Крыяпрабіркізвычайна выкарыстоўваюцца для крыягеннага захоўвання клеткавых ліній і іншых важных біялагічных матэрыялаў у дзюаравых ёмістасцях, напоўненых вадкім азотам.

Паспяховае захаванне клетак у вадкім азоце складаецца з некалькіх этапаў. Хоць асноўным прынцыпам з'яўляецца павольнае замарожванне, дакладны метад залежыць ад тыпу клетак і выкарыстоўванага крыяпратэктара. Пры захоўванні клетак пры такіх нізкіх тэмпературах неабходна ўлічваць некалькі меркаванняў бяспекі і перадавых практык.

Гэты пост мае на мэце даць агляд таго, як крыяпрабіркі захоўваюцца ў вадкім азоце.

Што такое крыяпрабіркі

Крыяпрабіркі — гэта невялікія флаконы з вечкамі, прызначаныя для захоўвання вадкіх узораў пры надзвычай нізкіх тэмпературах. Яны гарантуюць, што клеткі, якія захоўваюцца ў крыяпратэктары, не будуць непасрэдна кантактаваць з вадкім азотам, мінімізуючы рызыку разбурэння клетак, але пры гэтым захоўваючы перавагі экстрэмальнага астуджальнай актыўнасці вадкага азоту.

Флаконы звычайна выпускаюцца ў розных аб'ёмах і канструкцыях — яны могуць мець унутраную або знешнюю разьбу, плоскае або круглявае дно. Таксама даступныя стэрыльныя і нестэрыльныя фарматы.

Хто карыстаеццаСіравіялызахоўваць клеткі ў вадкім азоце

Шэраг лабараторый Нацыянальнай службы аховы здароўя і прыватных лабараторый, а таксама навукова-даследчых устаноў, якія спецыялізуюцца на банках пупавіннай крыві, біялогіі эпітэліяльных клетак, імуналогіі і біялогіі ствалавых клетак, выкарыстоўваюць крыяпрабіркі для крыякансервацыі клетак.

Да клетак, якія кансервуюцца такім чынам, адносяцца В- і Т-клеткі, клеткі СНО, гематапаэтычныя ствалавыя і клеткі-папярэднікі, гібрыдомы, кішачныя клеткі, макрафагі, мезенхімальныя ствалавыя і клеткі-папярэднікі, манацыты, міелома, NK-клеткі і плюрыпатэнтныя ствалавыя клеткі.

Агляд таго, як захоўваць крыяпрабіркі ў вадкім азоце

Крыякансервацыя — гэта працэс захавання клетак і іншых біялагічных канструкцый шляхам іх астуджэння да вельмі нізкіх тэмператур. Клеткі можна захоўваць у вадкім азоце гадамі без страты жыццяздольнасці клетак. Вось кароткі агляд выкарыстоўваных працэдур.

Падрыхтоўка клетак

Дакладны метад падрыхтоўкі ўзораў будзе адрознівацца ў залежнасці ад тыпу клетак, але ў цэлым клеткі збіраюць і цэнтрыфугуюць для атрымання багатага клеткамі асадка. Затым гэты асадак рэсуспендуюць у супернатанце, змяшаным з крыяпратэктарам або крыякансервацыйным асяроддзем.

Крыякансервацыйнае асяроддзе

Гэтае асяроддзе выкарыстоўваецца для захавання клетак у асяроддзі нізкіх тэмператур, у якім яны будуць знаходзіцца, шляхам перашкаджання ўтварэнню ўнутры- і пазаклеткавых крышталяў і, такім чынам, гібелі клетак. Іх роля заключаецца ў забеспячэнні бяспечнага, ахоўнага асяроддзя для клетак і тканак падчас працэсаў замарозкі, захоўвання і размарозкі.

Асяроддзе, такое як свежазамарожаная плазма (СЗП), гепарынізаваны раствор плазмаліту або растворы без сыроваткі і жывёльных кампанентаў, змешваюць з крыяпратэктарамі, такімі як дыметылсульфаксід (ДМСО) або гліцэрына.

Паўторна развадкаваны ўзорны асадак аліквотуюць у поліпрапіленавыя крыяпрабіркі, такія якКрыягенныя флаконы для захоўвання ў біямедыцынскай кампаніі Suzhou Ace.

Важна не перапаўняць крыяпрабіркі, бо гэта павялічыць рызыку іх расколін і магчымага выкіду змесціва (1).

Кантраляваная хуткасць замярзання

Як правіла, для паспяховай крыякансервацыі клетак выкарыстоўваецца павольная кантраляваная хуткасць замарожвання.

Пасля таго, як узоры размеркаваны па крыягенных флаконах, іх змяшчаюць на вільготны лёд або ў халадзільнік пры тэмпературы 4℃, і працэдура замарозкі пачынаецца на працягу 5 хвілін. У якасці агульнага кіраўніцтва, клеткі астуджаюцца з хуткасцю ад -1 да -3 у хвіліну (2). Гэта дасягаецца з дапамогай праграмуемага халадзільніка або шляхам размяшчэння флаконаў у ізаляванай скрынцы, размешчанай у маразільнай камеры з кантраляванай хуткасцю пры тэмпературы ад -70°C да -90°C.

