Kriovialese obično koriste za kriogeno skladištenje staničnih linija i drugih kritičnih bioloških materijala u Dewarovim posudama napunjenim tekućim dušikom.

Postoji nekoliko faza uspješnog očuvanja stanica u tekućem dušiku. Iako je osnovni princip sporo zamrzavanje, točna tehnika koja se koristi ovisi o vrsti stanica i korištenom krioprotektantu. Postoji nekoliko sigurnosnih razmatranja i najboljih praksi koje treba uzeti u obzir pri skladištenju stanica na tako niskim temperaturama.

Ovaj članak ima za cilj dati pregled načina skladištenja krioviala u tekućem dušiku.

Što su krioviale

Krioviale su male, zatvorene bočice dizajnirane za pohranjivanje tekućih uzoraka na izuzetno niskim temperaturama. Osiguravaju da stanice sačuvane u krioprotektantu ne dođu u izravan kontakt s tekućim dušikom, minimizirajući rizik od staničnih lomova, a istovremeno iskorištavajući ekstremni rashladni učinak tekućeg dušika.

Bočice su obično dostupne u različitim volumenima i dizajnima – mogu imati unutarnji ili vanjski navoj s ravnim ili zaobljenim dnom. Dostupni su i sterilni i nesterilni formati.

Tko koristiCyrovialsza pohranu stanica u tekućem dušiku

Niz NHS i privatnih laboratorija, kao i istraživačke institucije specijalizirane za pohranu krvi iz pupkovine, biologiju epitelnih stanica, imunologiju i biologiju matičnih stanica koriste kriobočice za krioprezervaciju stanica.

Stanice konzervirane na ovaj način uključuju B i T stanice, CHO stanice, hematopoetske matične i progenitorske stanice, hibridome, crijevne stanice, makrofage, mezenhimalne matične i progenitorske stanice, monocite, mijelom, NK stanice i pluripotentne matične stanice.

Pregled načina skladištenja krioviala u tekućem dušiku

Krioprezervacija je proces kojim se stanice i drugi biološki konstrukti čuvaju hlađenjem na vrlo niske temperature. Stanice se mogu čuvati u tekućem dušiku godinama bez gubitka stanične održivosti. Ovo je pregled korištenih postupaka.

Priprema stanica

Točna metoda pripreme uzoraka varirat će ovisno o vrsti stanice, ali općenito se stanice skupljaju i centrifugiraju kako bi se razvio talog bogat stanicama. Ovaj se talog zatim resuspendira u supernatantu pomiješanom s krioprotektantom ili medijem za krioprezervaciju.

Medij za krioprezervaciju

Ovaj medij se koristi za očuvanje stanica u uvjetima niskih temperatura kojima će biti izložene inhibiranjem stvaranja intra- i ekstracelularnih kristala i time stanične smrti. Njihova je uloga osigurati sigurno, zaštitno okruženje za stanice i tkiva tijekom procesa zamrzavanja, skladištenja i odmrzavanja.

Medij poput svježe smrznute plazme (FFP), otopine hepariniziranog plazmalita ili otopina bez seruma i životinjskih komponenti pomiješa se s krioprotektantima poput dimetilsulfoksida (DMSO) ili glicerola.

Ponovno ukapljeni uzorak peleta se alikvotira u polipropilenske krioepruvete kao što suSuzhou Ace Biomedical company kriogene bočice za skladištenje.

Važno je ne prepuniti kriobočice jer će to povećati rizik od pucanja i mogućeg ispuštanja sadržaja (1).

Kontrolirana stopa smrzavanja

Općenito, za uspješnu krioprezervaciju stanica koristi se spora kontrolirana brzina smrzavanja.

Nakon što se uzorci alikvotiraju u kriogene bočice, stavljaju se na mokri led ili u hladnjak na 4 ℃, a postupak zamrzavanja započinje unutar 5 minuta. Kao općenita smjernica, stanice se hlade brzinom od -1 do -3 u minuti (2). To se postiže pomoću programabilnog hladnjaka ili stavljanjem bočica u izoliranu kutiju smještenu u zamrzivač s kontroliranom brzinom od -70 °C do -90 °C.

