Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasi CSS-ni cheklangan darajada qo‘llab-quvvatlaydi. Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o‘chirib qo‘ying). doimiy qo'llab-quvvatlash, biz uslublar va JavaScript holda saytni ko'rsatadi.
Atrof-muhit namunalarini kuzatishning ahamiyati COVID-19 pandemiyasining boshidan beri yuqori baholandi va qPCR-ga asoslangan texnikalar qimmat boʻlsa-da, baʼzi monitoring ishlari oltin standart yordamida amalga oshirilmoqda. DNKning elektrokimyoviy biosensorlari potentsial tejamkorlikni taʼminlashi mumkin. past va o'rta daromadli mamlakatlarda ekologik suv namunalarini monitoring qilish uchun yechim. Ushbu ishda biz ENIG yordamida ko'l suvi namunalaridan (SARS-CoV-2 uchun mashhur surrogat) ajratilgan Phi6 fagidan olingan amplikonlarni elektrokimyoviy aniqlashni namoyish qilamiz. PCB elektrodlarini sirtni o'zgartirmasdan bajarish uchun.Jinsiy aloqa. Elektrokimyoviy datchikning javobi har xil uzunlikdagi ikkita DNK fragmentlari (\({117}\,\hbox {bp}\) va \({503}\,\hbox {bp}\)) uchun batafsil tavsiflangan va PCR master aralashmalaridagi tuzlarning metilen ko'k (MB)-DNK o'zaro ta'siri.Bizning natijalarimiz DNK fragmentlarining uzunligi elektrokimyoviy sezgirlikni sezilarli darajada aniqlashini ko'rsatadi va bu ishda PCR mahsulotlarini gel bilan tozalashsiz uzoq amplikonlarni aniqlash qobiliyatini ko'rsatadi. suv namunalarini in situ o'lchash uchun muhim ahamiyatga ega.Virusli yuk uchun to'liq avtomatlashtirilgan yechim yaxshi natijalar beradi.
Suv orqali virus yuqishi 1940-yillardan beri poliomielit va gepatit E1 ning suv orqali yuqishi haqida birinchi dalil boʻlganidan beri aholi salomatligi uchun xavf sifatida maʼlum boʻldi. Jahon sogʻliqni saqlash tashkiloti (JSST) oʻrtacha va yuqori sogʻliq uchun ahamiyatli boʻlgan bir nechta suv orqali yuqadigan virusli patogenlarni tasnifladi2.Traditional virus aniqlash usullari oltin standart qPCR-ga asoslangan texnikaga tayanadi, ular juda sezgir va o'ziga xosdir, lekin qimmatbaho asboblar yordamida laboratoriyada sinovdan o'tkazish uchun malakali xodimlarni talab qiladi. Biroq, cheklangan resurslarga ega past va o'rta daromadli mamlakatlarda (LMIC) odamlar Namuna sinovi atrof-muhitdagi suv namunalarini monitoring qilishdan ustun bo'lishi mumkin. Shuning uchun past va o'rta daromadli mamlakatlarda suv va oqava suv namunalarini barqaror, real vaqt rejimida monitoring qilish uchun muqobil arzon usullar kerak bo'lib, yangi paydo bo'ladigan kasalliklarning erta ogohlantirishi, Shunday qilib, ularni virus pandemiyasining jiddiy ijtimoiy-iqtisodiy ta'siridan himoya qiladi. Nuklein kislotalar uchun arzon elektrokimyoviy biosensorlar ushbu qondirilmagan ehtiyojga istiqbolli potentsial yechim bo'lishi mumkin. Bu DNK biosensorlarining ko'pchiligi qo'shimcha DNK zanjirlarining elektrodda immobilizatsiya qilinishi bilan ishlaydi. Namunada mos keladigan ketma-ketlik mavjud bo'lganda sirt va gibridlanadi. Bu keyinchalik kaliy temir/ferrosiyanid kabi redoks vositachilaridan foydalangan holda turli elektrokimyoviy usullar bilan signalga aylantirilishi mumkin. Metilen ko'k (MB) ana shunday redoks-aktiv molekulalardan biridir. Bir zanjirli DNK 5,6 ga koʻproq nospetsifik bogʻlanishiga qoʻshimcha ravishda ikki zanjirli DNK (dsDNK) ga interkalatsiyalanishi haqida xabar berilgan.5,6. MB-ning MB-DNK komplekslarini hosil qilish uchun interkalatsiyalash xususiyati ularni bir nechta elektrokimyoviy DNKda redoks mediatorlari sifatida mashhur tanlovga aylantiradi. Sensor konfiguratsiyalari5,6,7,8,9. MB ning DNKga interkalatsiyasi nospesifik bo'lsa-da va bu elektrokimyoviy sensorning o'ziga xosligi ko'p jihatdan PCR yoki izotermik kuchaytirish uchun ishlatiladigan primerlarning tozaligiga bog'liq bo'lsa-da, u haqiqatni amalga oshirish uchun juda mos keladi. -vaqt elektrokimyoviy asoslangan qPCR yoki floresan