KriofiolákÁltalában sejtvonalak és más kritikus biológiai anyagok kriogén tárolására használják folyékony nitrogénnel töltött Dewar-tartályokban.

A sejtek folyékony nitrogénben történő sikeres tartósítása több szakaszból áll. Bár az alapelv a lassú fagyasztás, az alkalmazott pontos technika a sejttípustól és a használt krioprotektánstól függ. Számos biztonsági szempontot és bevált gyakorlatot kell figyelembe venni a sejtek ilyen alacsony hőmérsékleten történő tárolásakor.

Ez a bejegyzés áttekintést nyújt arról, hogyan tárolják a kriofillumokat folyékony nitrogénben.

Mik azok a kriofóliák?

A kriofóliák kicsi, kupakkal ellátott fiolák, amelyeket folyékony minták rendkívül alacsony hőmérsékleten történő tárolására terveztek. Biztosítják, hogy a krioprotektánsban tartósított sejtek ne érintkezzenek közvetlenül a folyékony nitrogénnel, minimalizálva a sejttörések kockázatát, miközben továbbra is élvezhetik a folyékony nitrogén extrém hűtőhatását.

A fiolák általában különböző térfogatokban és kivitelekben kaphatók – lehetnek belső vagy külső menetesek, lapos vagy lekerekített aljúak. Steril és nem steril formátumok is kaphatók.

Ki használjaCyrovialssejtek folyékony nitrogénben történő tárolására

Számos NHS és magánlaboratórium, valamint köldökzsinórvérbankra, hámsejtbiológiára, immunológiára és őssejtbiológiára szakosodott kutatóintézet használ kriokonzervációs fiolákat a sejtek krioprezerválására.

Az így tartósított sejtek közé tartoznak a B- és T-sejtek, a CHO-sejtek, a vérképző ős- és progenitor sejtek, a hibridómák, a bélsejtek, a makrofágok, a mezenchimális ős- és progenitor sejtek, a monociták, a mielóma, az NK-sejtek és a pluripotens őssejtek.

A kriofillumok folyékony nitrogénben történő tárolásának áttekintése

A krioprezerváció egy olyan eljárás, amely sejteket és más biológiai konstrukciókat tartósít nagyon alacsony hőmérsékletre hűtve. A sejtek évekig tárolhatók folyékony nitrogénben életképességük elvesztése nélkül. Ez az alkalmazott eljárások vázlata.

Sejtelőkészítés

A minták előkészítésének pontos módszere a sejttípustól függően változik, de általában a sejteket összegyűjtik és centrifugálják, hogy sejtben gazdag pelletet hozzanak létre. Ezt a pelletet ezután krioprotektánssal vagy krioprezervációs közeggel összekevert felülúszóban reszuszpendálják.

Krioprezervációs közeg

Ezt a táptalajt arra használják, hogy megőrizzék a sejteket az alacsony hőmérsékletű környezetben, amelynek ki lesznek téve, azáltal, hogy gátolják az intra- és extracelluláris kristályok képződését, és ezáltal a sejthalált. Szerepük, hogy biztonságos, védő környezetet biztosítsanak a sejtek és szövetek számára a fagyasztási, tárolási és felolvasztási folyamatok során.

Egy közeget, például frissen fagyasztott plazmát (FFP), heparinizált plazmalit oldatot vagy szérummentes, állati komponensektől mentes oldatokat krioprotektánsokkal, például dimetil-szulfoxiddal (DMSO) vagy glicerinnel kevernek.

Az újrafolyékonnyá tett mintapelletet polipropilén kriokonténerekbe osztják, mint példáulSuzhou Ace Biomedical Company kriogén tároló fiolák.

Fontos, hogy ne töltsük túl a kriokonténereket, mivel ez növeli a repedés és a tartalom esetleges kiömlésének kockázatát (1).

Szabályozott fagyasztási sebesség

A sejtek sikeres krioprezerválásához általában lassú, szabályozott fagyasztási sebességet alkalmaznak.

Miután a mintákat kriogén fiolákba osztották, nedves jégre vagy 4 °C-os hűtőszekrénybe helyezik, és 5 percen belül megkezdik a fagyasztási eljárást. Általános irányelvként a sejteket percenként -1 és -3 közötti sebességgel hűtik (2). Ezt programozható hűtővel vagy a fiolák szigetelt dobozba helyezésével, -70 °C és -90 °C közötti szabályozott sebességű fagyasztóba helyezésével érik el.

