Kryopullotkäytetään yleisesti solulinjojen ja muiden kriittisten biologisten materiaalien kryogeeniseen säilytykseen nestemäisellä typellä täytetyissä Dewar-säiliöissä.

Solujen onnistuneeseen nestemäisessä typessä säilömiseen liittyy useita vaiheita. Vaikka perusperiaate on hidas pakastus, käytetty tarkka tekniikka riippuu solutyypistä ja käytetystä kryosuoja-aineesta. Solujen säilyttämisessä näin alhaisissa lämpötiloissa on otettava huomioon useita turvallisuusnäkökohtia ja parhaita käytäntöjä.

Tämän artikkelin tarkoituksena on antaa yleiskatsaus kryopullojen säilytykseen nestemäisessä typessä.

Mitä ovat kryopullot

Kryopullot ovat pieniä, korkillisia injektiopulloja, jotka on suunniteltu nestemäisten näytteiden säilyttämiseen erittäin alhaisissa lämpötiloissa. Ne varmistavat, että kryosuoja-aineessa säilytetyt solut eivät joudu suoraan kosketuksiin nestemäisen typen kanssa, mikä minimoi solujen murtumisen riskin ja samalla hyötyy nestemäisen typen äärimmäisestä viilentävästä vaikutuksesta.

Injektiopulloja on yleensä saatavilla eri tilavuuksina ja malleina – ne voivat olla sisä- tai ulkokierteitettyjä ja litteitä tai pyöreitä. Saatavilla on myös steriilejä ja ei-steriilejä muotoja.

Kuka käyttääKyroviaalitsolujen säilyttämiseen nestemäisessä typessä

Useat NHS:n ja yksityiset laboratoriot sekä napanuoraveren tallettamiseen, epiteelisolubiologiaan, immunologiaan ja kantasolubiologiaan erikoistuneet tutkimuslaitokset käyttävät kryosäilytyspulloja solujen kryosäilytykseen.

Tällä tavoin säilöttyihin soluihin kuuluvat B- ja T-solut, CHO-solut, hematopoieettiset kanta- ja progenitorisolut, hybridoomat, suoliston solut, makrofagit, mesenkymaaliset kanta- ja progenitorisolut, monosyytit, myelooma, NK-solut ja pluripotentit kantasolut.

Yleiskatsaus kryopullojen säilytykseen nestemäisessä typessä

Kryosäilytys on prosessi, jossa soluja ja muita biologisia rakenteita säilytetään jäähdyttämällä ne erittäin alhaisiin lämpötiloihin. Soluja voidaan säilyttää nestemäisessä typessä vuosia ilman, että niiden elinkyky heikkenee. Tämä on yleiskatsaus käytetyistä menetelmistä.

Solujen valmistelu

Näytteiden tarkka valmistusmenetelmä vaihtelee solutyypin mukaan, mutta yleensä solut kerätään ja sentrifugoidaan solupitoisen pelletin muodostamiseksi. Tämä pelletti suspendoidaan sitten uudelleen supernatanttiin, johon on sekoitettu kryosuoja-ainetta tai kryosäilytysliuosta.

Kryosäilytysaine

Tätä väliainetta käytetään solujen säilyttämiseen matalassa lämpötilassa estämällä solunsisäisten ja solunulkoisten kiteiden muodostumista ja siten solukuolemaa. Niiden tehtävänä on tarjota turvallinen ja suojaava ympäristö soluille ja kudoksille pakastus-, varastointi- ja sulatusprosessien aikana.

Väliaine, kuten tuorepakastettu plasma (FFP), heparinoitu plasmalyyttiliuos tai seerumittomat, eläinkomponentittomat liuokset, sekoitetaan kryosuoja-aineiden, kuten dimetyylisulfoksidin (DMSO) tai glyserolin, kanssa.

Uudelleen nesteytetty näytepelletti jaetaan polypropeenista valmistettuihin kryopulloihin, kutenSuzhou Ace Biomedical Companyn kryogeeniset säilytyspullot.

On tärkeää, ettei kryopulloja täytetä liikaa, sillä se lisää halkeamisen ja sisällön mahdollisen vapautumisen riskiä (1).

Kontrolloitu jäätymisnopeus

Yleisesti ottaen solujen onnistuneeseen kryosäilytykseen käytetään hidasta, kontrolloitua pakastusnopeutta.

Kun näytteet on jaettu kryogeenisiin injektiopulloihin, ne asetetaan märälle jäälle tai 4 ℃:n jääkaappiin ja pakastusprosessi aloitetaan 5 minuutin kuluessa. Yleisesti ottaen soluja jäähdytetään nopeudella -1–-3 minuutissa (2). Tämä saavutetaan käyttämällä ohjelmoitavaa jäähdytintä tai sijoittamalla injektiopullot eristettyyn laatikkoon, joka on sijoitettu –70––90 °C:n lämpötilaan säädettävällä nopeudella pakastetussa laitteessa.