izotermik kuchaytirish DNK konsentratsiyasini o'lchashga muqobil sifatida 9 .Bunday amaliyotlardan birida Won va boshqalar. Oltin elektrodlarning yuzasi real vaqt rejimida 6-merkapto-1-geksanol (MCH) bilan o'zgartirildi. differensial impulsli voltametriya (DPV) yordamida MB bilan PCR amplikonlarini o'lchash reaksiyalar vaqtida amplikonlarni elektrokimyoviy aniqlash uchun mo'ljallangan mikrofluidik PCR platformasida in situ elektrodlari kabi ishlatiladi 8 .Bu tadqiqotlarning barchasi elektrodlarning sirtini o'zgartirishni talab qiladi, bu esa ushbu funktsional elektrodlarning barqarorligi uchun maxsus saqlash talablari tufayli ishlab chiqarish va operatsion xarajatlarni oshirishni nazarda tutadi.
Ko'l suvi namunalarida konsentrlangan virusli zarrachalardan olingan amplikonlarni elektrokimyoviy aniqlash uchun ish jarayonining sxemasi.
Yaqinda biz SARS-CoV-2 amplikonlarini DPV va o'zgartirilmagan elektrodlar yuzasida MB-DNK komplekslarining adsorbsiyasi natijasida paydo bo'lgan tsiklik voltametriya (CV) ga asoslangan arzon narxlardagi bosilgan elektron plata (PCB) elektrodlari bilan elektrokimyoviy zondlashni namoyish qildik. joriy 11.Biz CDC tomonidan tavsiya etilgan N1 oldinga va N2 teskari primerlar yordamida hosil qilingan uzunroq DNK fragmentlari (N1-N2, \({943}\, \hbox) qisqaroq fragmentlar bilan solishtirganda {bp}\)) sensor javobida yaxshi chiziqlilikni ko'rsatganligini xabar qilamiz. ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) N1 oldinga va N1 teskari primer to'plamlari yordamida hosil qilingan. Ushbu tadqiqotlar nukleazsiz suvda tayyorlangan DNK suyultirishlari yordamida xabar qilingan. Platforma SARS-CoVni aniqlash uchun ham ishlatilgan. Simulyatsiya qilingan oqava suv namunalarida -2 amplikon (SARS-CoV-2 RNK bilan umumiy RNK namunalarini ko'paytirish yo'li bilan olingan). RNK izolyatsiyalash va quyi oqimda qayta ishlash jarayonida kesishga moyil bo'lgani uchun,12,13 bu heterojen namuna bilan uzunroq fragmentlarni kuchaytirish qiyin. Shu sababli, oqava suvda SARS-CoV-2 amplikonini elektrokimyoviy sezish namoyishi qisqaroq \(72\,\hbox {bp}\) N1 fragmenti bilan cheklangan.
Ushbu ishda biz ko'l suvi namunalaridan kontsentrlangan va ajratilgan Phi6 fagini ENIG PCB asosidagi elektrokimyoviy zondlashning maqsadga muvofiqligini o'rgandik (1-rasm). Phi6 faglari hajmi (80-100 nm) bo'yicha SARS-CoV-2 va shuningdek, lipid membranasi va boshoq oqsiliga ega. Shu sabablarga ko'ra Phi6 bakteriofag SARS-CoV-2 va boshqa o'ralgan patogen RNK viruslari uchun mashhur surrogatdir14,15. Fag zarralaridan ajratilgan RNK cDNK sintezi uchun shablon sifatida ishlatilgan. Uzunligi 117 va 503 ta asosiy juftlikdan iborat ikkita DNK fragmentini olish uchun PCR. Oldingi ishimizda \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 fragmentlarini kuchaytirish qiyinligini hisobga olib, biz oraliq uzunlikdagi fragmentlarni (\(117) maqsad qilib oldik. \,\hbox {bp}\) va \(503 \,\hbox {bp}\)), mavjud primerlarga asoslangan. Elektrokimyoviy datchikning javobi keng konsentratsiya diapazonida (\({10}\,{) tizimli ravishda oʻrganilgan. \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) dan \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Har ikki fragment uchun MB ning mavjudligi, tuzning sensor javobiga ta'siri spektrofotometrik o'lchovlar bilan tavsiflangan va o'zaro tasdiqlangan. Ushbu ishning asosiy hissasi quyidagilardir:
DNK fragmentining uzunligi va namunadagi tuzning mavjudligi sezgirlikka kuchli ta'sir qiladi.Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, elektrokimyoviy faollik MB, DNK va sensorning voltametrik javobdagi o'zaro ta'sirining turli mexanizmlariga bog'liq, DNK kontsentratsiyasi va uzunligiga qarab, uzunroq Fragmentlar yuqori sezuvchanlikni ko'rsatadi, garchi tuz o'rtasidagi elektrostatik o'zaro ta'sirga salbiy ta'sir ko'rsatadi. MB va DNK.
