Криовиалисе използват често за криогенно съхранение на клетъчни линии и други критични биологични материали в съдове на Дюар, пълни с течен азот.

Успешното съхранение на клетки в течен азот включва няколко етапа. Въпреки че основният принцип е бавно замразяване, точната използвана техника зависи от вида на клетките и използвания криопротектор. Има няколко съображения за безопасност и най-добри практики, които трябва да се вземат предвид при съхранение на клетки при такива ниски температури.

Тази публикация има за цел да даде общ преглед на това как криоепруветките се съхраняват в течен азот.

Какво представляват криовиалите

Криовиалите са малки, затворени ампули, предназначени за съхранение на течни проби при изключително ниски температури. Те гарантират, че клетките, съхранявани в криопротектор, не влизат в директен контакт с течния азот, като по този начин се минимизира рискът от клетъчни фрактури, като същевременно се възползват от екстремния охлаждащ ефект на течния азот.

Флаконите обикновено се предлагат в различни обеми и дизайни – те могат да бъдат с вътрешна или външна резба, с плоски или заоблени дъна. Предлагат се също стерилни и нестерилни формати.

Кой използваСировиализа съхранение на клетки в течен азот

Редица лаборатории на NHS и частни лаборатории, както и изследователски институции, специализирани в банкирането на пъпна кръв, епителна клетъчна биология, имунология и биология на стволови клетки, използват криоепруветки за криоконсервиране на клетки.

Клетките, консервирани по този начин, включват B и T клетки, CHO клетки, хематопоетични стволови и прогениторни клетки, хибридоми, чревни клетки, макрофаги, мезенхимни стволови и прогениторни клетки, моноцити, миелом, NK клетки и плурипотентни стволови клетки.

Преглед на това как да съхранявате криоепруветки в течен азот

Криоконсервацията е процес, който запазва клетки и други биологични структури чрез охлаждането им до много ниски температури. Клетките могат да се съхраняват в течен азот в продължение на години без загуба на клетъчна жизнеспособност. Това е описание на използваните процедури.

Подготовка на клетки

Точният метод за приготвяне на пробите ще варира в зависимост от вида на клетките, но като цяло клетките се събират и центрофугират, за да се получи богата на клетки утайка. Тази утайка след това се ресуспендира в супернатантата, смесена с криопротектор или криоконсервационна среда.

Криоконсервационна среда

Тази среда се използва за запазване на клетките в нискотемпературни среди, на които ще бъдат подложени, като инхибира образуването на вътреклетъчни и извънклетъчни кристали и следователно клетъчната смърт. Тяхната роля е да осигурят безопасна, защитна среда за клетките и тъканите по време на процесите на замразяване, съхранение и размразяване.

Среда като прясно замразена плазма (ПЗП), хепаринизиран плазмолитен разтвор или разтвори без серум и животински компоненти се смесва с криопротектанти като диметилсулфоксид (DMSO) или глицерол.

Ревтечнената проба от пелети се разпределя аликвотно в полипропиленови криоепруветки, като напримерSuzhou Ace Biomedical company Криогенни ампули за съхранение.

Важно е криоепруветките да не се препълват, тъй като това ще увеличи риска от напукване и евентуално изтичане на съдържание (1).

Контролирана скорост на замръзване

Като цяло, за успешно криоконсервиране на клетки се използва бавна контролирана скорост на замразяване.

След като пробите се разпределят аликвотно в криогенни флакони, те се поставят върху мокър лед или в хладилник при 4℃ и процедурата по замразяване започва в рамките на 5 минути. Като общо правило, клетките се охлаждат със скорост от -1 до -3 на минута (2). Това се постига с помощта на програмируем охладител или чрез поставяне на флаконите в изолирана кутия, поставена във фризер с контролирана скорост при -70°C до -90°C.

Прехвърляне към течен азот

Замразените криогенни флакони след това се прехвърлят в резервоар с течен азот за неопределен период от време, при условие че се поддържа температура под -135℃.

Тези ултраниски температури могат да бъдат получени чрез потапяне в течен или газообразен азот.

Течна или парообразна фаза?

Известно е, че съхранението в течен азот поддържа ниската температура с абсолютна константа, но често не се препоръчва поради следните причини:

• Необходимостта от големи обеми (дълбочина) течен азот, което е потенциална опасност. Изгаряния или задушаване поради това са реален риск.
• Документирани случаи на кръстосано замърсяване с инфекциозни агенти като аспергилус, хепатит B и разпространение на вируса чрез течна азотна среда (2,3)
• Възможност за изтичане на течен азот във флаконите по време на потапяне. Когато се извади от мястото за съхранение и се затопли до стайна температура, азотът бързо се разширява. Следователно, флаконът може да се счупи при изваждане от мястото за съхранение на течен азот, създавайки опасност както от летящи отломки, така и от излагане на съдържанието (1, 4).

Поради тези причини съхранението при ултраниски температури най-често се извършва в газообразен азот. Когато пробите трябва да се съхраняват в течна фаза, трябва да се използват специализирани криофлексни тръби.

Недостатъкът на парната фаза е, че може да възникне вертикален температурен градиент, водещ до температурни колебания между -135℃ и -190℃. Това налага внимателно и старателно наблюдение на нивата на течния азот и температурните колебания (5).

Много производители препоръчват криоепруветките да са подходящи за съхранение до -135℃ или за употреба само в парна фаза.

