Kriofāļiparasti izmanto šūnu līniju un citu kritiski svarīgu bioloģisko materiālu kriogēnai uzglabāšanai Djuāra tvertnēs, kas piepildītas ar šķidru slāpekli.

Šūnu veiksmīga konservēšana šķidrā slāpeklī ietver vairākus posmus. Lai gan pamatprincips ir lēna sasaldēšana, konkrētā izmantotā metode ir atkarīga no šūnu veida un izmantotā krioaizsardzības līdzekļa. Uzglabājot šūnas tik zemā temperatūrā, jāņem vērā vairāki drošības apsvērumi un labākā prakse.

Šī ieraksta mērķis ir sniegt pārskatu par to, kā krioflakoni tiek uzglabāti šķidrā slāpeklī.

Kas ir kriofuniāli?

Kriofanoļi ir mazi, ar vāciņiem noslēgti flakoni, kas paredzēti šķidru paraugu uzglabāšanai ārkārtīgi zemā temperatūrā. Tie nodrošina, ka krioaizsardzības līdzeklī konservētās šūnas nenonāk tiešā saskarē ar šķidro slāpekli, tādējādi samazinot šūnu lūzumu risku, vienlaikus gūstot labumu no šķidrā slāpekļa ārkārtīgās dzesēšanas efekta.

Flakoni parasti ir pieejami dažādos tilpumos un dizainos – tie var būt ar iekšējo vai ārējo vītni un plakanu vai noapaļotu dibenu. Ir pieejami arī sterili un nesteriliski formāti.

Kas izmantoKiroviālišūnu uzglabāšanai šķidrā slāpeklī

Vairākas NHS un privātas laboratorijas, kā arī pētniecības iestādes, kas specializējas nabassaites asiņu banku uzglabāšanā, epitēlija šūnu bioloģijā, imunoloģijā un cilmes šūnu bioloģijā, izmanto krioflakonus šūnu kriokonservēšanai.

Šādā veidā konservētas šūnas ietver B un T šūnas, CHO šūnas, hematopoētiskās cilmes šūnas un cilmes šūnas, hibridomas, zarnu šūnas, makrofāgus, mezenhīmas cilmes šūnas un cilmes šūnas, monocītus, mielomu, NK šūnas un pluripotentās cilmes šūnas.

Pārskats par krioflakonu uzglabāšanu šķidrā slāpeklī

Kriokonservācija ir process, kurā šūnas un citas bioloģiskas konstrukcijas tiek saglabātas, atdzesējot tās līdz ļoti zemai temperatūrai. Šūnas var uzglabāt šķidrā slāpeklī gadiem ilgi, nezaudējot šūnu dzīvotspēju. Šeit ir sniegts izmantoto procedūru pārskats.

Šūnu sagatavošana

Precīza paraugu sagatavošanas metode atšķirsies atkarībā no šūnu veida, bet parasti šūnas tiek savāktas un centrifugētas, lai izveidotu ar šūnām bagātu nogulsni. Pēc tam šo nogulsni atkārtoti suspendē supernatantā, kas sajaukts ar krioprotektantu vai kriokonservācijas vidi.

Kriokonservācijas vide

Šo barotni izmanto, lai saglabātu šūnas zemas temperatūras vidē, kurai tās tiks pakļautas, kavējot intra- un ekstracelulāro kristālu veidošanos un līdz ar to šūnu nāvi. To uzdevums ir nodrošināt drošu, aizsargājošu vidi šūnām un audiem sasaldēšanas, uzglabāšanas un atkausēšanas procesos.

Barotne, piemēram, svaigi saldēta plazma (FFP), heparinizēts plazmalīta šķīdums vai serumu nesaturoši šķīdumi bez dzīvnieku komponentiem, tiek sajaukti ar krioprotektantiem, piemēram, dimetilsulfoksīdu (DMSO) vai glicerīnu.

Atkārtoti sašķidrinātās parauga granulas tiek sadalītas polipropilēna krioflakonos, piemēram,Suzhou Ace Biomedical Company kriogēnās uzglabāšanas flakoni.

Ir svarīgi krioflakonus nepārpildīt, jo tas palielinās plaisāšanas un iespējamas satura noplūdes risku (1).

Kontrolēts sasalšanas ātrums

Parasti veiksmīgai šūnu kriokonservācijai tiek izmantots lēns, kontrolēts sasaldēšanas ātrums.

Pēc paraugu alikvotēšanas kriogēnās flakonos tos novieto uz mitra ledus vai 4 °C ledusskapī, un sasaldēšanas procedūra tiek uzsākta 5 minūšu laikā. Parasti šūnas tiek atdzesētas ar ātrumu no -1 līdz -3 minūtē (2). To panāk, izmantojot programmējamu dzesētāju vai ievietojot flakonus izolētā kastē, kas ievietota saldētavā ar kontrolētu ātrumu no -70 °C līdz -90 °C.

