Kryozkumavkyse běžně používají pro kryogenní skladování buněčných linií a dalších kritických biologických materiálů v Dewarových nádobách naplněných tekutým dusíkem.

Úspěšná konzervace buněk v tekutém dusíku zahrnuje několik fází. Základním principem je pomalé zmrazení, ale přesná použitá technika závisí na typu buněk a použitém kryoprotektantu. Při skladování buněk za tak nízkých teplot je třeba vzít v úvahu několik bezpečnostních aspektů a osvědčených postupů.

Tento příspěvek si klade za cíl poskytnout přehled o tom, jak se kryozkumavky skladují v tekutém dusíku.

Co jsou kryozkumavky

Kryoviálky jsou malé uzavíratelné lahvičky určené pro skladování kapalných vzorků při extrémně nízkých teplotách. Zajišťují, aby buňky uchovávané v kryoprotektantu nepřišly do přímého kontaktu s tekutým dusíkem, čímž se minimalizuje riziko buněčných zlomenin a zároveň se stále využívá extrémní chladicí účinek tekutého dusíku.

Vialky jsou obvykle k dispozici v různých objemech a provedeních – mohou mít vnitřní nebo vnější závit s plochým nebo zaobleným dnem. K dispozici jsou také sterilní i nesterilní provedení.

Kdo používáCyrovialsskladování buněk v tekutém dusíku

Řada laboratoří NHS a soukromých laboratoří, stejně jako výzkumné instituce specializující se na bankovnictví pupečníkové krve, biologii epiteliálních buněk, imunologii a biologii kmenových buněk, používá kryolahvičky ke kryokonzervaci buněk.

Mezi buňky konzervované tímto způsobem patří B a T buňky, buňky CHO, hematopoetické kmenové a progenitorové buňky, hybridomy, střevní buňky, makrofágy, mezenchymální kmenové a progenitorové buňky, monocyty, myelom, NK buňky a pluripotentní kmenové buňky.

Přehled skladování kryozkumavek v tekutém dusíku

Kryokonzervace je proces, který uchovává buňky a další biologické struktury jejich ochlazením na velmi nízké teploty. Buňky lze skladovat v tekutém dusíku po dobu několika let bez ztráty jejich životaschopnosti. Toto je přehled používaných postupů.

Příprava buněk

Přesná metoda přípravy vzorků se bude lišit v závislosti na typu buněk, ale obecně se buňky shromáždí a centrifugují, aby se vytvořila peleta bohatá na buňky. Tato peleta se poté resuspenduje v supernatantu smíchaném s kryoprotektantem nebo kryokonzervačním médiem.

Kryokonzervační médium

Toto médium se používá k uchování buněk v prostředí s nízkými teplotami, kterým budou vystaveny, a to inhibicí tvorby intracelulárních a extracelulárních krystalů, a tím i buněčné smrti. Jeho úlohou je poskytovat bezpečné a ochranné prostředí pro buňky a tkáně během procesů zmrazování, skladování a rozmrazování.

Médium, jako je čerstvě zmrazená plazma (FFP), roztok heparinizovaného plazmalytu nebo roztoky bez séra a živočišných složek, se smíchá s kryoprotektanty, jako je dimethylsulfoxid (DMSO) nebo glycerol.

Znovu zkapalněný vzorek se alikvotně rozdělí do polypropylenových kryolahviček, jako je např.Kryogenní skladovací lahvičky společnosti Suzhou Ace Biomedical.

Je důležité kryozkumavky nepřeplňovat, protože by se tím zvýšilo riziko prasknutí a možného úniku obsahu (1).

Řízená rychlost mrazení

Obecně se pro úspěšnou kryokonzervaci buněk používá pomalá kontrolovaná rychlost zmrazování.

Poté, co jsou vzorky rozděleny do kryogenních lahviček, jsou umístěny na mokrý led nebo do chladničky o teplotě 4 °C a proces zmrazování je zahájen do 5 minut. Obecně se buňky chladí rychlostí -1 až -3 za minutu (2). Toho se dosahuje pomocí programovatelného chladiče nebo umístěním lahviček do izolované krabice v mrazáku s řízenou rychlostí o teplotě -70 °C až -90 °C.

