קריובקבוקוניםמשמשים בדרך כלל לאחסון קריוגני של שורות תאים וחומרים ביולוגיים קריטיים אחרים, במיכלי דיואר מלאים בחנקן נוזלי.

ישנם מספר שלבים המעורבים בשימור מוצלח של תאים בחנקן נוזלי. בעוד שהעיקרון הבסיסי הוא הקפאה איטית, הטכניקה המדויקת המופעלת תלויה בסוג התא ובחומר ההקפאה בו נעשה שימוש. ישנם מספר שיקולי בטיחות ושיטות עבודה מומלצות שיש לקחת בחשבון בעת ​​אחסון תאים בטמפרטורות כה נמוכות.

פוסט זה נועד לתת סקירה כללית של אופן אחסון בקבוקוני קריוגניים בחנקן נוזלי.

מהם בקבוקוני קריו

קריובקבוקונים הם בקבוקונים קטנים עם מכסה, המיועדים לאחסון דגימות נוזליות בטמפרטורות נמוכות במיוחד. הם מבטיחים שתאים השמורים בחומר קריופרוטקטיב לא יבואו במגע ישיר עם החנקן הנוזלי, ובכך ממזערים את הסיכון לשברים תאיים ועדיין נהנים מאפקט הקירור הקיצוני של חנקן נוזלי.

הבקבוקונים זמינים בדרך כלל במגוון נפחים ועיצובים - הם יכולים להיות בעלי הברגה פנימית או חיצונית עם תחתית שטוחה או מעוגלת. קיימים גם פורמטים סטריליים ולא סטריליים.

מי משתמשסירוביאליםלאחסן תאים בחנקן נוזלי

מגוון מעבדות של שירות הבריאות הלאומי (NHS) ומעבדות פרטיות, כמו גם מוסדות מחקר המתמחים בבנקאות דם טבורי, ביולוגיה של תאי אפיתל, אימונולוגיה וביולוגיה של תאי גזע, משתמשים בבקבוקונים בקריוגניה לשימור תאים בהקפאה.

תאים המשומרים בדרך זו כוללים תאי B ו-T, תאי CHO, תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים, היברידומה, תאי מעיים, מקרופאגים, תאי גזע ותאי אב מזנכימליים, מונוציטים, מיאלומה, תאי NK ותאי גזע פלוריפוטנטיים.

סקירה כללית של אופן אחסון בקבוקוני קריו בחנקן נוזלי

קריוגפרור הוא תהליך המשמר תאים ומבנים ביולוגיים אחרים על ידי קירורם לטמפרטורות נמוכות מאוד. ניתן לאחסן תאים בחנקן נוזלי במשך שנים מבלי לאבד את כדאיות התא. זהו סקירה של ההליכים המועסקים.

הכנת תאים

השיטה המדויקת להכנת דגימות תשתנה בהתאם לסוג התא, אך באופן כללי, התאים נאספים וצנטריפוגות כדי לפתח גלולה עשירה בתאים. לאחר מכן גלולה זו מושעית מחדש בסופרנטנט מעורבב עם חומר קריוגן או מצע קריוגני.

מדיום קריוגני

מצע זה משמש לשימור תאים בסביבות הטמפרטורה הנמוכה להן הם יהיו נתונים, על ידי עיכוב היווצרות גבישים תוך-תאיים וחוץ-תאיים, ולכן עיכוב מוות תאי. תפקידם לספק סביבה בטוחה ומגנה לתאים ולרקמות במהלך תהליכי ההקפאה, האחסון וההפשרה.

מצע כגון פלזמה טרייה קפואה (FFP), תמיסת פלסמליט שעברה הפרין או תמיסות ללא סרום וללא רכיבים מן החי מעורבב עם חומרים קריופרוטקטיבים כגון דימתיל סולפוקסיד (DMSO) או גליצרול.

גלולת הדגימה שעברה נוזל מחדש מחולקת לתוך קריובקבוקונים מפוליפרופילן כגוןבקבוקוני אחסון קריוגניים של חברת Suzhou Ace Biomedical.

חשוב לא למלא את הבקבוקונים הקריו יתר על המידה, שכן הדבר יגביר את הסיכון לסדקים ולשחרור אפשרי של התכולה (1).

קצב הקפאה מבוקר

באופן כללי, קצב הקפאה איטי ומבוקר משמש לשימור קריוגני מוצלח של תאים.

לאחר שהדגימות מחולקות לבקבוקונים קריוגניים, הן מונחות על קרח רטוב או במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ותהליך ההקפאה מתחיל תוך 5 דקות. ככלל, התאים מקוררים בקצב של -1 עד -3 לדקה (2). זה מושג באמצעות מקרר הניתן לתכנות או על ידי הנחת הבקבוקונים בקופסה מבודדת הממוקמת במקפיא בקצב מבוקר של -70°C עד -90°C.