Siirto nestemäiseen typpeen

Pakastetut kryogeeniset injektiopullot siirretään sitten nestemäistä typpeä sisältävään säiliöön määräämättömäksi ajaksi, edellyttäen, että lämpötila pidetään alle -135 ℃:ssa.

Nämä erittäin alhaiset lämpötilat voidaan saavuttaa upottamalla nestemäiseen tai höyryfaasiseen typpeen.

Nestemäinen vai höyryfaasi?

Nestemäisessä typessä säilytyksen tiedetään ylläpitävän kylmän lämpötilan absoluuttisen tasaisena, mutta sitä ei usein suositella seuraavista syistä:

• Nestemäisen typen tarve suurissa määrissä (syvyys), mikä on mahdollinen vaara. Palovammat tai tukehtuminen tästä ovat todellinen riski.
• Dokumentoituja tapauksia tartuntatautien aiheuttajien, kuten aspergilloksen, hepatiitti B:n ja viruksen, ristikontaminaatiosta nestemäisen typen välityksellä (2,3)
• Nestemäistä typpeä voi vuotaa pulloihin upotuksen aikana. Kun typpi otetaan pois säilytyksestä ja lämmitetään huoneenlämpöiseksi, se laajenee nopeasti. Tämän seurauksena pullo voi rikkoutua, kun se poistetaan nestemäisen typen säilytyksestä, mikä aiheuttaa vaaran sekä lentävistä roskista että altistumisesta sisällölle (1, 4).

Näistä syistä erittäin alhaisissa lämpötiloissa näytteet säilytetään yleisimmin höyryfaasissa typessä. Kun näytteet on säilytettävä nestefaasissa, on käytettävä erityisiä kryoflex-putkia.

Höyryfaasin haittapuolena on, että voi esiintyä pystysuora lämpötilagradientti, joka johtaa lämpötilan vaihteluihin -135 ℃:n ja -190 ℃:n välillä. Tämä edellyttää nestemäisen typen pitoisuuksien ja lämpötilavaihteluiden huolellista ja tunnollista seurantaa (5).

Monet valmistajat suosittelevat, että kryopullot soveltuvat säilytykseen jopa -135 ℃:ssa tai käytettäväksi vain höyryfaasissa.

Kryosäilytettyjen solujen sulattaminen

Sulatusprosessi on stressaava pakastetulle viljelmälle, ja solujen optimaalisen elinkelpoisuuden, talteenoton ja toimivuuden varmistamiseksi tarvitaan asianmukaista käsittelyä ja tekniikkaa. Tarkat sulatusprotokollat ​​riippuvat solutyypeistä. Nopeaa sulatusta pidetään kuitenkin standardina seuraavissa tapauksissa:

• Vähentää solujen palautumiseen kohdistuvaa vaikutusta
• Auttaa lyhentämään altistusaikaa jäätymisväliaineessa oleville liuenneille aineille
• Minimoi jään uudelleenkiteytymisen aiheuttamat vahingot

Näytteiden sulattamiseen käytetään yleisesti vesihauteita, helmihauteita tai erikoistuneita automatisoituja instrumentteja.

Useimmiten yksi solulinja sulatetaan kerrallaan 1–2 minuutin ajan pyörittelemällä sitä varovasti 37 ℃ vesihauteessa, kunnes pullossa on jäljellä vain pieni määrä jäätä, ennen kuin ne pestään esilämmitetyssä kasvualustassa.

Joillekin soluille, kuten nisäkäsalkioille, hidas lämpeneminen on välttämätöntä niiden selviytymisen kannalta.

Solut ovat nyt valmiita soluviljelyyn, solujen eristämiseen tai hematopoieettisten kantasolujen tapauksessa elinkelpoisuustutkimuksiin, joilla varmistetaan luovuttajan kantasolujen eheys ennen myeloablatiivista hoitoa.

On normaalia ottaa pieniä näytteitä esipestystä näytteestä, jota käytetään solujen laskemiseen solupitoisuuksien määrittämiseksi viljelmään levittämistä varten. Sen jälkeen voit arvioida solujen eristysmenetelmien tuloksia ja määrittää solujen elinkykyisyyden.

Kryopullojen säilytyksen parhaat käytännöt

Kryopulloihin säilytettyjen näytteiden onnistunut kryosäilytys riippuu monista protokollan tekijöistä, mukaan lukien asianmukainen säilytys ja kirjanpito.

