Kryoflesjeswurde faak brûkt foar de kryogene opslach fan sellinen en oare krityske biologyske materialen, yn dewars fol mei floeibere stikstof.

Der binne ferskate stadia belutsen by it suksesfol behâld fan sellen yn floeibere stikstof. Wylst it basisprinsipe in stadich befriezen is, hinget de krekte technyk dy't brûkt wurdt ôf fan it seltype en it brûkte kryoprotectant. Der binne ferskate feiligensoerwagings en bêste praktiken om rekken mei te hâlden by it opslaan fan sellen by sokke lege temperatueren.

Dizze post hat as doel in oersjoch te jaan fan hoe't kryoflesjes opslein wurde yn floeibere stikstof.

Wat binne kryoflesjes

Kryoflesjes binne lytse, mei in dop ôfsletten fleskes dy't ûntworpen binne foar it opslaan fan floeibere samples by ekstreem lege temperatueren. Se soargje derfoar dat sellen dy't bewarre binne yn kryoprotectant net yn direkt kontakt komme mei de floeibere stikstof, wêrtroch it risiko op sellulêre brekken minimalisearre wurdt, wylst se noch altyd profitearje fan it ekstreme koeljende effekt fan floeibere stikstof.

De fleskes binne meastentiids beskikber yn in ferskaat oan folumes en ûntwerpen - se kinne yntern of ekstern skroefd wurde mei platte of rûne boaiems. Steryle en net-sterile formaten binne ek beskikber.

Wa brûktCyrovialsSellen opslaan yn floeibere stikstof

In ferskaat oan NHS- en partikuliere laboratoaria, lykas ûndersyksynstellingen dy't spesjalisearre binne yn navelstrengbloedbankieren, epitheliale selbiology, immunology en stamselbiology brûke kryoflesjes om sellen te kryopreservearjen.

Sellen dy't op dizze wize bewarre wurde omfetsje B- en T-sellen, CHO-sellen, hematopoëtyske stam- en progenitorsellen, hybridomen, darmsellen, makrofagen, mesenchymale stam- en progenitorsellen, monocyten, myeloom, NK-sellen en pluripotente stamsellen.

Oersjoch fan hoe't jo kryoflesjes yn floeibere stikstof opslaan kinne

Kryopreservaasje is in proses dat sellen en oare biologyske konstruksjes bewarret troch se ôf te koelen nei tige lege temperatueren. Sellen kinne jierrenlang yn floeibere stikstof opslein wurde sûnder ferlies fan sellibbensfetberens. Dit is in oersjoch fan 'e brûkte prosedueres.

Sel tarieding

De krekte metoade foar it tarieden fan samples sil ferskille ôfhinklik fan it seltype, mar yn 't algemien wurde de sellen sammele en sintrifugearre om in selrike pellet te ûntwikkeljen. Dizze pellet wurdt dan opnij suspendearre yn 'e supernatant mingd mei kryoprotectant of in kryopreservaasjemedium.

Kryopreservaasjemedium

Dit medium wurdt brûkt om sellen te behâlden yn 'e lege temperatueromjouwings dêr't se oan bleatsteld wurde troch de foarming fan intra- en ekstrasellulêre kristallen en dus seldea te remmen. Harren rol is om in feilige, beskermjende omjouwing te bieden foar sellen en weefsels tidens de befriezing-, opslach- en ûntdooiingsprosessen.

In medium lykas farsk beferzen plasma (FFP), heparinisearre plasmalyte-oplossing of serumfrije, dierlike komponintfrije oplossingen wurdt mingd mei kryoprotectanten lykas dimethylsulfoksyde (DMSO) of glycerol.

De opnij floeiber makke stekproefpellet wurdt alikwotearre yn polypropyleen kryoflesjes lykasKryogene opslachflessen fan Suzhou Ace Biomedical bedriuw.

It is wichtich om de kryoflesjes net te folle te foljen, om't dit it risiko op barsten en it mooglik frijkommen fan ynhâld fergruttet (1).

Kontrolearre friezesnelheid

Yn 't algemien wurdt in stadich kontroleare friezetempo brûkt foar de suksesfolle kryopreservaasje fan sellen.

Nei't de samples yn kryogene fleskes ferdield binne, wurde se op wiet iis of yn in kuolkast fan 4 ℃ pleatst en wurdt de friezingproseduere binnen 5 minuten begûn. As algemiene rjochtline wurde sellen ôfkuolle mei in snelheid fan -1 oant -3 per minuut (2). Dit wurdt berikt mei in programmeerbere koeler of troch it pleatsen fan fleskes yn in isolearre doaze yn in friezer mei in kontroleare snelheid fan -70 °C oant -90 °C.

