Kriogeniniai buteliukaidažniausiai naudojami ląstelių linijų ir kitų svarbių biologinių medžiagų kriogeniniam laikymui diuaro induose, pripildytuose skysto azoto.

Sėkmingas ląstelių konservavimas skystame azote apima kelis etapus. Nors pagrindinis principas yra lėtas užšaldymas, tiksli naudojama technika priklauso nuo ląstelių tipo ir naudojamo krioprotekcijos. Laikant ląsteles tokioje žemoje temperatūroje, reikia atsižvelgti į keletą saugos aspektų ir geriausios praktikos pavyzdžių.

Šiame įraše siekiama pateikti apžvalgą, kaip kriogeniniai buteliukai laikomi skystame azote.

Kas yra kriobuoliai?

Kriogeniniai buteliukai yra maži, uždengti buteliukai, skirti skystiems mėginiams laikyti itin žemoje temperatūroje. Jie užtikrina, kad kriogeniniame tirpale konservuotos ląstelės tiesiogiai nesiliestų su skystu azotu, taip sumažinant ląstelių lūžių riziką ir tuo pačiu metu išlaikant itin stiprų skysto azoto vėsinamąjį poveikį.

Buteliukai paprastai būna įvairių tūrių ir dizaino – jie gali būti su vidiniu arba išoriniu sriegiu, plokščiu arba apvaliu dugnu. Taip pat yra sterilių ir nesterilių formų.

Kas naudojaKirovialailaikyti ląsteles skystame azote

Įvairios NHS ir privačios laboratorijos, taip pat tyrimų įstaigos, kurios specializuojasi virkštelės kraujo bankininkystėje, epitelio ląstelių biologijoje, imunologijoje ir kamieninių ląstelių biologijoje, naudoja kriogeninius buteliukus ląstelėms kriokonservuoti.

Tokiu būdu konservuotos ląstelės apima B ir T ląsteles, CHO ląsteles, hematopoetines kamienines ir progenitorines ląsteles, hibridomas, žarnyno ląsteles, makrofagus, mezenchimines kamienines ir progenitorines ląsteles, monocitus, mielomą, NK ląsteles ir pluripotentines kamienines ląsteles.

Kriogeninių buteliukų laikymo skystame azote apžvalga

Kriokonservavimas – tai procesas, kurio metu ląstelės ir kiti biologiniai dariniai išsaugomi jas aušinant iki labai žemos temperatūros. Ląstelės gali būti laikomos skystame azote metų metus neprarandant gyvybingumo. Tai yra taikomų procedūrų apžvalga.

Ląstelių paruošimas

Tikslus mėginių paruošimo metodas skirsis priklausomai nuo ląstelių tipo, tačiau paprastai ląstelės surenkamos ir centrifuguojamos, kad susidarytų ląstelėmis praturtintos granulės. Šios granulės vėliau resuspenduojamos supernatate, sumaišytame su krioprotektantu arba kriokonservavimo terpe.

Kriokonservavimo terpė

Ši terpė naudojama ląstelėms išsaugoti žemoje temperatūroje, slopinant intra- ir ekstraląstelinių kristalų susidarymą ir dėl to ląstelių žūtį. Jos vaidmuo – užtikrinti saugią, apsauginę aplinką ląstelėms ir audiniams užšaldymo, laikymo ir atšildymo procesų metu.

Tokia terpė kaip šviežiai šaldyta plazma (FFP), heparinizuotas plazmolitų tirpalas arba tirpalai be serumo, be gyvūninės kilmės komponentų, sumaišomi su krioprotektantais, tokiais kaip dimetilsulfoksidas (DMSO) arba glicerolis.

Pakartotinai suskystintos mėginio granulės yra supilstomos į polipropileno kriogeninius buteliukus, tokius kaipSudžou „Ace“ biomedicinos įmonės kriogeniniai laikymo buteliukai.

Svarbu neperpildyti kriogeninių buteliukų, nes tai padidins įtrūkimų ir galimo turinio išsiskyrimo riziką (1).

Kontroliuojamas užšalimo greitis

Paprastai sėkmingam ląstelių kriokonservavimui naudojamas lėtas kontroliuojamas užšaldymo greitis.

Mėginius suskirstius į kriogeninius buteliukus, jie dedami ant šlapio ledo arba į 4 ℃ temperatūros šaldytuvą, o užšaldymo procedūra pradedama per 5 minutes. Paprastai ląstelės vėsinamos nuo -1 iki -3 per minutę greičiu (2). Tai atliekama naudojant programuojamą aušintuvą arba įdedant buteliukus į izoliuotą dėžutę, esančią –70–90 °C temperatūros kontroliuojamo greičio šaldiklyje.