Átvitel folyékony nitrogénbe

A fagyasztott kriogén fiolákat ezután határozatlan időre folyékony nitrogénes tartályba helyezik, feltéve, hogy a hőmérsékletet -135 ℃ alatt tartják.

Ezek az ultra alacsony hőmérsékletek folyékony vagy gőzfázisú nitrogénbe merítéssel érhetők el.

Folyékony vagy gőzfázisú?

A folyékony fázisú nitrogénben történő tárolás köztudottan abszolút állandó hideg hőmérsékletet biztosít, de a következő okok miatt gyakran nem ajánlott:

• A nagy mennyiségű (mély) folyékony nitrogén szükségessége potenciális veszélyt jelent. Az égési sérülések vagy a fulladás valós kockázatot jelent.
• Dokumentált keresztszennyeződési esetek fertőző ágensekkel, például Aspergillusszal, hepatitis B-vel és vírusterjedéssel folyékony nitrogénes közegben (2,3)
• A folyékony nitrogén szivároghat a fiolákba merítés közben. Amikor a nitrogént kiveszik a tárolóból és szobahőmérsékletre melegítik, gyorsan kitágul. Következésképpen a fiola eltörhet, amikor kiveszik a folyékony nitrogénes tárolóból, ami veszélyt jelent mind a repülő törmelék, mind a tartalommal való érintkezés miatt (1, 4).

Ezen okok miatt az ultra alacsony hőmérsékletű tárolás leggyakrabban gőzfázisú nitrogénben történik. Ha a mintákat folyékony fázisban kell tárolni, speciális krioflex csöveket kell használni.

A gőzfázis hátránya, hogy függőleges hőmérsékleti gradiens léphet fel, ami -135 ℃ és -190 ℃ közötti hőmérséklet-ingadozást eredményez. Ez szükségessé teszi a folyékony nitrogén szintjének és a hőmérséklet-ingadozások gondos és körültekintő monitorozását (5).

Sok gyártó azt javasolja, hogy a kriogenikus fiolák -135 ℃-ig történő tárolásra vagy csak gőzfázisú használatra alkalmasak.

A kriokonzervált sejtek felolvasztása

A felolvasztás folyamata stresszes a fagyasztott tenyészet számára, és megfelelő kezelés és technika szükséges a sejtek optimális életképességének, kinyerésének és funkcionalitásának biztosításához. A pontos felolvasztási protokollok az adott sejttípustól függenek. A gyors felolvasztás azonban a következőkhöz tekinthető szabványosnak:

• Csökkenti a sejtek regenerálódására gyakorolt ​​​​hatást
• Segít csökkenteni a fagyasztóközegben lévő oldott anyagoknak való kitettség idejét
• Minimalizálja a jég átkristályosodása okozta károkat

A minták felolvasztásához általában vízfürdőket, gyöngyfürdőket vagy speciális automatizált eszközöket használnak.

Leggyakrabban egy sejtvonalat olvasztanak fel egyszerre 1-2 percig, 37℃-os vízfürdőben óvatosan örvénylő mozdulatokkal, amíg már csak egy kis jég marad a fiolában, mielőtt előmelegített növekedési táptalajban lemosnák őket.

Egyes sejtek, például az emlős embriók számára a lassú felmelegedés elengedhetetlen a túlélésükhöz.

A sejtek most már készen állnak a sejtkultúrára, a sejtek izolálására, vagy – vérképző őssejtek esetében – az életképességi vizsgálatokra, amelyek garantálják a donor őssejtek integritását a mieloablatív terápia előtt.

Bevett gyakorlat, hogy a sejtszámlálás elvégzéséhez előmosott mintából kis alikvotokat vesznek, hogy meghatározzák a tenyészetben történő alkalmazáshoz szükséges sejtkoncentrációkat. Ezután értékelheti a sejtizolálási eljárások eredményeit, és meghatározhatja a sejtek életképességét.

A kriofiolák tárolásának legjobb gyakorlatai

A kriokonzervátumokban tárolt minták sikeres krioprezerválása a protokoll számos elemétől függ, beleértve a megfelelő tárolást és a nyilvántartást.