העברה לחנקן נוזלי

לאחר מכן, הבקבוקונים הקריוגניים הקפואים מועברים למיכל חנקן נוזלי לתקופות בלתי מוגבלות, בתנאי שנשמרת טמפרטורה של פחות מ-135- מעלות צלזיוס.

ניתן להשיג טמפרטורות נמוכות במיוחד אלו על ידי טבילה בחנקן בפאזה נוזלית או אדית.

שלב נוזלי או אדים?

אחסון בחנקן בפאזה נוזלית ידוע כגורם לשמירת טמפרטורה קרה עקבית לחלוטין, אך לרוב אינו מומלץ מהסיבות הבאות:

• הצורך בכמויות גדולות (לעומק) של חנקן נוזלי, המהווה סכנה פוטנציאלית. כוויות או חנק כתוצאה מכך מהווים סיכון ממשי.
• מקרים מתועדים של זיהום צולב על ידי גורמים זיהומיים כגון אספרגילוס, הפטיטיס B והתפשטות נגיפית דרך מצע חנקן נוזלי (2,3)
• האפשרות לדליפת חנקן נוזלי לתוך הבקבוקונים במהלך ההטמעה. כאשר מוציאים אותו מהאחסון ומחממים אותו לטמפרטורת החדר, החנקן מתרחב במהירות. כתוצאה מכך, הבקבוקון עלול להתנפץ בעת הוצאתו מאחסון החנקן הנוזלי, מה שיוצר סכנה הן מפסולת מעופפת והן מחשיפה לתוכן (1, 4).

מסיבות אלה, אחסון בטמפרטורה נמוכה במיוחד הוא לרוב בחנקן בפאזה אדים. כאשר יש לאחסן דגימות בפאזה נוזלית, יש להשתמש בצינורות קריופלקס ייעודיים.

החיסרון של פאזה אדית הוא שיכול להתרחש גרדיאנט טמפרטורה אנכי וכתוצאה מכך תנודות טמפרטורה בין -135℃ ל- -190℃. זה מחייב ניטור קפדני וחרוץ של רמות החנקן הנוזלי ושינויי הטמפרטורה (5).

יצרנים רבים ממליצים כי קריו-בקבוקונים יתאימו לאחסון עד 135- מעלות צלזיוס או לשימוש בשלב אדים בלבד.

הפשרת תאים קריוגניים

תהליך ההפשרה מלחיץ עבור תרבית קפואה, ונדרשים טיפול וטכניקה נכונים כדי להבטיח את הישרדות, ההתאוששות והתפקוד האופטימליים של התאים. פרוטוקולי ההפשרה המדויקים יהיו תלויים בסוגי תאים ספציפיים. עם זאת, הפשרה מהירה נחשבת לסטנדרט כדי:

• הפחת כל השפעה על התאוששות תאית
• סייע בהפחתת זמן החשיפה למומסים הקיימים במדיה ההקפאה
• מזעור כל נזק על ידי התגבשות מחדש של קרח

אמבטיות מים, אמבטיות חרוזים או מכשירים אוטומטיים מיוחדים משמשים בדרך כלל להפשרת דגימות.

לרוב מופשרים שורת תאים אחת בכל פעם למשך 1-2 דקות, על ידי ערבוב עדין באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שנותר רק מעט קרח בבקבוקון לפני ששטופם במצע גידול מחומם מראש.

עבור תאים מסוימים, כמו עוברים של יונקים, התחממות איטית חיונית להישרדותם.

התאים מוכנים כעת לתרבית תאים, בידוד תאים, או במקרה של תאי גזע המטופויאטיים - מחקרי כדאיות כדי להבטיח את שלמות תאי הגזע של התורם לפני טיפול מיאלואבלטיבי.

מקובל לקחת מנות קטנות של הדגימה שנשטפה מראש, המשמשות לביצוע ספירת תאים, כדי לקבוע את ריכוזי התאים לצורך ציפוי בתרבית. לאחר מכן ניתן להעריך את תוצאות הליכי בידוד התאים ולקבוע את כדאיות התאים.

שיטות עבודה מומלצות לאחסון בקבוקוני קריו

שימור קריוגני מוצלח של דגימות המאוחסנות בקריובקבוקונים תלוי באלמנטים רבים בפרוטוקול, כולל אחסון נאות ותיעוד.