Pārnešana uz šķidro slāpekli

Saldētie kriogēnie flakoni pēc tam tiek pārvietoti uz šķidrā slāpekļa tvertni uz nenoteiktu laiku, ja tiek uzturēta temperatūra zem -135 ℃.

Šīs īpaši zemās temperatūras var iegūt, iegremdējot šķidrā vai tvaika fāzes slāpeklī.

Šķidrā vai tvaika fāzē?

Ir zināms, ka uzglabāšana šķidrās fāzes slāpeklī uztur aukstuma temperatūru absolūtā noturībā, taču tā bieži vien nav ieteicama šādu iemeslu dēļ:

• Nepieciešamība pēc liela (dziļa) šķidrā slāpekļa daudzuma, kas rada potenciālus draudus. Apdegumi vai nosmakšana tā dēļ ir reāls risks.
• Dokumentēti krusteniskās kontaminācijas gadījumi ar infekcijas izraisītājiem, piemēram, aspergilozi, B hepatītu un vīrusu izplatīšanos, izmantojot šķidro slāpekļa vidi (2,3).
• Šķidrā slāpekļa noplūdes iespēja flakonos iegremdēšanas laikā. Izņemot no uzglabāšanas vietas un sasildot līdz istabas temperatūrai, slāpeklis strauji izplešas. Līdz ar to flakons var saplīst, izņemot no šķidrā slāpekļa uzglabāšanas vietas, radot apdraudējumu gan no lidojošiem gružiem, gan no saskares ar saturu (1, 4).

Šo iemeslu dēļ īpaši zemā temperatūrā uzglabāšana visbiežāk notiek tvaika fāzes slāpeklī. Ja paraugi jāuzglabā šķidrā fāzē, jāizmanto specializētas krioflex caurules.

Tvaika fāzes trūkums ir vertikāls temperatūras gradients, kā rezultātā temperatūra svārstās no -135 ℃ līdz -190 ℃. Tas prasa rūpīgu un uzmanīgu šķidrā slāpekļa līmeņa un temperatūras svārstību uzraudzību (5).

Daudzi ražotāji iesaka, ka krioflakoni ir piemēroti uzglabāšanai temperatūrā līdz -135 ℃ vai lietošanai tikai tvaika fāzē.

Kriokonservētu šūnu atkausēšana

Atkausēšanas procedūra saldētai kultūrai ir nogurdinoša, un, lai nodrošinātu optimālu šūnu dzīvotspēju, atgūšanu un funkcionalitāti, ir nepieciešama atbilstoša apiešanās un tehnika. Precīzi atkausēšanas protokoli būs atkarīgi no konkrētiem šūnu tipiem. Tomēr ātra atkausēšana tiek uzskatīta par standartu:

• Samazināt jebkādu ietekmi uz šūnu atjaunošanos
• Palīdz samazināt sasalšanas līdzeklī esošo izšķīdušo vielu iedarbības laiku
• Samaziniet jebkādus bojājumus, ko rada ledus pārkristalizācija

Paraugu atkausēšanai parasti izmanto ūdens vannas, lodīšu vannas vai specializētus automatizētus instrumentus.

Visbiežāk viena šūnu līnija tiek atkausēta vienlaikus 1–2 minūtes, viegli virpuļojot 37 ℃ ūdens vannā, līdz flakonā ir palicis tikai nedaudz ledus, pirms tās tiek mazgātas iepriekš uzsildītā augšanas vidē.

Dažām šūnām, piemēram, zīdītāju embrijiem, lēna sasilšana ir būtiska to izdzīvošanai.

Šūnas tagad ir gatavas šūnu kultivēšanai, šūnu izolēšanai vai, hematopoētisko cilmes šūnu gadījumā, dzīvotspējas pētījumiem, lai garantētu donora cilmes šūnu integritāti pirms mieloablatīvās terapijas.

Parasti tiek ņemti nelieli iepriekš mazgātā parauga alikvoti, ko izmanto šūnu skaitīšanai, lai noteiktu šūnu koncentrāciju kultūrai. Pēc tam var novērtēt šūnu izolēšanas procedūru rezultātus un noteikt šūnu dzīvotspēju.

Kriofanoļu uzglabāšanas labākā prakse

Kriofānos uzglabāto paraugu veiksmīga kriokonservācija ir atkarīga no daudziem protokola elementiem, tostarp pareizas uzglabāšanas un uzskaites.