DNK kontsentratsiyasi o'zgartirilmagan elektrodlarda MB-DNK o'zaro ta'sir mexanizmini aniqlaydi Biz MB-DNK o'zaro ta'sirining turli mexanizmlari DNK kontsentratsiyasiga bog'liqligini ko'rsatamiz. DNK kontsentratsiyasida oz miqdorda \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox) {l}}}\), biz elektrokimyoviy oqim reaktsiyasi asosan MB-DNKning elektrodga adsorbsiyasi bilan, past konsentratsiyalarda esa DNKning yuqori konsentratsiyasida elektrokimyoviy oqim reaktsiyasi redoksning sterik inhibisyoni bilan aniqlanganligini kuzatdik. DNK tayanch juftlari orasiga MB qo'shilishi tufayli faollik.
Ko'l suvi namunalarida virusli nuklein kislotalarning ENIG PCB asosidagi elektrokimyoviy sensori Kuzatishlar Povay ko'li, IIT Mumbay kampusidagi suv namunalaridan olingan Phi6 qo'shilgan \(503\,\hbox {bp}\) DNK parchalarini elektrokimyoviy aniqlash orqali tasdiqlandi. Natija fag.
Amalga oshirishning arzonligi va uzoqroq saqlash muddati bo'lgan elektrodlardagi to'liq avtomatlashtirilgan monitoring tizimlari, oligonükleotidlar yoki aptamerlarga integratsiya qilish imkoniyati.
Phage Phi6 Cytoviridae oilasiga mansub dsRNK virusi boʻlib, Pseudomonas syringae ni yuqtiradi. Phi6 fagining genomi 3 ta fragment shaklida mavjud: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) va L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Phi6 fagi patogen boʻlmagan BSL-1 Pseudomonas shtammini yuqtirgani uchun undan foydalanish xavfsizdir. va laboratoriyada osongina o'stirilishi mumkin.Phage Phi6 va uning xosti Pseudomonas syringae Feliks d'Herelle bakterial viruslar uchun ma'lumot markazi, Laval universiteti, Kanadadan sotib olingan (ma'lumot markazining katalog raqamlari mos ravishda HER-102 va HER-1102). .Phi6 fagi va uning xosti mos yozuvlar markazi ko'rsatmasi bo'yicha jonlantirildi. Phi6 Phi6 plastinka lizis va elutsiya yo'li bilan tozalandi va yakuniy titrlarni \(\taxminan 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (blyashka hosil qiluvchi birliklar/ millilitr). RNK ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq GenElute™ Universal Total RNK Purification Kit (Sigma-Aldrich) yordamida tozalangan fag zarralaridan ajratilgan. Qisqacha aytganda, tozalangan fag Phi6 suspenziyasi\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) lizislandi va lizat RNKning qatronlar ustuniga bogʻlanishiga imkon berish uchun spin ustuniga yuklandi .Soʻngra RNK elyusiya eritmasida elutsiya qilinadi \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) to'plam tomonidan taqdim etilgan. RNK kontsentratsiyasini yutish orqali \(260\,\hbox {nm}\) hisoblang. RNK \\da alikvotlarda saqlangan. ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) keyingi foydalanishgacha.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA sintez toʻplami (Bio) -Rad Laboratories) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq cDNK sintezi uchun shablon sifatida ishlatilgan. Qisqacha aytganda, cDNK sintez reaktsiyasi 3 bosqichdan iborat: astarlash \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\) ning \({46}\,{^{\circ) da teskari transkripsiyasi }\hbox {C}}\) va teskari Yozuv moslamasi \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) ichida \({1}\,{\hbox {min) }}\).1% agaroz jelida ishlaganda, cDNK kutilgan uchta RNK fragmentiga mos keladigan uchta bandni ko'rsatdi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Quyidagi primerlar uzunligi 117 va 503 bp bo'lgan ikkita DNK fragmentini kuchaytirish uchun ishlatilgan, miniPCR® mini8 termal siklida PCR uchun shablon sifatida cDNKdan foydalanish:
\(117\,\hbox {bp}\) va \(503\,\hbox {bp}\) uchun primerlar M segmentining 1476-1575 nukleotidlariga va L segmentining 458-943 nukleotidlariga mos ravishda kislotaga mos keladi. .Barcha kuchaytirilgan PCR mahsulotlari 1% agaroz jellarida elektroforezlandi va kuchaytirilgan maqsadli DNK GeneJET Gel ekstraksiya to‘plami (Thermo Fisher Scientific) yordamida tozalandi.