Prijenos u tekući dušik

Zamrznute kriogene bočice se zatim prenose u spremnik tekućeg dušika na neodređeno vrijeme, pod uvjetom da se održava temperatura niža od -135 ℃.

Ove ultraniske temperature mogu se postići uranjanjem u tekući ili plinoviti dušik.

Tekuća ili parna faza?

Poznato je da skladištenje u tekućem dušiku održava hladnu temperaturu apsolutno konzistentno, ali se često ne preporučuje iz sljedećih razloga:

• Potreba za velikim količinama (dubina) tekućeg dušika što predstavlja potencijalnu opasnost. Opekline ili gušenje zbog toga predstavljaju stvarni rizik.
• Dokumentirani slučajevi unakrsne kontaminacije zaraznim uzročnicima poput aspergilusa, hepatitisa B i širenja virusa putem tekućeg dušikovog medija (2,3)
• Mogućnost curenja tekućeg dušika u bočice tijekom uranjanja. Kada se izvadi iz skladišta i zagrije na sobnu temperaturu, dušik se brzo širi. Posljedično, bočica se može razbiti kada se izvadi iz skladišta tekućeg dušika, stvarajući opasnost od letećih krhotina i izloženosti sadržaju (1, 4).

Iz tih razloga, skladištenje na ultraniskim temperaturama najčešće se provodi u plinovitoj fazi dušika. Kada se uzorci moraju pohraniti u tekućoj fazi, treba koristiti specijalizirane kriofleksne cijevi.

Nedostatak parne faze je što se može pojaviti vertikalni temperaturni gradijent koji rezultira temperaturnim fluktuacijama između -135 ℃ i -190 ℃. To zahtijeva pažljivo i marljivo praćenje razine tekućeg dušika i temperaturnih varijacija (5).

Mnogi proizvođači preporučuju da su krioviale prikladne za skladištenje do -135 ℃ ili za upotrebu samo u parnoj fazi.

Odmrzavanje krioprezerviranih stanica

Postupak odmrzavanja je stresan za smrznutu kulturu te je potrebno pravilno rukovanje i tehnika kako bi se osigurala optimalna održivost, oporavak i funkcionalnost stanica. Točni protokoli odmrzavanja ovisit će o specifičnim vrstama stanica. Međutim, brzo odmrzavanje smatra se standardnim za:

• Smanjite bilo kakav utjecaj na oporavak stanica
• Pomaže u smanjenju vremena izloženosti otopljenim tvarima prisutnim u mediju za zamrzavanje
• Minimizirajte bilo kakvu štetu uzrokovanu rekristalizacijom leda

Za odmrzavanje uzoraka obično se koriste vodene kupelji, kupelji s kuglicama ili specijalizirani automatizirani instrumenti.

Najčešće se odmrzava jedna stanična linija odjednom tijekom 1-2 minute, laganim miješanjem u vodenoj kupelji na 37 ℃ dok u bočici ne ostane samo malo leda prije nego što se isperu u prethodno zagrijanom mediju za rast.

Za neke stanice poput embrija sisavaca, sporo zagrijavanje je ključno za njihov opstanak.

Stanice su sada spremne za staničnu kulturu, izolaciju stanica ili, u slučaju hematopoetskih matičnih stanica – studije održivosti kako bi se jamčio integritet matičnih stanica donora prije mijeloablativne terapije.

Uobičajena je praksa uzimati male alikvote prethodno opranog uzorka koji se koristi za brojanje stanica kako bi se odredile koncentracije stanica za nasađivanje u kulturu. Zatim možete procijeniti rezultate postupaka izolacije stanica i odrediti održivost stanica.

Najbolje prakse za skladištenje krioviala

Uspješna krioprezervacija uzoraka pohranjenih u kriovialama ovisi o mnogim elementima protokola, uključujući pravilno skladištenje i vođenje evidencije.