• Cellák felosztása a tárolási helyek között– Ha a térfogat engedi, ossza szét a sejteket a fiolák között, és tárolja őket külön helyeken, hogy csökkentse a berendezés meghibásodása miatti mintaveszteség kockázatát.
• Keresztszennyeződés megelőzése– Válasszon egyszer használatos steril kriogén fiolákat, vagy autoklávozza azokat a későbbi használat előtt
• Használjon megfelelő méretű fiolákat a sejtjeihez– az üvegcsék 1 és 5 ml közötti térfogatban kaphatók. Kerülje az üvegcsék túltöltését a repedés kockázatának csökkentése érdekében.
• Válasszon belső vagy külső menetes kriogén fiolákat– Egyes egyetemek biztonsági okokból belső menetes fiolákat ajánlanak – ezek megakadályozhatják a szennyeződést töltés vagy folyékony nitrogénben való tárolás során is.
• Szivárgás megelőzése- Használjon kétszeresen befecskendezett tömítéseket, amelyeket a csavaros kupakba vagy O-gyűrűkbe öntöttek a szivárgás és a szennyeződés megakadályozása érdekében.
• Használjon 2D vonalkódokat és címkézze a fiolákat– a nyomonkövethetőség biztosítása érdekében a nagy írófelülettel ellátott fiolák lehetővé teszik az egyes fiolák megfelelő címkézését. A 2D vonalkódok segíthetnek a tárolás kezelésében és a nyilvántartásban. A színkóddal ellátott kupakok hasznosak a könnyebb azonosítás érdekében.
• Megfelelő tárolási karbantartás- A sejtek elvesztésének elkerülése érdekében a tárolóedényekben folyamatosan ellenőrizni kell a hőmérsékletet és a folyékony nitrogén szintjét. Riasztókat kell felszerelni, amelyek figyelmeztetni kell a felhasználókra a hibák esetén.

Biztonsági óvintézkedések

A folyékony nitrogén a modern kutatásban bevett gyakorlattá vált, de helytelen használat esetén súlyos sérülés kockázatát hordozza magában.

A fagyási sérülések, égési sérülések és egyéb kellemetlenségek kockázatának minimalizálása érdekében megfelelő személyi védőfelszerelést (PPE) kell viselni folyékony nitrogén kezelése során.

• Kriogén kesztyűk
• Laboratóriumi köpeny
• Ütésálló, teljes arcvédő, amely a nyakat is takarja
• Zárt orrú cipők
• Fröccsenésálló műanyag kötény

A folyékony nitrogénes hűtőszekrényeket jól szellőző helyen kell elhelyezni a fulladásveszély minimalizálása érdekében – a kiáramló nitrogén elpárolog és kiszorítja a légköri oxigént. A nagy térfogatú raktárakban alacsony oxigénszint esetén riasztórendszert kell felszerelni.

A folyékony nitrogén kezelésekor ideális a páros munkavégzés, és a szokásos munkaidőn kívüli használatát meg kell tiltani.

Kriofiolák a munkafolyamat támogatására

A Suzhou Ace Biomedical vállalat széles választékban kínál termékeket, amelyek megfelelnek a különböző típusú sejtek krioprezervációs igényeinek. A portfólió csőválasztékot és steril kriofiolák széles választékát tartalmazza.

Kriokonténereink a következők:

• Laboratóriumi csavaros kupak 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kriogén fiolák kúpos aljú kriogén cső tömítéssel

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml specifikáció, szoknyával vagy szoknya nélkül
  ● Kúpos vagy önálló kialakítás, steril vagy nem steril változatban is kapható
  ● A csavaros kupakos tubusok orvosi minőségű polipropilénből készülnek
  ● A PP kriotubulus fiolák ismételten fagyaszthatók és felolvaszthatók
  ● A külső kupak kialakítása csökkentheti a szennyeződés valószínűségét a minta kezelése során.
  ● Csavaros tetejű kriogén csövek Univerzális menetes használatra
  ● A csövek a leggyakoribb rotorokhoz illeszkednek
  ● A kriogén cső o-gyűrűs csövek szabványos 1 hüvelykes és 2 hüvelykes, 48 ​​lyukú, 81 lyukú, 96 lyukú és 100 lyukú fagyasztódobozokhoz illeszkednek
  ● 121°C-ig autoklávozható és -86°C-ig fagyasztható

  ALKATRÉSZSZÁM	ANYAG	KÖTET	SAPKASZÍN	DB/TÁSKA	TÁSKÁK/DOBOZ
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Fekete, sárga, kék, piros, lila, fehér	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Fekete, sárga, kék, piros, lila, fehér	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Fekete, sárga, kék, piros, lila, fehér	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Fekete, sárga, kék, piros, lila, fehér	500	10