IIT Mumbay kampusidagi ko'l (Powai ko'li, Powai, Mumbay) fag zarralarini qo'shish uchun ishlatilgan. Ko'l suvini olib tashlash uchun \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) membranadan filtrlangan. to'xtatilgan zarralar, so'ngra Phi6 fag qo'shildi. \({1}\,{\hbox {ml}}\) dan \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} qo'shing. \) \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) filtrlangan ko'l suvi, \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Kichik alikvot edi Blyashka tahlili orqali virus yukini o'lchash uchun ajratilgan. Biz Phi6 virusi zarralarini konsentratsiyalashning ikki xil usulini sinovdan o'tkazdik: (1) alyuminiy gidroksidni adsorbtsiyalash-cho'ktirish usuli,19 u atrof-muhit namunalaridan bir nechta o'ralgan RNK viruslari kontsentratsiyasi uchun tasdiqlangan va (2) ) Polietilen glikol (PEG) asosidagi virus kontsentratsiyasi usuli Flood va boshqalardan moslashtirilgan.20 .PEGga asoslangan usulning qayta tiklash samaradorligi alyuminiy gidroksid usuliga qaraganda yaxshiroq ekanligi aniqlanganligi sababli, PEGga asoslangan usul ko'l suvi namunalaridan Phi6 zarralarini konsentratsiyalash uchun ishlatilgan.
PEG usuli quyidagicha edi: PEG 8000 va \(\hbox {NaCl}\) 8% PEG 8000 va \(0,2\,\hbox {M} \) olish uchun Phi6-shpikli ko'l suvi namunalariga qo'shildi. \ hbox {NaCl}\).Namunalar shakerda inkubatsiya qilindi\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), keyin \(4700 \,\hbox {g}\) da sentrifugalanadi \({45}\,{\hbox {min}}\). Supernatantni tashlang va granulani \({1}\, {\hbox {ml}}\) bir xil supernatantda. Barcha spiking va virus kontsentratsiyasi tajribalari uch nusxada amalga oshirildi. Konsentratsiyadan so'ng, kichik alikvot blyashka tahlili bilan tiklanish samaradorligini o'lchash uchun ajratildi. RNK avval tavsiflanganidek ajratildi va elutsiya qilindi. to'plam bilan ta'minlangan elutsiya buferida\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). RNK kontsentratsiyasi namunadan namunaga uch nusxada o'zgarib turishi sababli, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) RNK kontsentratsiyasidan qat'i nazar, har uchala uchun ishlatiladi namunalar cDNK sintezi.cDNK sintezi yuqorida tavsiflanganidek amalga oshirildi.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNK \ ({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) \ (117\,\hbox {bp}\) va \(503\,\hbox {) ni kuchaytirish uchun 35 tsikl uchun PCR uchun shablon sifatida ishlatilgan. bp}\) fragmentlar. Ushbu namunalar "1:1" shaklida, ya'ni suyultirilmagan holda taqdim etilgan. Salbiy nazorat sifatida shablonsiz boshqaruv (NTC) o'rnatildi, tozalangan fagdan ajratilgan RNK yordamida sintez qilingan cDNK esa o'rnatildi. ijobiy nazorat (PC) uchun shablon sifatida. Miqdoriy PCR (qPCR) Stratagene Mx3000P RT-PCR asbobida Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies) yordamida amalga oshirildi. Reaksiyalar avvalgidek uch nusxada o'rnatildi. Barcha namunalar uchun sikl chegarasi (Ct) qayd etildi. Bundan tashqari, suyultirilgan namunalar filtrlangan ko‘l suvida 1:100 nisbatda suyultirilgan cDNK yordamida \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) bo‘ldi. \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) 35 sikl uchun PCR. Bu namunalar “1:100″ sifatida ifodalanadi.