• פיצול תאים בין מיקומי אחסון– אם הנפחים מאפשרים זאת, יש לפצל את התאים בין הבקבוקונים ולאחסן אותם במקומות נפרדים כדי להפחית את הסיכון לאובדן דגימה עקב תקלות בציוד.
• מניעת זיהום צולב- בחרו בקבוקונים קריוגניים סטריליים חד פעמיים או אוטוקלאב לפני השימוש הבא
• השתמשו בבקבוקונים בגודל מתאים לתאים שלכם– בקבוקונים מגיעים בטווח נפחים שבין 1 ל-5 מ"ל. יש להימנע ממילוי יתר של הבקבוקונים כדי להפחית את הסיכון לסדקים.
• בחר בקבוקונים קריוגניים עם הברגה פנימית או חיצונית– בקבוקונים עם הברגה פנימית מומלצים על ידי חלק מהאוניברסיטאות לאמצעי בטיחות – הם יכולים גם למנוע זיהום במהלך המילוי או בעת אחסון בחנקן נוזלי.
• מניעת דליפה- השתמשו באטמים המוזרקים ביניהן לתוך מכסה ההברגה או טבעות ה-O כדי למנוע דליפה וזיהום.
• השתמשו בברקודים דו-ממדיים ותייגו בקבוקונים– כדי להבטיח עקיבות, בקבוקונים עם שטחי כתיבה גדולים מאפשרים סימון הולם של כל בקבוקון. ברקודים דו-ממדיים יכולים לסייע בניהול אחסון ובשמירת רישומים. מכסים מקודדים בצבע שימושיים לזיהוי קל יותר.
• תחזוקת אחסון נאותה- כדי להבטיח שלא יאבדו תאים, כלי האחסון צריכים לנטר באופן קבוע את הטמפרטורה ורמות החנקן הנוזלי. יש להתקין אזעקות כדי להתריע למשתמשים על שגיאות.

אמצעי בטיחות

חנקן נוזלי הפך לנוהג נפוץ במחקר מודרני אך טומן בחובו סיכון לפציעה חמורה אם נעשה בו שימוש שגוי.

יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים כדי למזער את הסיכון לכוויות קור, כוויות ואירועים שליליים אחרים בעת טיפול בחנקן נוזלי.

• כפפות קריוגניות
• מעיל מעבדה
• מגן פנים מלא עמיד בפני פגיעות המכסה גם את הצוואר
• נעליים סגורות
• סינר פלסטיק עמיד בפני התזות

יש למקם מקררי חנקן נוזלי באזורים מאווררים היטב כדי למזער את הסיכון לחנק - חנקן שבולט מתאדה ודוחק חמצן אטמוספרי. במחסנים גדולים יש להתקין מערכות אזעקה של רמת חמצן נמוכה.

עבודה בזוגות בעת טיפול בחנקן נוזלי היא אידיאלית ויש לאסור את השימוש בו מחוץ לשעות העבודה הרגילות.

קריובקבוקונים לתמיכה בזרימת העבודה שלך

חברת Suzhou Ace Biomedical מציעה מגוון רחב של מוצרים העונים על צרכי ההקפאה שלכם עבור סוגים שונים של תאים. תיק המוצרים כולל מגוון צינורות וכן מגוון בקבוקוני קריו סטריליים.

הקריובקבוקונים שלנו הם:

• מכסה הברגה למעבדה 0.5 מ"ל 1.5 מ"ל 2.0 מ"ל בקבוקוני קריוגניים קריוגניים עם תחתית חרוטית ואטם

  ● מפרט 0.5 מ"ל, 1.5 מ"ל, 2.0 מ"ל, עם חצאית או בלי חצאית
  ● עיצוב חרוטי או עומד עצמאי, זמין גם בעיצוב סטרילי וגם בעיצוב לא סטרילי
  ● צינורות בורג עשויים מפוליפרופילן ברמה רפואית
  ● ניתן להקפיא ולהפשיר בקבוקוני קריוטוב PP שוב ושוב
  ● עיצוב המכסה החיצוני יכול להפחית את הסתברות הזיהום במהלך טיפול בדגימה.
  ● צינורות קריוגניים עם מכסה הברגה, הברגות אוניברסליות לשימוש
  ● צינורות מתאימים לרוב הרוטורים הנפוצים
  ● צינורות O-ring של צינור קריוגני מתאימים לקופסאות הקפאה סטנדרטיות בגודל 1 אינץ' ו-2 אינץ', 48 בארות, 81 בארות, 96 בארות ו-100 בארות
  ● ניתן לאוטוקלב עד 121°C ולהקפאה עד -86°C

  מספר חלק	חוֹמֶר	כֶּרֶך	כּוֹבַעצֶבַע	יחידות/תִיק	תיקים/נרתיק
  ACT05-BL-N	PP	0.5 מ"ל	שחור, צהוב, כחול, אדום, סגול, לבן	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5 מ"ל	שחור, צהוב, כחול, אדום, סגול, לבן	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5 מ"ל	שחור, צהוב, כחול, אדום, סגול, לבן	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0 מ"ל	שחור, צהוב, כחול, אדום, סגול, לבן	500	10