冷冻管通常用于在充满液氮的杜瓦瓶中低温储存细胞系和其他关键生物材料。

在液氮中成功保存细胞涉及多个阶段。虽然基本原理是缓慢冷冻，但具体采用的技术取决于细胞类型和所用的冷冻保护剂。在如此低温下储存细胞时，需要考虑一些安全注意事项和最佳实践。

这篇文章旨在概述如何将冷冻管储存在液氮中。

什么是冷冻管

冷冻管是一种小型带盖小瓶，用于在极低温度下储存液体样本。冷冻管可确保保存在冷冻保护剂中的细胞不会与液氮直接接触，从而最大限度地降低细胞破碎的风险，同时仍能享受液氮的极致冷却效果。

西林瓶通常有多种容量和设计可供选择——可以是内螺纹或外螺纹，底部可以是平底或圆底。此外，还提供无菌和非无菌规格。

谁使用赛洛维亚人将细胞储存在液氮中

许多 NHS 和私人实验室以及专门从事脐带血库、上皮细胞生物学、免疫学和干细胞生物学的研究机构都使用冷冻管来冷冻保存细胞。

以这种方式保存的细胞包括 B 细胞和 T 细胞、CHO 细胞、造血干细胞和祖细胞、杂交瘤、肠细胞、巨噬细胞、间充质干细胞和祖细胞、单核细胞、骨髓瘤、NK 细胞和多能干细胞。

如何在液氮中保存冷冻管概述

冷冻保存是一种通过将细胞和其他生物结构冷却至极低温度来保存它们的过程。细胞可以在液氮中保存数年而不会丧失活力。以下是所采用程序的概述。

细胞制备

样品制备的具体方法因细胞类型而异，但通常情况下，收集细胞并离心，形成富含细胞的沉淀物。然后将该沉淀物重新悬浮在与冷冻保护剂或冷冻保存液混合的上清液中。

冷冻保存培养基

该培养基用于在低温环境中保存细胞，通过抑制细胞内外晶体的形成，从而防止细胞死亡。其作用是在冷冻、储存和解冻过程中为细胞和组织提供安全的保护环境。

将新鲜冷冻血浆 (FFP)、肝素化血浆溶液或无血清、无动物成分溶液等培养基与二甲基亚砜 (DMSO) 或甘油等冷冻保护剂混合。

将重新液化的样品颗粒分装到聚丙烯冷冻管中，例如苏州艾斯生物医药公司低温储存瓶.

重要的是不要将冷冻管装得太满，因为这会增加破裂的风险，并可能释放出内容物 (1)。

控制冻结速率

一般来说，采用缓慢控制的冷冻速度可以成功冷冻保存细胞。

将样本分装到低温冻存管中后，将其置于湿冰或4℃冰箱中，并在5分钟内开始冷冻程序。一般而言，细胞的冷却速度为每分钟-1至-3个细胞(2)。这可以通过使用可编程冷却器或将冻存管放入隔热盒中，置于-70°C至-90°C的控温冷冻柜中来实现。

转移到液氮

然后将冷冻的低温小瓶转移到液氮罐中，并无限期地保持低于-135℃的温度。

这些超低温可以通过浸入液相或气相氮来获得。

液相还是气相？

众所周知，液相氮储存可以保持绝对一致的低温，但由于以下原因，通常不建议这样做：

• 需要大量（深度）液氮，这是一个潜在的危险。由此造成的烧伤或窒息是真实存在的危险。
• 有记录显示，曲霉菌、乙肝和病毒等传染性病原体通过液氮培养基传播，造成交叉污染（2,3）
• 浸泡过程中液氮可能泄漏到小瓶中。当从储存容器中取出并加热至室温时，氮气会迅速膨胀。因此，小瓶在从液氮储存容器中取出时可能会破碎，造成飞溅的碎片和接触内容物造成的危险 (1, 4)。

出于这些原因，超低温储存通常采用气相氮气。当样品必须储存在液相中时，应使用专门的cryoflex管。

气相的缺点是可能出现垂直温度梯度，导致温度在-135℃至-190℃之间波动。这需要仔细且勤勉地监测液氮水平和温度变化(5)。

许多制造商建议冷冻管适合储存在低至 -135℃ 的温度下或仅在气相中使用。

解冻冷冻保存的细胞

解冻过程对冷冻培养物来说压力很大，需要适当的操作和技术来确保细胞的最佳活力、恢复和功能。具体的解冻方案取决于具体的细胞类型。然而，快速解冻被认为是以下情况的标准方法：