PCB elektrodlari sotuvda mavjud bo'lgan arzon narxlardagi Elektrosiz Nikel Oltin (ENIG) jarayonidan foydalanib, qo'shimcha oltin qoplamani talab qilmasdan ishlab chiqariladi. ENIG PCB elektrodining texnik xususiyatlari oldingi ishimizda batafsil yoritilgan11. ENIG PCB elektrodlari uchun an'anaviy elektrodlarni tozalash usullari, masalan Piranya eritmasi yoki sulfat kislota siklik voltammetriyasi tavsiya etilmaydi, chunki ular yupqa oltin qatlamning (qalinligi \(\taxminan\) \(100\,\hbox {nm }\)) poʻstlogʻini yoʻqotishi va moyillik ostidagi mis qatlamlarini ochishi mumkin. korroziyaga 21, 22, 23, 24, 25. Shuning uchun elektrodlarni IPA bilan namlangan tuklarsiz mato bilan tozalang. Tekshiriladigan namuna \({50}\,{\upmu \hbox {M}) bilan inkubatsiya qilingan. }\) Oson kiritish uchun \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) ichida MB. Oldingi ishimizda , biz sensorning sezgirligi va chiziqliligi MB konsentratsiyasini oshirish orqali yaxshilanganini kuzatdik 11 . Oldingi ishimizda bildirilgan optimallashtirishlar asosida biz \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB dan foydalandik. Ushbu tadqiqotda DNKni joylashtirish uchun konsentratsiyalar. Ikki zanjirli DNKni (ds-DNK) elektrokimyoviy aniqlashga anion yoki katyonik interkalatorlar yordamida erishish mumkin. Anion interkalatorlar DNKni yaxshi selektivlik bilan aniqlasa-da, ular tun davomida inkubatsiyani talab qiladi, natijada aniqlash vaqtlari ko'proq bo'ladi.On boshqa tomondan, MB kabi katyonik interkalatorlar ds-DNK6 ni elektrokimyoviy aniqlash uchun qisqaroq inkubatsiya vaqtlarini talab qiladi, taxminan \({1}\,{\hbox {h}}\). elektrod\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), so'ngra boshqa namunaga o'tishdan oldin IPA namlangan latta bilan tozalang.bitta o'lchov. Har bir namuna 5 ta turli elektrodda sinovdan o'tkazildi, agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa.DPV va CV o'lchovlari PalmSens Sensit Smart potentsiostat yordamida amalga oshirildi va PSTrace dasturi potentsiostat konfiguratsiyasi va ma'lumotlarni yig'ish, jumladan, eng yuqori oqim hisoblari uchun ishlatilgan. Quyidagi sozlamalar qo'llaniladi. DPV va CV o'lchovlari uchun:
DPV: Muvozanat vaqti = \(8\,\hbox {s}\), kuchlanish bosqichi = \(3\,\hbox {mV}\), impuls kuchlanishi = \(25\,\hbox {mV}\), zarba davomiyligi = \(50\,\hbox {ms}\), skanerlash tezligi = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
Rezyume: Muvozanat vaqti = \(8\,\hbox {s}\), kuchlanish bosqichi = \(3\,\hbox {mV}\), tozalash tezligi = \({300}\,\hbox {mV/s) }\)
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB bilan komplekslangan DNK voltammogrammalaridan olingan maksimal oqimlar: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV va CV voltammogrammalari DNK bilan komplekslangan ENIG PCB elektrodlari \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB (10-\({20}\,{\ hbox {ng) konsentratsiyasida) olingan. }/{\upmu \hbox {l}}}\) ya'ni \(117\,\hbox {bp}\ ) va 0,03 uchun 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) uchun \(503\,\hbox {bp}\)). Reprezentativ voltamogrammalar S1-rasmda Qoʻshimcha maʼlumotlarda koʻrsatilgan. 