• Podijelite ćelije između lokacija za pohranu– Ako volumeni dopuštaju, razdijelite ćelije između bočica i pohranite ih na odvojenim mjestima kako biste smanjili rizik od gubitka uzorka zbog kvarova opreme.
• Spriječite unakrsnu kontaminaciju– Prije sljedeće upotrebe odaberite sterilne kriogene bočice za jednokratnu upotrebu ili autoklavirajte
• Koristite bočice odgovarajuće veličine za svoje stanice– bočice dolaze u rasponu volumena između 1 i 5 ml. Izbjegavajte prepunjavanje bočica kako biste smanjili rizik od pucanja.
• Odaberite kriogene bočice s unutarnjim ili vanjskim navojem– Neka sveučilišta preporučuju bočice s unutarnjim navojem iz sigurnosnih razloga – one također mogu spriječiti kontaminaciju tijekom punjenja ili skladištenja u tekućem dušiku.
• Spriječite curenje- Koristite dvostruko ubrizgane brtve ulivene u navojni čep ili O-prstenove kako biste spriječili curenje i kontaminaciju.
• Koristite 2D barkodove i označite bočice– kako bi se osigurala sljedivost, bočice s velikim površinama za pisanje omogućuju odgovarajuće označavanje svake bočice. 2D barkodovi mogu pomoći u upravljanju skladištenjem i vođenju evidencije. Čepovi s kodovima u boji korisni su za lakšu identifikaciju.
• Adekvatno održavanje skladišta- Kako bi se osiguralo da se stanice ne izgube, u posudama za skladištenje treba stalno pratiti temperaturu i razinu tekućeg dušika. Treba postaviti alarme koji će upozoravati korisnike na pogreške.

Sigurnosne mjere opreza

Tekući dušik postao je uobičajena praksa u modernim istraživanjima, ali nosi rizik ozbiljnih ozljeda ako se nepravilno koristi.

Treba nositi odgovarajuću osobnu zaštitnu opremu (OZO) kako bi se smanjio rizik od ozeblina, opeklina i drugih štetnih događaja pri rukovanju tekućim dušikom. Nosite

• Kriogene rukavice
• Laboratorijski ogrtač
• Štitnik za cijelo lice otporan na udarce koji pokriva i vrat
• Cipele sa zatvorenim prstima
• Plastična pregača otporna na prskanje

Hladnjake s tekućim dušikom treba postaviti u dobro prozračene prostore kako bi se smanjio rizik od gušenja – oslobođeni dušik isparava i istiskuje atmosferski kisik. Skladišta velikog volumena trebaju imati alarmne sustave za nisku razinu kisika.

Rad u paru pri rukovanju tekućim dušikom je idealan, a njegova upotreba izvan uobičajenog radnog vremena treba biti zabranjena.

Krioviale za podršku vašem radnom procesu

Tvrtka Suzhou Ace Biomedical nudi širok izbor proizvoda koji zadovoljavaju vaše potrebe za krioprezervacijom različitih vrsta stanica. Portfolio uključuje niz epruveta, kao i niz sterilnih kriobočica.

Naše kriobočice su:

• Laboratorijski navojni čep 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kriovijalne kriogene bočice, kriogene bočice s konusnim dnom, krioepruveta s brtvom

  ● Specifikacija 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, sa suknjicom ili bez suknje
  ● Dostupni su konusni ili samostojeći dizajn, sterilni ili nesterilni
  ● Tube s navojnim čepom izrađene su od polipropilena medicinske kvalitete
  ● PP kriotube bočice mogu se više puta zamrzavati i odmrzavati
  ● Dizajn vanjskog poklopca može smanjiti vjerojatnost kontaminacije tijekom obrade uzorka.
  ● Kriogene epruvete s navojnim čepom Univerzalni navoji za upotrebu
  ● Cijevi odgovaraju većini uobičajenih rotora
  ● Kriogene cijevi s O-prstenovima odgovaraju standardnim kutijama za zamrzavanje od 1 inča i 2 inča, 48, 81, 96 i 100 jažica
  ● Autoklavirabilno do 121 °C i zamrzava se do -86 °C

  BROJ DIJELA	MATERIJAL	VOLUMEN	ZPPBOJA	KOM/VREĆICA	VREĆICE/KUTIJICA
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Crna, žuta, plava, crvena, ljubičasta, bijela	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Crna, žuta, plava, crvena, ljubičasta, bijela	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Crna, žuta, plava, crvena, ljubičasta, bijela	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Crna, žuta, plava, crvena, ljubičasta, bijela	500	10