Perkėlimas į skystą azotą

Užšaldyti kriogeniniai buteliukai neribotam laikui perkeliami į skysto azoto baką, kuriame palaikoma žemesnė nei -135 ℃ temperatūra.

Šias itin žemas temperatūras galima pasiekti panardinant į skystos arba garų fazės azotą.

Skystoji ar garų fazė?

Yra žinoma, kad laikant skystos fazės azotu šalta temperatūra išlieka absoliučiai pastovi, tačiau tai dažnai nerekomenduojama dėl šių priežasčių:

• Didelio (gylio) skysto azoto poreikis, kuris kelia potencialų pavojų. Nudegimai ar uždusimas dėl to yra realus pavojus.
• Dokumentuoti kryžminio užteršimo atvejai infekciniais sukėlėjais, tokiais kaip aspergiliozė, hepatitas B, ir virusų plitimas per skystą azotą (2, 3)
• Panardinimo metu į buteliukus gali nutekėti skystas azotas. Išėmus iš saugyklos ir sušildžius iki kambario temperatūros, azotas greitai išsiplečia. Todėl išėmus iš skysto azoto saugyklos buteliukas gali sudužti, sukeldamas pavojų dėl skraidančių dalelių ir sąlyčio su turiniu (1, 4).

Dėl šių priežasčių mėginiai dažniausiai laikomi itin žemoje temperatūroje garų fazės azoto aplinkoje. Kai mėginius reikia laikyti skystoje fazėje, reikia naudoti specializuotus kriofleksinius vamzdelius.

Garų fazės trūkumas yra tas, kad gali susidaryti vertikalus temperatūros gradientas, dėl kurio temperatūra svyruoja nuo -135 ℃ iki -190 ℃. Dėl to reikia atidžiai ir kruopščiai stebėti skysto azoto lygį ir temperatūros svyravimus (5).

Daugelis gamintojų rekomenduoja, kad kriogeniniai buteliukai būtų tinkami laikyti iki -135 ℃ temperatūros arba naudoti tik garų fazėje.

Kriokonservuotų ląstelių atitirpinimas

Užšaldytos kultūros atšildymo procedūra yra įtempta, todėl norint užtikrinti optimalų ląstelių gyvybingumą, regeneraciją ir funkcionalumą, reikia tinkamai elgtis su jomis ir taikyti tinkamas technikas. Tikslūs atšildymo protokolai priklausys nuo konkrečių ląstelių tipų. Tačiau greitas atšildymas laikomas standartiniu:

• Sumažinti bet kokį poveikį ląstelių atsistatymui
• Padeda sumažinti šaldymo terpėje esančių ištirpusių medžiagų sąlyčio laiką
• Sumažinkite bet kokią žalą, kurią sukelia ledo rekristalizacija

Mėginiams atitirpinti dažniausiai naudojamos vandens vonios, granulių vonios arba specializuoti automatiniai prietaisai.

Dažniausiai po 1 ląstelių liniją atšildyma 1–2 minutes, švelniai sukant 37 ℃ vandens vonelėje, kol buteliuke lieka tik nedidelis ledo gabalėlis, prieš jas nuplaunant pašildytoje augimo terpėje.

Kai kurioms ląstelėms, tokioms kaip žinduolių embrionai, lėtas atšilimas yra būtinas jų išlikimui.

Dabar ląstelės paruoštos ląstelių kultūrai, ląstelių izoliacijai arba, kraujodaros kamieninių ląstelių atveju, gyvybingumo tyrimams, siekiant užtikrinti donorinių kamieninių ląstelių vientisumą prieš mieloabliacinę terapiją.

Įprasta imti nedidelius iš anksto nuplauto mėginio, naudojamo ląstelių skaičiavimui, siekiant nustatyti ląstelių koncentraciją kultūrai, alikvotinius kiekius. Tada galite įvertinti ląstelių išskyrimo procedūrų rezultatus ir nustatyti ląstelių gyvybingumą.

Geriausia kriogeninių buteliukų laikymo praktika

Sėkmingas kriogeninių mėginių, laikomų kriogeniniuose buteliukuose, kriokonservavimas priklauso nuo daugelio protokolo elementų, įskaitant tinkamą saugojimą ir įrašų tvarkymą.