2-rasmda natijalar koʻrsatilgan. Jel bilan tozalangan PCR mahsulotlaridan foydalangan holda DPV va CV o'lchovlari (cho'qqi oqim). CV o'lchovlari bilan solishtirganda, DPV o'lchovlari yuqori sezuvchanlikni ko'rsatadi (DNK kontsentratsiyasining funktsiyasi sifatida joriy), chunki CV o'lchovlaridagi fon sig'imli oqimlari Faradaik oqimlarni yashiradi 26 .Ma'lumotlar qutidagi har bir quti uchun 5 ta elektroddan olingan o'lchovlar mavjud. Barcha o'lchovlar elektroddan elektrodga o'zgarishi sababli o'lchash xatolariga yo'l qo'ymaslik uchun bir xil elektrodlar to'plamidan foydalanadi. Biz DNKning past konsentratsiyasi uchun DPV va CV o'lchanadigan cho'qqi oqimlarining ortib borayotgan tendentsiyasini kuzatdik. , uzunroq (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ bilan solishtirganda \(117) ) fragment. Bu avvalgi ishimizda qayd etilgan elektrod adsorbsiyasining kutilgan tendentsiyasiga mos keladi. MB-DNK kompleksining adsorbsiyasi elektrodda zaryad o'tkazilishini osonlashtiradi, bu esa maksimal oqimning oshishiga yordam beradi.Boshqa tadqiqotlar MB-DNK interkalatsiyasiga oligonükleotidlar hajmi va ketma-ketligining ta'sirini ko'rsatdi27,28,29,30. Guanin Ikki amplikonning (\(117\,\hbox {bp}\) va \(503\,\hbox {bp}\)) tarkibidagi -sitozin (GC) taxminan 50% ni tashkil etdi, bu kuzatish shuni ko'rsatadiki, farq tufayli amplikon uzunligiga. Biroq, yuqori DNK kontsentratsiyasi uchun (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp} uchun) \) va \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) uchun \(117\,\hbox {bp}\)), biz ikkita kuchaytirishni kuzatamiz. Subslarning eng yuqori oqimlari ham DPV, ham CV o'lchovlarida kamayadi.Buning sababi MB ning DNKning asosiy juftlari o'rtasida to'yinganligi va interkalatsiyalanishi, natijada MB31,32 da qaytariladigan guruhning redoks faolligi sterik inhibisyoniga olib keladi.
mhnhbox \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503) \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
PCR master aralashmalarida mavjud bo'lgan tuzlar MB va DNK o'rtasidagi elektrostatik o'zaro ta'sirga xalaqit beradi, shuning uchun \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) bilan \({50} \,{\) qo'shiladi. upmu \hbox {M}}\) MB-DNK o'zaro ta'sirida tuzning ta'sirini o'rganish uchun MB jel bilan tozalangan mahsulot. 3-rasmda ko'rsatilganidek, DNKning yuqori konsentratsiyasi (\(>{2}\,{\) hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) va \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) uchun \(117\,\hbox {bp} \)), DPV va CV da Tuz qoʻshilishi oʻlchovlarga sezilarli taʼsir koʻrsatmadi (Voltammogrammalar uchun qoʻshimcha maʼlumotdagi S2-rasmga qarang). Biroq, DNK kontsentratsiyasi past bo'lsa, tuz qo'shilishi sezuvchanlikni sezilarli darajada pasaytiradi, natijada DNK kontsentratsiyasi bilan oqimning sezilarli o'zgarishi kuzatilmaydi. Tuzning MB-DNK o'zaro ta'siri va interkalatsiyasiga o'xshash salbiy ta'siri ilgari boshqa tadqiqotchilar tomonidan xabar qilingan33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) kationlari DNKning manfiy fosfat magistraliga bog‘lanadi va shu bilan MB va DNK o‘rtasidagi elektrostatik o‘zaro ta‘sirga to‘sqinlik qiladi. DNKning yuqori konsentratsiyasida redoks-aktiv MBlarning sterik inhibisyonu pastroq cho‘qqi oqimlariga olib keladi, shuning uchun elektrostatik o‘zaro ta’sirlar. Sensor javobiga sezilarli ta'sir ko'rsatmaydi. Muhim nuqta shundaki, bu biosensor yuqori DNK kontsentratsiyasini aniqlash uchun ko'proq mos keladi (kamdan-kam hollarda \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) yoki undan yuqori), PCR mahsulotlarini gel bilan tozalash imkonsiz bo'lishi mumkin bo'lgan ekologik suv namunalarini to'liq avtomatlashtirilgan qayta ishlash uchun.
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) bilan komplekslangan DNKning turli konsentrasiyalari uchun 600–700 \(\hbox {nm}\) toʻlqin uzunligi diapazoni uchun yutilish egri chizigʻi ostidagi maydon: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) tuzli va tuzsiz (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) tuzli va tuzsiz (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB namunalariga mos keladigan DNK konsentratsiyasi DNK yo'q.