Oerdracht nei floeibere stikstof

De beferzen kryogene fleskes wurde dan foar ûnbepaalde perioaden oerbrocht nei in tank mei floeibere stikstof, mits in temperatuer fan minder as -135 ℃ hanthavene wurdt.

Dizze ultra-lege temperatueren kinne wurde berikt troch ûnderdompeling yn 'e floeibere of dampfaze stikstof.

Floeibere of dampfaze?

Opslach yn floeibere stikstoffaze is bekend om de kâlde temperatuer mei absolute konsistinsje te behâlden, mar wurdt faak net oanrikkemandearre om de folgjende redenen:

• De needsaak foar grutte hoemannichten (djipte) floeibere stikstof, wat in potinsjeel gefaar is. Brânwûnen of ferstikking hjirtroch is in echt risiko.
• Dokumentearre gefallen fan krúsbesmetting troch ynfeksjeuze aginten lykas aspergillus, hep B en firale fersprieding fia it floeibere stikstofmedium (2,3)
• De mooglikheid dat floeibere stikstof yn 'e fleskes lekke kin by it ûnderdompeljen. As de stikstof út 'e opslach helle wurdt en op keamertemperatuer opwaarme wurdt, wreidet it rap út. Dêrtroch kin de fleske fersplinterje as er út 'e opslach foar floeibere stikstof helle wurdt, wêrtroch't in gefaar ûntstiet troch sawol fleanend pún as bleatstelling oan 'e ynhâld (1, 4).

Om dizze redenen wurdt opslach by ultra-lege temperatueren meastentiids útfierd yn stikstof yn 'e dampfaze. As samples yn 'e floeibere faze opslein wurde moatte, moatte spesjale kryofleksiebuizen brûkt wurde.

It neidiel fan 'e dampfaze is dat in fertikale temperatuergradiënt foarkomme kin, wat resulteart yn temperatuerfluktuaasjes tusken -135℃ en -190℃. Dit makket soarchfâldige en yngeande kontrôle fan 'e floeibere stikstofnivo's en temperatuerfarianten nedich (5).

In protte fabrikanten advisearje dat kryoflesjes geskikt binne foar opslach oant -135 ℃ of allinich foar gebrûk yn 'e dampfaze.

It ûntdooijen fan jo kryopreservearre sellen

De ûntdooiproseduere is stressfol foar in beferzen kultuer, en juste ôfhanneling en technyk binne fereaske om optimale leefberens, herstel en funksjonaliteit fan 'e sellen te garandearjen. De krekte ûntdooiprotokollen sille ôfhingje fan spesifike seltypen. Fluch ûntdooijen wurdt lykwols as standert beskôge om:

• Ferminderje elke ynfloed op sellulêr herstel
• Helpe de bleatstellingstiid te ferminderjen oan de oploste stoffen dy't oanwêzich binne yn 'e friezingmedia
• Minimalisearje alle skea troch iisrekristallisaasje

Wetterbaden, kraalbaden, of spesjalisearre automatisearre ynstruminten wurde faak brûkt om samples te ûntdooijen.

Meastentiids wurdt 1 selline tagelyk 1-2 minuten ûntdooid, troch se sêft te draaien yn in wetterbad fan 37 ℃ oant der noch mar in lyts bytsje iis yn it fleske oer is foardat se wosken wurde yn in foarferwaarme groeimedium.

Foar guon sellen lykas sûchdierembryo's is stadige opwaarming essensjeel foar har oerlibjen.

De sellen binne no klear foar selkultuer, selisolaasje, of yn it gefal fan hematopoëtyske stamsellen - leefberensstúdzjes om de yntegriteit fan 'e donorstamsellen te garandearjen foar myeloablative terapy.

It is normale praktyk om lytse aliquots te nimmen fan it foarwosken stekproef dat brûkt wurdt om in seltelling út te fieren om selkonsintraasjes te bepalen foar it platjen yn kultuer. Jo kinne dan de resultaten fan selisolaasjeprosedueres beoardielje en de sellibensfetberens bepale.

Bêste praktiken foar it opslaan fan kryoflesjes

De suksesfolle kryopreservaasje fan samples dy't yn kryovialen opslein binne, hinget ôf fan in protte eleminten yn it protokol, ynklusyf juste opslach en registraasje.