• Sadalīt šūnas starp krātuves vietām– Ja tilpums atļauj, sadaliet šūnas starp flakoniem un uzglabājiet tos atsevišķās vietās, lai samazinātu paraugu zuduma risku iekārtu bojājumu dēļ.
• Novērst savstarpēju piesārņojumu– Pirms nākamās lietošanas izvēlieties vienreiz lietojamus sterilus kriogēnus flakonus vai autoklāvu
• Izmantojiet atbilstoša izmēra flakonus savām šūnām– flakonu tilpums ir no 1 līdz 5 ml. Lai samazinātu plaisāšanas risku, izvairieties no flakonu pārpildīšanas.
• Izvēlieties kriogēnās ampulas ar iekšējo vai ārējo vītni– Dažas universitātes drošības nolūkos iesaka iekšēji vītņotus flakonus, kas var arī novērst piesārņojumu pildīšanas laikā vai uzglabāšanas laikā šķidrā slāpeklī.
• Novērst noplūdi- Lai novērstu noplūdi un piesārņojumu, izmantojiet divkārši ielietas blīves, kas iestrādātas skrūvējamā vāciņā vai O veida gredzenos.
• Izmantojiet 2D svītrkodus un marķējiet flakonus– lai nodrošinātu izsekojamību, flakoni ar lieliem rakstīšanas laukumiem ļauj katru flakonu atbilstoši marķēt. 2D svītrkodi var palīdzēt uzglabāšanas pārvaldībā un uzskaitē. Krāsu kodēti vāciņi ir noderīgi vieglākai identifikācijai.
• Atbilstoša uzglabāšanas uzturēšana- Lai nodrošinātu, ka šūnas netiek zaudētas, uzglabāšanas traukos pastāvīgi jāuzrauga temperatūra un šķidrā slāpekļa līmenis. Jāuzstāda trauksmes signāli, lai brīdinātu lietotājus par kļūdām.

Drošības pasākumi

Šķidrais slāpeklis mūsdienu pētniecībā ir kļuvis par ierastu praksi, taču, ja to lieto nepareizi, pastāv nopietnu traumu risks.

Rīkojoties ar šķidro slāpekli, jāvalkā atbilstoši individuālie aizsardzības līdzekļi (IAL), lai samazinātu apsaldējumu, apdegumu un citu nevēlamu negadījumu risku.

• Kriogēnie cimdi
• Laboratorijas halāts
• Triecienizturīgs pilnas sejas aizsargs, kas nosedz arī kaklu
• Apavi ar slēgtu purngalu
• Šļakatu necaurlaidīgs plastmasas priekšauts

Šķidrā slāpekļa ledusskapji jānovieto labi vēdināmās telpās, lai samazinātu nosmakšanas risku — izplūdušais slāpeklis iztvaiko un izspiež atmosfēras skābekli. Liela apjoma veikalos jābūt aprīkotiem ar zema skābekļa līmeņa signalizācijas sistēmām.

Strādājot ar šķidro slāpekli, ideāli ir strādāt pāros, un tā lietošana ārpus parastā darba laika ir jāaizliedz.

Kriofāles jūsu darbplūsmas atbalstam

Uzņēmums “Suzhou Ace Biomedical” piedāvā plašu produktu klāstu, kas atbilst jūsu kriokonservācijas vajadzībām dažādu veidu šūnām. Portfelī ietilpst gan dažādas mēģenes, gan dažādi sterili krioflakoni.

Mūsu krioflakoni ir:

• Laboratorijas skrūvējams vāciņš 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kriofoliālie kriogēnie flakoni ar konisku dibenu un blīvi

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml specifikācija, ar svārkiem vai bez tiem
  ● Ir pieejams konisks vai pašstāvošs dizains, sterils vai nesterils
  ● Skrūvējamo vāciņu tūbiņas ir izgatavotas no medicīniskas kvalitātes polipropilēna
  ● PP kriogēnās mēģenes var atkārtoti sasaldēt un atkausēt
  ● Ārējā vāciņa konstrukcija var samazināt piesārņojuma varbūtību parauga apstrādes laikā.
  ● Kriogēnās mēģenes ar skrūvējamu vāciņu Universālas skrūvju vītnes lietošanai
  ● Caurules ir piemērotas lielākajai daļai izplatītāko rotoru
  ● Kriogēnās caurules ar o-veida gredzenu ir piemērotas standarta 1 collu un 2 collu, 48, 81, 96 un 100 bedrīšu saldētavas kastēm
  ● Autoklāvējams līdz 121 °C un sasaldējams līdz -86 °C

  DAĻAS NR.	MATERIĀLS	APJOMS	KLPKRĀSA	GAB./SOMA	SOMAS/KASTE
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Melns, dzeltens, zils, sarkans, violets, balts	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Melns, dzeltens, zils, sarkans, violets, balts	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Melns, dzeltens, zils, sarkans, violets, balts	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Melns, dzeltens, zils, sarkans, violets, balts	500	10