• 减少对细胞恢复的影响
• 帮助减少冷冻介质中溶质的暴露时间
• 尽量减少冰重结晶造成的损害

通常使用水浴、珠浴或专门的自动化仪器来解冻样品。

最常见的是，每次解冻 1 个细胞系 1-2 分钟，方法是在 37℃ 水浴中轻轻旋转，直到小瓶中只剩下少量冰，然后在预热的生长培养基中清洗。

对于某些细胞（例如哺乳动物胚胎）来说，缓慢升温对于它们的生存至关重要。

这些细胞现在可以进行细胞培养、细胞分离，或者在造血干细胞的情况下进行活力研究，以保证在骨髓清除治疗之前供体干细胞的完整性。

通常的做法是取少量用于细胞计数的预洗样品，以确定用于接种培养的细胞浓度。然后，您可以评估细胞分离程序的结果并确定细胞活力。

冷冻管储存的最佳实践

冷冻管中样本的成功冷冻保存取决于协议中的许多要素，包括正确的储存和记录保存。

• 在存储位置之间拆分单元格– 如果体积允许，将细胞分装到小瓶中并存放在不同的位置，以减少因设备故障导致样品丢失的风险。
• 防止交叉污染– 选择一次性无菌低温小瓶或在后续使用前进行高压灭菌
• 使用适合你的细胞大小的试管– 药瓶的容量范围为 1 至 5 毫升。避免药瓶装得太满，以降低破裂的风险。
• 选择内部或外部螺纹的低温瓶– 一些大学建议使用内螺纹小瓶作为安全措施——它们还可以防止在填充过程中或储存在液氮中时受到污染。
• 防止泄漏- 使用双注塑密封件模制在螺帽或 O 形圈中，以防止泄漏和污染。
• 使用二维条形码并标记小瓶– 为确保可追溯性，药瓶采用大面积书写区域，方便每个药瓶进行充分标记。二维条码有助于存储管理和记录保存。彩色瓶盖更易于识别。
• 充足的存储维护- 为确保细胞不丢失，储存容器应持续监测温度和液氮液位。应安装警报装置，提醒用户注意错误。

安全预防措施

液氮已成为现代研究中的常见做法，但如果使用不当，则会带来严重伤害的风险。

处理液氮时，应穿戴适当的个人防护装备 (PPE)，以最大程度地降低冻伤、烧伤和其他不良事件的风险。穿戴

• 低温手套
• 实验室外套
• 耐冲击的全脸防护罩，同时覆盖颈部
• 包头鞋
• 防溅塑料围裙

液氮冰箱应放置在通风良好的区域，以最大程度地降低窒息风险——逸出的氮气会蒸发并取代大气中的氧气。大容量冰箱应安装低氧报警系统。

处理液氮时最好两人一组，并且应禁止在正常工作时间以外使用。

支持您工作流程的冷冻管

苏州艾斯生物医学公司提供丰富的产品选择，满足您不同类型细胞的冷冻保存需求。产品组合包括一系列试管以及一系列无菌冷冻管。

我们的冷冻管是：

• 实验室螺旋盖 0.5mL 1.5mL 2.0mL 冷冻管 锥形底冷冻管 带垫圈

  ● 0.5ml、1.5ml、2.0ml规格，有裙边或无裙边
  ● 锥形或自立式设计，无菌或非无菌均可
  ● 螺旋盖管由医用级聚丙烯制成
  ● PP 冻存管可反复冷冻和解冻
  ●外置盖设计，降低样品处理过程中的污染概率。
  ● 螺旋盖低温管通用螺纹
  ● 管子适合大多数常见的转子
  ● 低温管O型圈管适合标准1英寸和2英寸、48孔、81孔、96孔和100孔冷冻盒
  ● 可高压灭菌至121°C，可冷冻至-86°C

  零件编号	材料	体积	帽颜色	件/包	包/箱
  ACT05-BL-N	PP	0.5毫升	黑色、黄色、蓝色、红色、紫色、白色	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5毫升	黑色、黄色、蓝色、红色、紫色、白色	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5毫升	黑色、黄色、蓝色、红色、紫色、白色	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0毫升	黑色、黄色、蓝色、红色、紫色、白色	500	10