Yuqoridagi natijalarni qo'shimcha tekshirish uchun biz UV/Vis spektrofotometri (Thermo Scientific Multiskan GO) yordamida optik o'lchovlarni amalga oshirdik, har birida \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) namunalari ishlatilgan. O'lchov. Yutish belgisi DNK kontsentratsiyasining ortishi bilan kamayadi, buni \(600\,\hbox {nm}\) to'lqin uzunligi diapazoni uchun yutilish egri chizig'i tendentsiyasidan \(700\,\hbox {) ko'rish mumkin. nm}\), 4-rasmda ko'rsatilganidek (Qo'shimcha ma'lumotda S3-rasmda ko'rsatilgan yutilish spektri). DNK konsentratsiyasi \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox dan kam bo'lgan namunalar uchun) {l}}}\), DNK oʻz ichiga olgan va faqat MB namunalari (\(503\,\hbox {bp}\) va \(117\,\hbox {bp}\ uchun) oʻrtasida qabul qilishda sezilarli farq yoʻq edi. ) uzunlik bo'laklari), redoks-aktiv MB ning sterik inhibisyonu yo'qligini ko'rsatadi. Yuqori DNK konsentratsiyasida biz absorbans signalining asta-sekin kamayishini kuzatdik va tuz ishtirokida absorbsiyaning kamroq pasayishini qayd etdik. Bu natijalar molekulyarga tegishli edi. DNK duragaylarida bazani yig'ish bilan o'zaro ta'sirlar va sterik inhibisyon. Bizning natijalar MB-DNK interkalatsiyasining spektroskopik tadqiqotlari bo'yicha adabiyotlardagi hisobotlarga mos keladi, ular gipoxromatiklikni \(\pi\)–\(\pi ^*\ energiya darajasining pasayishi bilan bog'laydi. ) interkalatsiya tufayli elektron o'tishlar 36, 37, 38 qatlamlari.
Phi6 fagining agaroz gel elektroforezi: ko'l suvi namunalaridan \(117\,\hbox {bp}\) va \(503\,\hbox {bp}\) uzunlikdagi PCR mahsuloti.M-DNK belgisi;NTC-shablonsiz boshqaruv, mos keladigan amplikonlarni o'z ichiga olgan primerlar;Kompyuterning ijobiy nazorati;1, 2, 3-suyultirilmagan (1:1) ko‘l suvi namunalari uch nusxada. \(503\,\) ichidagi foydalanilmagan oligonükleotidlar tufayli \(\taxminan 50\,\hbox {bp}\) da band ko‘rinadi. hbox {bp}\) qator.
Biz datchikning foydaliligini Phi6 faj bilan to‘ldirilgan Povay ko‘li suv namunalari yordamida baholadik. Fagli suv namunalaridan ajratilgan RNK kontsentratsiyasi 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {) oralig‘ida bo‘lgan. ml}}\), tozalangan fag suspenziyalaridan ajratilganlar esa RNK taxminan 1 tiklash samaradorligi bilan \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) deb baholangan. %.RNK cDNKga teskari transkripsiya qilindi va PCR va qPCR uchun shablon sifatida foydalanildi.Mahsulot hajmi sensor bilan sinovdan oldin agaroz gel elektroforezi bilan tasdiqlangan (5-rasm). qPCR paytida qayd etilgan Ct qiymatlari (1-jadval) mos keladigan suv namunalaridan ajratilgan RNK kontsentratsiyasi bilan bog'liqligi ko'rsatilgan. Ct qiymati floresan signal uchun zarur bo'lgan tsikllar sonini ko'rsatadi. chegara yoki fon signalidan oshib ketadi. Yuqori Ct qiymatlari shablon konsentratsiyasining pastligini ko'rsatadi va aksincha. NTC namunalarining Ct qiymatlari kutilgan darajada yuqori edi. \(\taxminan 3\) Ct qiymatlari orasidagi farq musbat nazorat va sinov namunasi bundan keyin har bir sinov namunasi musbat nazoratga nisbatan taxminan 1% shablonga ega ekanligini ko'rsatadi. Biz avvalroq uzunroq amplikonlar yaxshi sezuvchanlikka olib kelishini muhokama qilgan edik. Geterogen atrof-muhit namunalaridan ajratilgan uzunroq fragmentlarni kuchaytirish kamchiliklarni hisobga olgan holda qiyin. past virus konsentratsiyasi va RNK degradatsiyasi. Biroq, virusni boyitish va PCR kuchaytirish protokoli yordamida biz elektrokimyoviy zondlash uchun \(503\,\hbox {bp}\) fragmentini muvaffaqiyatli kuchaytira oldik.