• Padalinti langelius tarp saugojimo vietų– Jei leidžia tūriai, padalinkite ląsteles tarp buteliukų ir laikykite jas atskirose vietose, kad sumažintumėte mėginių praradimo riziką dėl įrangos gedimų.
• Išvengti kryžminio užteršimo– Prieš vėlesnį naudojimą rinkitės vienkartinius sterilius kriogeninius buteliukus arba autoklavą
• Naudokite tinkamo dydžio buteliukus savo ląstelėms– buteliukai būna įvairių tūrių – nuo ​​1 iki 5 ml. Venkite perpildyti buteliukus, kad sumažintumėte įtrūkimų riziką.
• Pasirinkite kriogeninius buteliukus su vidiniu arba išoriniu sriegiu– Kai kurie universitetai dėl saugumo rekomenduoja buteliukus su vidiniu sriegiu – jie taip pat gali padėti išvengti užteršimo pildant arba laikant skystame azote.
• Užkirsti kelią nuotėkiui- Kad išvengtumėte nuotėkio ir užteršimo, naudokite į užsukamą dangtelį įlietus dvigubo įpurškimo sandariklius arba O formos žiedus.
• Naudokite 2D brūkšninius kodus ir etiketes buteliukams– siekiant užtikrinti atsekamumą, buteliukai su dideliais rašymo plotais leidžia tinkamai paženklinti kiekvieną buteliuką. 2D brūkšniniai kodai gali padėti valdyti sandėliavimą ir registruoti. Spalvomis koduoti dangteliai yra naudingi, kad būtų lengviau identifikuoti.
• Tinkama sandėliavimo priežiūra- Siekiant užtikrinti, kad ląstelės nebūtų prarastos, saugojimo induose turėtų būti nuolat stebima temperatūra ir skysto azoto lygis. Turėtų būti įrengti signalizacijos įtaisai, įspėjantys naudotojus apie klaidas.

Saugos priemonės

Skystas azotas tapo įprasta šiuolaikinių tyrimų praktika, tačiau netinkamai naudojamas kelia rimtų sužalojimų riziką.

Dirbant su skystu azotu, reikia dėvėti tinkamas asmenines apsaugos priemones (AAP), kad būtų sumažinta nušalimų, nudegimų ir kitų nepageidaujamų incidentų rizika.

• Kriogeninės pirštinės
• Laboratorinis chalatas
• Smūgiams atsparus viso veido skydelis, dengiantis ir kaklą
• Uždari batai
• Apsauga nuo vandens purslų plastikinė prijuostė

Skysto azoto šaldytuvus reikia laikyti gerai vėdinamose vietose, kad būtų sumažinta uždusimo rizika – išbėgęs azotas išgaruoja ir išstumia atmosferos deguonį. Didelio tūrio sandėliuose turėtų būti įrengtos žemo deguonies lygio signalizacijos sistemos.

Dirbant su skystu azotu idealu dirbti poromis, o jo naudojimas ne įprastu darbo laiku turėtų būti draudžiamas.

Kriogeniniai buteliukai jūsų darbo eigai palengvinti

„Suzhou Ace Biomedical“ įmonė siūlo platų produktų asortimentą, atitinkantį jūsų kriokonservavimo poreikius įvairių tipų ląstelėms. Portfelyje yra įvairių mėgintuvėlių ir sterilių kriogeninių buteliukų.

Mūsų kriogeniniai buteliukai yra:

• Laboratorinis užsukamas dangtelis 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kriogeniniai buteliukai su kūginiu dugnu ir kriogeniniu vamzdeliu su tarpikliu

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml specifikacija, su sijonu arba be sijono
  ● Yra kūginės arba savarankiškai stovinčios konstrukcijos, sterilios arba nesterilios
  ● Vamzdeliai su užsukamais dangteliais pagaminti iš medicininės kokybės polipropileno
  ● PP kriotube buteliukus galima pakartotinai užšaldyti ir atšildyti
  ● Išorinio dangtelio konstrukcija gali sumažinti užteršimo tikimybę mėginio apdorojimo metu.
  ● Kriogeniniai mėgintuvėliai su užsukamais dangteliais Universalūs sriegiai
  ● Vamzdžiai tinka daugumai įprastų rotorių
  ● Kriogeniniai vamzdeliai su sandarinimo žiedu tinka standartinėms 1 colio ir 2 colių, 48 šulinėlių, 81 šulinėlio, 96 šulinėlių ir 100 šulinėlių šaldymo dėžėms
  ● Galima autoklavuoti iki 121 °C ir užšaldyti iki -86 °C

  DALIES NR.	MEDŽIAGA	TŪRIS	BŽŪPSPALVA	Vnt./MAIŠAS	KREPŠIAI/DĖKLAS
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Juoda, geltona, mėlyna, raudona, violetinė, balta	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Juoda, geltona, mėlyna, raudona, violetinė, balta	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Juoda, geltona, mėlyna, raudona, violetinė, balta	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Juoda, geltona, mėlyna, raudona, violetinė, balta	500	10