• Split sellen tusken opslachlokaasjes– As de folumes it talitte, splits de sellen dan oer de fleskes en bewarje se op aparte lokaasjes om it risiko op ferlies fan stekproef troch apparatuerfalen te ferminderjen.
• Foarkom krúsbesmetting– Kies foar ienmalich gebrûk sterile kryogene fleskes of autoklaaf foar folgjende gebrûk
• Brûk fleskes fan 'e juste grutte foar jo sellen– fleskes binne te krijen yn in ferskaat oan folumes tusken 1 en 5 ml. Foarkom it te folle foljen fan fleskes om it risiko op barsten te ferminderjen.
• Selektearje ynterne of eksterne skroefdraad kryogene fleskes– Yntern skroefde fleskes wurde troch guon universiteiten oanrikkemandearre foar feiligensmaatregels – se kinne ek fersmoarging foarkomme by it foljen of by opslach yn floeibere stikstof.
• Foarkom lekkage- Brûk bi-ynjeksjeare ôfslutingen dy't yn 'e skroefdop of O-ringen getten binne om lekken en fersmoarging te foarkommen.
• Brûk 2D-barcodes en label fleskes– om traceerberens te garandearjen, meitsje fleskes mei grutte skriuwgebieten it mooglik om elk fleske goed te labeljen. 2D-barcodes kinne helpe by opslachbehear en it byhâlden fan registraasjes. Kleurkodearre doppen binne nuttich foar makliker identifikaasje.
• Foldwaande ûnderhâld fan opslach- Om te soargjen dat sellen net ferlern geane, moatte opslachfetten de temperatuer en it nivo fan floeibere stikstof konstant kontrolearje. Alarms moatte ynstalleare wurde om brûkers te warskôgjen foar flaters.

Feilichheidsmaatregels

Floeibere stikstof is gewoane praktyk wurden yn modern ûndersyk, mar bringt it risiko fan serieuze ferwûnings mei as it ferkeard brûkt wurdt.

Goede persoanlike beskermingsmiddelen (PPE) moatte droegen wurde om it risiko op froastbiten, brânwûnen en oare neidielige ynsidinten te minimalisearjen by it omgean mei floeibere stikstof. Draach

• Kryogene handschoenen
• Laboratoariumjas
• Slagbestindich folslein gesichtsskerm dat ek de nekke bedekt
• Sletten skuon
• Spatbestindige plestik skort

Koelkasten mei floeibere stikstof moatte yn goed fentilearre gebieten pleatst wurde om it risiko op ferstikking te minimalisearjen - ûntsnapte stikstof ferdampt en ferdriuwt atmosfearyske soerstof. Opslachromten mei grutte folumes moatte alarmsystemen foar leech soerstof hawwe.

It wurkjen yn pearen by it omgean mei floeibere stikstof is ideaal en it gebrûk dêrfan bûten normale wurktiden moat ferbean wurde.

Kryoflesjes om jo workflow te stypjen

It bedriuw Suzhou Ace Biomedical biedt in breed oanbod fan produkten dy't foldogge oan jo kryopreservaasjebehoeften foar ferskate soarten sellen. De portfolio omfettet in oanbod fan buizen en ek in oanbod fan sterile kryoflesjes.

Us kryoflesjes binne:

• Lab Skroefdop 0.5mL 1.5mL 2.0mL Kryoviale Kryogene Fleskes Konyske Boaiem Kryotube mei Pakking

  ● 0.5ml, 1.5ml, 2.0ml spesifikaasje, mei rok of sûnder rok
  ● Konysk of selsstannich ûntwerp, steryl of net-steryl binne beide beskikber
  ● Skroefdopbuizen binne makke fan polypropyleen fan medyske kwaliteit
  ● PP Cryotube-flesjes kinne ferskate kearen beferzen en ûntdooid wurde
  ● It ûntwerp fan 'e eksterne kap kin de kâns op fersmoarging tidens de behanneling fan it stekproef ferminderje.
  ● Kryogene buizen mei skroefdop Universele skroefdraad foar gebrûk
  ● Buizen passe op de meast foarkommende rotors
  ● Kryogene buis o-ring buizen passe yn standert 1-inch en 2-inch, 48well, 81well, 96well en 100well friezer doazen
  ● Autoklaveerber oant 121 °C en ynfrierber oant -86 °C

  DIEL NR.	MATERIAAL	FOLUME	KAPKLEUR	PCS/PÛDE	TASSEN/KOFFER
  ACT05-BL-N	PP	0.5ML	Swart, Giel, Blau, Read, Pears, Wyt	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5ML	Swart, Giel, Blau, Read, Pears, Wyt	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5ML	Swart, Giel, Blau, Read, Pears, Wyt	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0ML	Swart, Giel, Blau, Read, Pears, Wyt	500	10