertemperatuur wordt verwarmd, zet de stikstof snel uit. Hierdoor kan het flesje barsten wanneer het uit de opslag voor vloeibare stikstof wordt gehaald, wat een gevaar oplevert door rondvliegend vuil en blootstelling aan de inhoud (1, 4).

Om deze redenen wordt opslag bij ultralage temperaturen meestal in stikstof in de dampfase uitgevoerd. Wanneer monsters in de vloeibare fase moeten worden bewaard, moeten speciale cryoflexslangen worden gebruikt.

Het nadeel van de dampfase is dat er een verticale temperatuurgradiënt kan ontstaan, wat resulteert in temperatuurschommelingen tussen -135 °C en -190 °C. Dit vereist een zorgvuldige en nauwgezette monitoring van de vloeibare stikstofniveaus en temperatuurvariaties (5).

Veel fabrikanten adviseren dat cryovials geschikt zijn voor opslag tot -135℃ of alleen voor gebruik in de dampfase.

Het ontdooien van uw cryoconserveerde cellen

De ontdooiprocedure is stressvol voor een bevroren cultuur en de juiste behandeling en techniek zijn vereist om optimale levensvatbaarheid, herstel en functionaliteit van de cellen te garanderen. De exacte ontdooiprotocollen zijn afhankelijk van het specifieke celtype. Snel ontdooien wordt echter als standaard beschouwd om:

• Verminder elke impact op cellulair herstel
• Helpt de blootstellingstijd aan de opgeloste stoffen in het vriesmedium te verkorten
• Minimaliseer eventuele schade door ijsrekristallisatie

Voor het ontdooien van monsters worden vaak waterbaden, kralenbaden en gespecialiseerde geautomatiseerde instrumenten gebruikt.

Meestal wordt één cellijn per keer gedurende 1-2 minuten ontdooid door deze voorzichtig rond te draaien in een waterbad van 37℃, totdat er nog maar een klein beetje ijs in het flesje zit. Vervolgens worden de cellen gewassen in een voorverwarmd groeimedium.

Voor sommige cellen, zoals embryo's van zoogdieren, is langzame opwarming essentieel voor hun overleving.

De cellen zijn nu klaar voor celkweek, celisolatie of, in het geval van hematopoëtische stamcellen, voor levensvatbaarheidsstudies om de integriteit van de donorstamcellen te garanderen vóór myeloablatieve therapie.

Het is gebruikelijk om kleine aliquots van het voorgewassen monster te nemen voor een celtelling om de celconcentraties te bepalen voor uitplating in kweek. Vervolgens kunt u de resultaten van de celisolatieprocedures beoordelen en de levensvatbaarheid van de cellen bepalen.

Beste praktijken voor de opslag van cryovials

Het succesvol cryopreserveren van monsters die zijn opgeslagen in cryovials, hangt af van veel elementen in het protocol, waaronder de juiste opslag en het bijhouden van gegevens.

• Cellen splitsen tussen opslaglocaties– Als de volumes het toelaten, verdeel de cellen dan over meerdere flesjes en bewaar ze op aparte locaties om het risico op monsterverlies door apparatuurstoringen te beperken.
• Voorkom kruisbesmetting– Kies voor steriele cryogene flesjes voor eenmalig gebruik of autoclaaf ze vóór het volgende gebruik
• Gebruik flesjes van de juiste maat voor uw cellen– flesjes zijn verkrijgbaar in volumes van 1 tot 5 ml. Vermijd het overvullen van flesjes om het risico op barsten te verminderen.
• Selecteer cryogene flesjes met interne of externe schroefdraad– Sommige universiteiten raden flesjes met interne schroefdraad aan vanwege de veiligheid. Ze kunnen ook besmetting voorkomen tijdens het vullen of bij opslag in vloeibare stikstof.
• Lekkage voorkomen- Gebruik bi-geïnjecteerde afdichtingen die in de schroefdop of O-ringen zijn gegoten om lekkage en verontreiniging te voorkomen.
• Gebruik 2D-barcodes en etiketteer flesjes– Om de traceerbaarheid te garanderen, zorgen flesjes met een groot schrijfoppervlak ervoor dat elk flesje adequaat geëtiketteerd kan worden. 2D-barcodes kunnen helpen bij opslagbeheer en administratie. Kleurgecodeerde doppen zijn handig voor eenvoudigere identificatie.
• Voldoende opslagonderhoud- Om te voorkomen dat cellen verloren gaan, moeten opslagvaten constant de temperatuur en het vloeibare stikstofgehalte bewaken. Alarmen moeten worden geïnstalleerd om gebruikers te waarschuwen voor fouten.

Veiligheidsmaatregelen

Vloeibare stikstof wordt tegenwoordig veel gebruikt in modern onderzoek, maar brengt bij verkeerd gebruik een risico op ernstig letsel met zich mee.

Om het risico op bevriezing, brandwonden en andere nadelige gevolgen bij het werken met vloeibare stikstof te minimaliseren, moet de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) worden gedragen.

• Cryogene handschoenen
• Laboratoriumjas
• Stootvast volledig gezichtsscherm dat ook de nek bedekt
• Gesloten schoenen
• Spatwaterdichte kunststof schort

Koelkasten met vloeibare stikstof moeten in goed geventileerde ruimtes worden geplaatst om het risico op verstikking te minimaliseren – ontsnappende stikstof verdampt en verdringt de zuurstof uit de lucht. Opslagruimten met een groot volume moeten een alarmsysteem hebben voor een laag zuurstofgehalte.

Bij het werken met vloeibare stikstof is het ideaal om met z’n tweeën te werken. Het gebruik ervan buiten de normale werkuren zou verboden moeten worden.

Cryovials ter ondersteuning van uw workflow

Suzhou Ace Biomedical biedt een ruime keuze aan producten die voldoen aan uw cryopreservatiebehoeften voor verschillende soorten cellen. Het portfolio omvat een reeks buisjes en steriele cryovials.

Onze cryovials zijn:

• Lab schroefdop 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml cryovial cryogene flesjes conische bodem cryobuis met pakking

  ● Specificatie van 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, met of zonder rok
  ● Conisch of zelfstandig ontwerp, steriel of niet-steriel zijn beide beschikbaar
  ● Schroefdopbuizen zijn gemaakt van medisch polypropyleen
  ● PP Cryotube Vials kunnen herhaaldelijk worden ingevroren en ontdooid
  ●Het ontwerp van de externe dop kan de kans op besmetting tijdens de monsterbehandeling verkleinen.
  ● Cryogene buizen met schroefdop Universele schroefdraad voor gebruik
  ● Buizen passen op de meest voorkomende rotoren
  ● O-ringbuizen voor cryogene buizen passen op standaard vriesdozen van 1 inch en 2 inch, 48 wells, 81 wells, 96 wells en 100 wells
  ● Autoclaveerbaar tot 121°C en vriesbaar tot -86°C

  DEEL NR.	MATERIAAL	VOLUME	GLBKLEUR	STUKS/TAS	TASSEN/KOFFER
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Zwart, Geel, Blauw, Rood, Paars, Wit	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Zwart, Geel, Blauw, Rood, Paars, Wit	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Zwart, Geel, Blauw, Rood, Paars, Wit	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Zwart, Geel, Blauw, Rood, Paars, Wit	500	10