Пераход у вадкі азот

Замарожаныя крыягенныя флаконы затым пераносяць у рэзервуар з вадкім азотам на нявызначаны перыяд часу пры ўмове падтрымання тэмпературы ніжэй за -135℃.

Гэтыя звышнізкія тэмпературы можна атрымаць шляхам апускання ў вадкі або газападобны азот.

Вадкая ці паравая фаза?

Вядома, што захоўванне ў вадкафазным азоце падтрымлівае халодную тэмпературу з абсалютнай стабільнасцю, але часта не рэкамендуецца па наступных прычынах:

• Патрэба ў вялікіх аб'ёмах (глыбіні) вадкага азоту, што ўяўляе патэнцыйную небяспеку. Апёкі або ўдушша з-за гэтага ўяўляюць сабой рэальную рызыку.
• Задакументаваныя выпадкі перакрыжаванага забруджвання такімі інфекцыйнымі агентамі, як аспергіл, гепатыт В, і распаўсюджванне віруса праз вадкае азотнае асяроддзе (2,3)
• Магчымасць працёку вадкага азоту ў флаконы падчас апускання. Пасля вымання з месца захоўвання і награвання да пакаёвай тэмпературы азот хутка пашыраецца. У выніку флакон можа разбіцца пры выманні з месца захоўвання вадкага азоту, ствараючы небяспеку як ад лятучых абломкаў, так і ад кантакту з змесцівам (1, 4).

Па гэтых прычынах захоўванне пры звышнізкіх тэмпературах часцей за ўсё адбываецца ў газападобным азоце. Калі ўзоры неабходна захоўваць у вадкай фазе, варта выкарыстоўваць спецыяльныя крыяфлексныя трубкі.

Недахопам паравой фазы з'яўляецца тое, што можа ўзнікнуць вертыкальны градыент тэмпературы, што прыводзіць да ваганняў тэмпературы ад -135℃ да -190℃. Гэта патрабуе ўважлівага і стараннага кантролю ўзроўняў вадкага азоту і ваганняў тэмпературы (5).

Многія вытворцы рэкамендуюць захоўваць крыяпрабіркі пры тэмпературы да -135℃ або выкарыстоўваць толькі ў паравой фазе.

Размарожванне крыякансерваваных клетак

Працэдура размарозкі з'яўляецца стрэсавай для замарожанай культуры, і для забеспячэння аптымальнай жыццяздольнасці, аднаўлення і функцыянальнасці клетак патрабуецца правільнае абыходжанне і тэхніка. Дакладныя пратаколы размарозкі будуць залежаць ад канкрэтных тыпаў клетак. Аднак хуткая размарозка лічыцца стандартнай для:

• Зніжэнне любога ўздзеяння на аднаўленне клетак
• Дапамажыце скараціць час уздзеяння раствораных рэчываў, якія прысутнічаюць у замарожвальным асяроддзі
• Мінімізуйце любую шкоду ад перакрышталізацыі лёду

Для размарожвання ўзораў звычайна выкарыстоўваюцца вадзяныя лазні, лазні з шарыкамі або спецыялізаваныя аўтаматызаваныя прыборы.

Часцей за ўсё размарожваюць адну клетачную лінію на працягу 1-2 хвілін, акуратна памешваючы іх у вадзяной лазні пры тэмпературы 37℃, пакуль у флаконе не застанецца толькі трохі лёду, перш чым прамыць іх у папярэдне разагрэтым асяроддзі для росту.

Для некаторых клетак, такіх як эмбрыёны млекакормячых, павольнае награванне неабходна для іх выжывання.

Цяпер клеткі гатовыя да культывавання клетак, вылучэння клетак або, у выпадку гематапаэтычных ствалавых клетак, да даследаванняў жыццяздольнасці, каб гарантаваць цэласнасць донарскіх ствалавых клетак перад міелаабляцыйнай тэрапіяй.

Звычайнай практыкай з'яўляецца ўзяць невялікія аліквоты папярэдне прамытага ўзору, які выкарыстоўваецца для падліку клетак, каб вызначыць іх канцэнтрацыю для высеву ў культуру. Затым можна ацаніць вынікі працэдур вылучэння клетак і вызначыць жыццяздольнасць клетак.

Найлепшыя практыкі захоўвання крыяпрабірак

Паспяховая крыякансервацыя ўзораў, якія захоўваюцца ў крыяпрабірках, залежыць ад многіх элементаў пратакола, у тым ліку ад належнага захоўвання і вядзення ўліку.