Размразяване на криоконсервираните клетки

Процедурата по размразяване е стресираща за замразена култура и е необходима правилна обработка и техника, за да се осигури оптимална жизнеспособност, възстановяване и функционалност на клетките. Точните протоколи за размразяване ще зависят от специфичните типове клетки. Бързото размразяване обаче се счита за стандартно за:

• Намалете всяко въздействие върху клетъчното възстановяване
• Помага за намаляване на времето на излагане на разтворените вещества, присъстващи в замразяващата среда
• Минимизирайте всякакви щети от рекристализация на лед

За размразяване на проби обикновено се използват водни бани, вани с перли или специализирани автоматизирани инструменти.

Най-често се размразява по една клетъчна линия за 1-2 минути, като се разбърква внимателно във водна баня с температура 37℃, докато в ампулата остане само малко лед, преди да се измият в предварително затоплена растежна среда.

За някои клетки, като например ембрионите на бозайници, бавното затопляне е от съществено значение за тяхното оцеляване.

Клетките вече са готови за клетъчна култура, клетъчна изолация или, в случай на хематопоетични стволови клетки – изследвания за жизнеспособност, за да се гарантира целостта на донорските стволови клетки преди миелоаблативна терапия.

Нормална практика е да се вземат малки аликвотни части от предварително измитата проба, използвана за извършване на клетъчно преброяване, за да се определят клетъчните концентрации за посяване в култура. След това можете да оцените резултатите от процедурите за изолиране на клетките и да определите клетъчната жизнеспособност.

Най-добри практики за съхранение на криоепруветки

Успешното криоконсервиране на проби, съхранявани в криоепруветки, зависи от много елементи в протокола, включително правилно съхранение и водене на документация.

• Разделяне на клетки между местата за съхранение– Ако обемите позволяват, разделете клетките между флаконите и ги съхранявайте на отделни места, за да намалите риска от загуба на проба поради повреди на оборудването.
• Предотвратяване на кръстосано замърсяване– Изберете стерилни криогенни флакони за еднократна употреба или автоклав преди последваща употреба
• Използвайте флакони с подходящ размер за вашите клетки– Флаконите се предлагат в обем между 1 и 5 мл. Избягвайте препълване на флаконите, за да намалите риска от напукване.
• Изберете криогенни епруветки с вътрешна или външна резба– Някои университети препоръчват флакони с вътрешна резба от съображения за безопасност – те могат също така да предотвратят замърсяване по време на пълнене или при съхранение в течен азот.
• Предотвратяване на течове- Използвайте двойно шприцовани уплътнения, формовани в винтовата капачка или О-пръстените, за да предотвратите течове и замърсяване.
• Използвайте 2D баркодове и етикетирайте флаконите– за да се осигури проследимост, флаконите с големи полета за писане позволяват адекватно етикетиране на всеки флакон. 2D баркодовете могат да помогнат за управление на съхранението и воденето на записи. Цветно кодираните капачки са полезни за по-лесна идентификация.
• Адекватна поддръжка на складовите помещения- За да се гарантира, че клетките няма да бъдат загубени, съдовете за съхранение трябва постоянно да следят температурата и нивата на течния азот. Трябва да се монтират аларми, които да предупреждават потребителите за грешки.

Предпазни мерки

Течният азот се е превърнал в обичайна практика в съвременните изследвания, но носи риск от сериозни наранявания, ако се използва неправилно.

Трябва да се носят подходящи лични предпазни средства (ЛПС), за да се сведе до минимум рискът от измръзване, изгаряния и други нежелани инциденти при работа с течен азот.

• Криогенни ръкавици
• Лабораторно палто
• Удароустойчив щит за цялото лице, който покрива и врата
• Обувки със затворени пръсти
• Водоустойчива пластмасова престилка

Хладилниците с течен азот трябва да се поставят в добре проветриви помещения, за да се сведе до минимум рискът от задушаване – изтичащият азот се изпарява и измества атмосферния кислород. Складовете с голям обем трябва да имат алармени системи за ниско съдържание на кислород.

Работата по двойки при работа с течен азот е идеална и употребата му извън нормалното работно време следва да бъде забранена.

Криоепруветки за подпомагане на вашия работен процес

Компанията Suzhou Ace Biomedical предлага широка гама от продукти, които отговарят на вашите нужди за криоконсервация на различни видове клетки. Портфолиото включва гама от епруветки, както и гама от стерилни криоепруветки.

Нашите криоепруветки са:

• Лабораторна винтова капачка 0.5mL 1.5mL 2.0mL Криовиални криогенни флакони с конично дъно Криотуба с уплътнение

  ● Спецификация 0,5 мл, 1,5 мл, 2,0 мл, с пола или без пола
  ● Предлагат се коничен или самостоятелен дизайн, стерилен или нестерилен
  ● Тубичките с винтови капачки са изработени от медицински полипропилен
  ● Криотубичките от PP могат да се замразяват и размразяват многократно
  ● Дизайнът на външната капачка може да намали вероятността от замърсяване по време на обработката на пробата.
  ● Криогенни епруветки с винтова капачка Универсална винтова резба за употреба
  ● Тръбите са подходящи за повечето често срещани ротори
  ● Криогенните тръби с О-пръстени са подходящи за стандартни фризерни кутии с размери 1 инч и 2 инча, 48, 81, 96 и 100 ямки
  ● Автоклавируем до 121°C и замразяем до -86°C

  ЧАСТ №	МАТЕРИАЛ	ОБЕМ	ОСПЦВЯТ	PCS/ЧАНТА	ТОРБИ/КАШОН
  ACT05-BL-N	PP	0,5 мл	Черно, Жълто, Синьо, Червено, Лилаво, Бяло	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 мл	Черно, Жълто, Синьо, Червено, Лилаво, Бяло	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 мл	Черно, Жълто, Синьо, Червено, Лилаво, Бяло	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0 мл	Черно, Жълто, Синьо, Червено, Лилаво, Бяло	500	10