• Jaa solut tallennuspaikkojen välillä– Jos tilavuudet sallivat, jaa solut injektiopulloihin ja säilytä ne erillisissä paikoissa laitevikojen aiheuttaman näytehävikin riskin vähentämiseksi.
• Estä ristikontaminaatio– Valitse kertakäyttöiset steriilit kryogeeniset injektiopullot tai autoklaavi ennen seuraavaa käyttöä
• Käytä soluillesi sopivan kokoisia injektiopulloja– injektiopulloja on saatavilla 1–5 ml:n tilavuuksina. Vältä injektiopullojen ylitäyttöä halkeamisriskin vähentämiseksi.
• Valitse sisä- tai ulkokierteiset kryogeeniset injektiopullot– Jotkut yliopistot suosittelevat sisäkierteitettyjä injektiopulloja turvallisuussyistä – ne voivat myös estää kontaminaation täytön aikana tai nestemäisessä typessä säilytettäessä.
• Estä vuoto- Käytä kierrekorkkiin valettuja kaksoisruiskutettuja tiivisteitä tai O-renkaita vuotojen ja kontaminaation estämiseksi.
• Käytä 2D-viivakoodeja ja merkitse injektiopulloja– Jäljitettävyyden varmistamiseksi suuret kirjoitusalueet mahdollistavat jokaisen injektiopullon riittävän merkitsemisen. 2D-viivakoodit voivat auttaa varastoinnin hallinnassa ja kirjanpidossa. Värikoodatut korkit ovat hyödyllisiä helpottamaan tunnistamista.
• Riittävä varastointihuolto- Jotta soluja ei hävittäisi, säilytysastioiden lämpötilaa ja nestemäisen typen määrää on seurattava jatkuvasti. Asennukseen on asennettava hälytykset, jotka ilmoittavat käyttäjille virheistä.

Turvallisuusohjeet

Nestemäisestä typestä on tullut yleinen käytäntö nykyaikaisessa tutkimuksessa, mutta väärin käytettynä siihen liittyy vakavan loukkaantumisen riski.

Nestemäistä typpeä käsiteltäessä on käytettävä asianmukaisia ​​henkilönsuojaimia paleltumien, palovammojen ja muiden haitallisten tapahtumien riskin minimoimiseksi. Käytä

• Kryogeeniset käsineet
• Laboratoriotakki
• Iskunkestävä kokokasvosuojus, joka peittää myös kaulan
• Suljetut kengät
• Roiskeenkestävä muoviesiliina

Nestemäistä typpeä käyttävät jääkaapit tulee sijoittaa hyvin ilmastoituun tilaan tukehtumisriskin minimoimiseksi – vuotava typpi höyrystyy ja syrjäyttää ilmakehän hapen. Suurissa varastoissa tulisi olla alhaisen happipitoisuuden hälytysjärjestelmät.

Nestemäistä typpeä käsiteltäessä on ihanteellista työskennellä pareittain, ja sen käyttö normaalin työajan ulkopuolella tulisi kieltää.

Kryopullot työnkulun tueksi

Suzhou Ace Biomedical -yritys tarjoaa laajan valikoiman tuotteita, jotka täyttävät erityyppisten solujen kryosäilytystarpeesi. Tuotevalikoimaan kuuluu erilaisia ​​putkia sekä steriilejä kryopulloja.

Kryopullomme ovat:

• Lab-kierrekorkki 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kryogeeniset injektiopullot, kartiomainen pohja, kryoputki tiivisteellä

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml erittely, hameella tai ilman hametta
  ● Saatavilla kartiomaisena tai itseseisovana mallina, steriilinä tai ei-steriilinä
  ● Kierrekorkkiputket on valmistettu lääketieteelliseen käyttöön tarkoitetusta polypropeenista
  ● PP-kryoputkipulloja voidaan pakastaa ja sulattaa toistuvasti
  ● Ulkoisen korkin muotoilu voi vähentää kontaminaation todennäköisyyttä näytteen käsittelyn aikana.
  ● Kierrekorkkiset kryogeeniset putket Yleiskierteet käytettäväksi
  ● Putket sopivat useimpiin yleisimpiin roottoreihin
  ● Kryogeenisten putkien o-rengasputket sopivat vakiomallisiin 1 tuuman ja 2 tuuman, 48-, 81-, 96- ja 100-kuoppaisiin pakastinlaatikoihin
  ● Voidaan autoklavoida 121 °C:seen ja pakastaa -86 °C:seen

  OSANRO	MATERIAALI	ÄÄNENVOIMAKKUUS	KORKKIVÄRI	KPL/LAUKKU	LAUKUT/LAUKKU
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Musta, keltainen, sininen, punainen, violetti, valkoinen	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Musta, keltainen, sininen, punainen, violetti, valkoinen	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Musta, keltainen, sininen, punainen, violetti, valkoinen	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Musta, keltainen, sininen, punainen, violetti, valkoinen	500	10