• Падзяліць ячэйкі паміж месцамі захоўвання– Калі аб'ём дазваляе, падзяліце ячэйкі паміж флаконамі і захоўвайце іх у асобных месцах, каб знізіць рызыку страты ўзору з-за няспраўнасці абсталявання.
• Прадухіленне перакрыжаванага забруджвання– Перад наступным выкарыстаннем выбірайце аднаразовыя стэрыльныя крыягенныя флаконы або аўтаклав.
• Выкарыстоўвайце флаконы адпаведнага памеру для вашых клетак– флаконы выпускаюцца аб'ёмам ад 1 да 5 мл. Пазбягайце перапаўнення флаконаў, каб знізіць рызыку іх расколін.
• Выберыце крыягенныя вібралы з унутранай або знешняй разьбой– Некаторыя ўніверсітэты рэкамендуюць выкарыстоўваць флаконы з унутранай разьбой у мэтах бяспекі — яны таксама могуць прадухіліць забруджванне падчас напаўнення або захоўвання ў вадкім азоце.
• Прадухіленне ўцечкі- Выкарыстоўвайце падвойныя ўшчыльняльнікі, адлітыя ў разьбовую вечка, або ўшчыльняльныя кольцы, каб прадухіліць уцечку і забруджванне.
• Выкарыстоўвайце 2D-штрых-коды і маркіруйце флаконы– для забеспячэння адсочвання бутэлькі з вялікімі палямі для надпісу дазваляюць належным чынам маркіраваць кожную бутэльку. Двухмерныя штрых-коды могуць дапамагчы ў кіраванні захоўваннем і вядзенні ўліку. Каляровыя вечкі карысныя для прасцейшай ідэнтыфікацыі.
• Адэкватнае абслугоўванне захоўвання- Каб пераканацца, што клеткі не згублены, у ёмістасці для захоўвання неабходна пастаянна кантраляваць тэмпературу і ўзровень вадкага азоту. Неабходна ўсталяваць сігналізацыю для папярэджання карыстальнікаў аб памылках.

Меры бяспекі

Вадкі азот стаў распаўсюджанай практыкай у сучасных даследаваннях, але няправільнае выкарыстанне нясе рызыку сур'ёзных траўмаў.

Каб мінімізаваць рызыку абмаражэння, апёкаў і іншых неспрыяльных здарэнняў пры працы з вадкім азотам, неабходна насіць адпаведныя сродкі індывідуальнай абароны (СІА).

• Крыягенныя пальчаткі
• Лабараторны халат
• Ударатрывалы шчыток для ўсяго твару, які таксама закрывае шыю
• Абутак з закрытым носам
• Брызгаабаронены пластыкавы фартух

Халадзільнікі з вадкім азотам павінны размяшчацца ў добра вентыляваных памяшканнях, каб мінімізаваць рызыку ўдушша — уцеклы азот выпараецца і выцясняе атмасферны кісларод. У вялікіх сховішчах павінны быць сігналізацыі нізкага ўзроўню кіслароду.

Пры працы з вадкім азотам ідэальна працаваць у парах, а яго выкарыстанне па-за звычайным працоўным часам павінна быць забаронена.

Крыяпрабіркі для падтрымкі вашага працоўнага працэсу

Кампанія Suzhou Ace Biomedical прапануе шырокі выбар прадуктаў, якія адпавядаюць вашым патрэбам у крыякансервацыі розных тыпаў клетак. Асартымент уключае ў сябе шэраг прабірак, а таксама шэраг стэрыльных крыяпрабірак.

Нашы крыяпрабіркі:

• Лабараторныя закручвальныя вечкі 0,5 мл 1,5 мл 2,0 мл крыяпрабіркі крыягенныя флаконы з канічным дном крыяпробкі з пракладкай

  ● Спецыфікацыя 0,5 мл, 1,5 мл, 2,0 мл, са спадніцай або без спадніцы
  ● Даступныя канічная або асобнастаячая канструкцыя, стэрыльная або нестэрыльная
  ● Трубкі з закручвальнай вечкам выраблены з поліпрапілену медыцынскага класа
  ● Крыяпрабіркі з поліпрапілену можна неаднаразова замарожваць і размарожваць
  ● Канструкцыя знешняй вечка можа знізіць верагоднасць забруджвання падчас апрацоўкі ўзору.
  ● Крыягенныя прабіркі з закручвальнай вечкам Універсальная разьба для выкарыстання
  ● Трубы падыходзяць для большасці распаўсюджаных ротараў
  ● Крыягенныя трубкі з ушчыльняльнымі кольцамі падыходзяць для стандартных маразільных камер памерам 1 і 2 цалі, 48, 81, 96 і 100 лунак
  ● Аўтаклавуецца да 121°C і замарожваецца да -86°C

  НУМАР ЧАСТКІ	МАТЭРЫЯЛ	АБ'ЁМ	ВЕЧКАКОЛЕР	ПК/СУМКА	СУМКІ/ЧАХАЛ
  ACT05-BL-N	PP	0,5 мл	Чорны, жоўты, сіні, чырвоны, фіялетавы, белы	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 мл	Чорны, жоўты, сіні, чырвоны, фіялетавы, белы	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 мл	Чорны, жоўты, сіні, чырвоны, фіялетавы, белы	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 мл	Чорны, жоўты, сіні, чырвоны, фіялетавы, белы	500	10