Převod na kapalný dusík

Zmrazené kryogenní lahvičky se poté na neurčitou dobu přenesou do nádrže s kapalným dusíkem za předpokladu, že se udržuje teplota nižší než -135 °C.

Těchto ultranízkých teplot lze dosáhnout ponořením do kapalného nebo plynného dusíku.

Kapalná nebo plynná fáze?

Skladování v kapalném dusíku je známé pro udržení nízké teploty s absolutní konzistencí, ale často se nedoporučuje z následujících důvodů:

• Potřeba velkých objemů (hloubek) tekutého dusíku, což představuje potenciální nebezpečí. Popáleniny nebo udušení v důsledku toho představují skutečné riziko.
• Zdokumentované případy křížové kontaminace infekčními agens, jako je aspergillus, hepatitida B a šíření virů prostřednictvím tekutého dusíkového média (2,3)
• Možnost úniku tekutého dusíku do lahviček během ponoření. Po vyjmutí ze skladu a ohřátí na pokojovou teplotu se dusík rychle rozpíná. V důsledku toho se lahvička po vyjmutí ze skladu s tekutým dusíkem může roztříštit, což představuje nebezpečí jak v důsledku odlétajících úlomků, tak i v důsledku kontaktu s obsahem (1, 4).

Z těchto důvodů se skladování při ultranízkých teplotách nejčastěji provádí v plynné fázi dusíku. Pokud musí být vzorky skladovány v kapalné fázi, měly by se použít specializované kryoflexní trubice.

Nevýhodou plynné fáze je, že může docházet k vertikálnímu teplotnímu gradientu, který vede k teplotním výkyvům mezi -135 ℃ a -190 ℃. To vyžaduje pečlivé a důsledné sledování hladin kapalného dusíku a teplotních výkyvů (5).

Mnoho výrobců doporučuje kryozkumavky vhodné pro skladování až do -135 °C nebo pro použití pouze v plynné fázi.

Rozmrazování kryokonzervovaných buněk

Postup rozmrazování je pro zmrazenou kulturu stresující a pro zajištění optimální životaschopnosti, regenerace a funkčnosti buněk je nutná správná manipulace a technika. Přesné protokoly rozmrazování budou záviset na konkrétních typech buněk. Rychlé rozmrazování je však považováno za standardní pro:

• Snížení jakéhokoli dopadu na buněčnou obnovu
• Pomáhají zkrátit dobu expozice rozpuštěným látkám přítomným v mrazicím médiu
• Minimalizujte jakékoli poškození rekrystalizací ledu

K rozmrazování vzorků se běžně používají vodní lázně, kuličkové lázně nebo specializované automatizované přístroje.

Nejčastěji se rozmrazuje jedna buněčná linie po dobu 1–2 minut jemným mícháním ve vodní lázni o teplotě 37 °C, dokud v lahvičce nezůstane jen malé množství ledu, než se promyjí v předehřátém růstovém médiu.

Pro některé buňky, jako jsou embrya savců, je pomalé oteplování nezbytné pro jejich přežití.

Buňky jsou nyní připraveny pro buněčnou kultivaci, izolaci buněk nebo v případě hematopoetických kmenových buněk pro studie životaschopnosti, aby se zaručila integrita dárcovských kmenových buněk před myeloablativní terapií.

Je běžnou praxí odebírat malé alikvotní podíly předem promytého vzorku použitého k provedení počítání buněk za účelem stanovení jejich koncentrací pro kultivaci. Poté můžete vyhodnotit výsledky postupů izolace buněk a určit jejich životaschopnost.

Nejlepší postupy pro skladování kryozkumavek

Úspěšná kryokonzervace vzorků uložených v kryozkumavkách závisí na mnoha prvcích protokolu, včetně správného skladování a vedení záznamů.

• Rozdělení buněk mezi úložištěmi– Pokud to objemy dovolí, rozdělte kyvety do lahviček a uložte je na oddělených místech, abyste snížili riziko ztráty vzorku v důsledku selhání zařízení.
• Zabraňte křížové kontaminaci– Před dalším použitím zvolte jednorázové sterilní kryogenní lahvičky nebo autoklávujte
• Používejte lahvičky vhodné velikosti pro vaše buňky– Lahvičky se dodávají v objemech od 1 do 5 ml. Abyste snížili riziko prasknutí, vyhněte se přeplnění lahviček.
• Vyberte kryogenní vialky s vnitřním nebo vnějším závitem– Některé univerzity doporučují lahvičky s vnitřním závitem z bezpečnostních důvodů – mohou také zabránit kontaminaci během plnění nebo při skladování v tekutém dusíku.
• Zabraňte úniku- Použijte těsnění vstřikovaná do šroubovacího uzávěru nebo O-kroužků, abyste zabránili úniku a kontaminaci.
• Používejte 2D čárové kódy a označujte lahvičky– Pro zajištění sledovatelnosti umožňují lahvičky s velkými popisnými plochami každou lahvičku odpovídající označení. 2D čárové kódy mohou usnadnit správu skladování a vedení záznamů. Barevně kódované víčka jsou užitečná pro snazší identifikaci.
• Dostatečná údržba skladovacích prostor- Aby se zajistilo, že nedojde ke ztrátě buněk, měly by skladovací nádoby neustále monitorovat teplotu a hladinu kapalného dusíku. Měly by být instalovány alarmy, které by uživatele upozornily na chyby.

Bezpečnostní opatření

Tekutý dusík se stal běžnou praxí v moderním výzkumu, ale při nesprávném použití s ​​sebou nese riziko vážného zranění.

Aby se minimalizovalo riziko omrzlin, popálenin a dalších nežádoucích událostí při manipulaci s kapalným dusíkem, je třeba nosit vhodné osobní ochranné prostředky (OOP).

• Kryogenní rukavice
• Laboratorní plášť
• Nárazuvzdorný celoobličejový štít, který zakrývá i krk
• Boty s uzavřenou špičkou
• Voděodolná plastová zástěra

Chladničky s kapalným dusíkem by měly být umístěny v dobře větraných prostorách, aby se minimalizovalo riziko zadušení – unikající dusík se odpařuje a vytlačuje atmosférický kyslík. Velkoobjemové sklady by měly mít alarmy nízké hladiny kyslíku.

Práce ve dvojicích při manipulaci s tekutým dusíkem je ideální a jeho používání mimo běžnou pracovní dobu by mělo být zakázáno.

Kryozkumavky pro podporu vašeho pracovního postupu

Společnost Suzhou Ace Biomedical nabízí široký výběr produktů, které splňují vaše potřeby v oblasti kryokonzervace různých typů buněk. Portfolio zahrnuje řadu zkumavek a také řadu sterilních kryolahviček.

Naše kryozkumavky jsou:

• Laboratorní šroubovací uzávěr 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kryogenní lahvičky s kuželovým dnem, kryogenní zkumavka s těsněním

  ● Specifikace 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, se sukní nebo bez sukně
  ● K dispozici je kuželové nebo samostatně stojící provedení, sterilní i nesterilní
  ● Zkumavky se šroubovacím uzávěrem jsou vyrobeny z polypropylenu lékařské kvality
  ● Kryotuby z polypropylenu lze opakovaně zmrazovat a rozmrazovat
  ● Konstrukce vnějšího víčka může snížit pravděpodobnost kontaminace během zpracování vzorku.
  ● Kryogenní zkumavky se šroubovacím uzávěrem Univerzální závity pro použití
  ● Trubky pasují na většinu běžných rotorů
  ● Kryogenní trubice s O-kroužkem pasují do standardních mrazicích boxů o průměru 1 palce a 2 palce, 48, 81, 96 a 100 jamek.
  ● Autoklávovatelné do 121 °C a mrazitelné do -86 °C

  ČÍSLO DÍLU	MATERIÁL	OBJEM	VÍČKOBARVA	KS/TAŠKA	TAŠKY/POUZDRO
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Černá, žlutá, modrá, červená, fialová, bílá	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Černá, žlutá, modrá, červená, fialová, bílá	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Černá, žlutá, modrá, červená, fialová, bílá	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Černá, žlutá, modrá, červená, fialová, bílá	500	10