6-rasmda eritilmagan cDNKni shablon sifatida (1:1) va 100 marta suyultirilgan cDNKni shablon sifatida (1:100) bajarilgan PCR dan foydalangan holda \(503\,\hbox {bp}\) fragment amplikonining elektrokimyoviy sensori natijalari ko'rsatilgan. , NTC va PC bilan solishtirganda (Voltammogrammalar uchun qo'shimcha ma'lumot bo'limidagi S4-rasmga qarang). 6-rasmdagi qutidagi har bir qutida 5 ta elektroddagi uchta namunadan olingan o'lchovlar mavjud. Elektrod tufayli xatolikka yo'l qo'ymaslik uchun barcha namunalarni o'lchash uchun bir xil elektrodlar ishlatilgan. -elektrodga o'zgarishi.CV o'lchovlari bilan solishtirganda, DPV o'lchovlari sinov va kompyuter namunalarini NTClardan ajratish uchun yaxshiroq aniqlikni ko'rsatadi, chunki avval aytib o'tilganidek, Faradaik oqimlar ikkinchisidagi fon sig'imli oqimlari tufayli yashiringan. Uzunroq amplikonlar uchun biz buni kuzatdik. Salbiy nazorat (NTC) musbat nazoratga nisbatan yuqori CV va DPV tepalik oqimlariga olib keldi, ijobiy va suyultirilmagan sinov namunalari esa DPV cho'qqi oqimlarining o'xshash tepalik balandligini ko'rsatdi. Har bir suyultirilmagan uchun o'lchangan o'rtacha va o'rtacha qiymatlar (1:1) ) sinov namunasi va kompyuter NTC namunasi uchun sensor chiqishidan aniq echilishi mumkin, shu bilan birga 1:100 suyultirilgan namunaning ruxsati kamroq aniq bo'ladi. cDNKning 100 marta suyultirilishi uchun biz jel elektroforezi paytida hech qanday tasmalarni kuzatmadik. (5-rasmda ko'rsatilmagan yo'llar) va mos keladigan DPV va CV tepalik oqimlari NTC uchun kutilganiga o'xshash edi. \(117\,\hbox {bp}\) fragmenti natijalari Qo'shimcha ma'lumotda ko'rsatilgan. Salbiy Elektroddagi erkin MB ning adsorbsiyasi va MB ning bir zanjirli primer oligonükleotid bilan o'zaro ta'siri tufayli nazorat PCB sensoridan elektrokimyoviy javobni keltirib chiqardi.Shuning uchun har safar namuna sinovdan o'tkazilganda, salbiy nazoratni ishga tushirish kerak va Sinov namunasini ijobiy yoki salbiy deb tasniflash uchun differentsial (nisbiy) o'lchovga erishish uchun manfiy nazorat bilan olingan eng yuqori oqim bilan solishtirganda sinov namunasining eng yuqori oqimi39,40.
(a) DPV va (b) ko'l suvi namunalarida \(503\,\hbox {bp}\) bo'laklarni elektrokimyoviy aniqlash uchun CV cho'qqi oqimi. Sinov namunalari uch nusxada o'lchandi va shablon nazorati (NTC) bilan solishtirildi va ijobiy boshqaruv elementlari (PC).
Bizning topilmalarimiz turli DNKlar uchun turli uzunlikdagi amplikonlar uchun elektrokimyoviy sensorlarning ishlashiga ta'sir qiluvchi turli mexanizmlarni ko'rsatadi, konsentratsiyalar UV/Vis spektrofotometri yordamida optik o'lchovlar bilan tasdiqlangan. Bizning kuzatishlarimiz DNK bo'laklari \(\taxminan\) gacha uzunroq ekanligi haqidagi tushunchani ta'kidlaydi. \(500\,\hbox {bp}\) yuqori sezuvchanlik bilan aniqlanishi mumkin va namunada tuz borligi sezuvchanlik DNK kontsentratsiyasi yuqori sezuvchanlikka ta'sir qiladi (kamdan-kam hollarda \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}\) va undan yuqori). Bundan tashqari, biz har xil turdagi namunalarning ta'sirini, shu jumladan tuz qo'shilgan va qo'shilmagan jel bilan tozalangan amplikonlarni va DPV va CV o'lchovlarida ko'l suvi namunalarini qo'shishni o'rgandik.Biz DPV yaxshi rezolyutsiyani ta'minlashini kuzatdik, chunki fon sig'imli oqim ham CV o'lchoviga ta'sir qiladi va uni kamroq sezgir qiladi.
Uzunroq fragmentlarning kuchayishi virus genomik RNKning yaxlitligiga bog‘liq. Bir qancha tadqiqotlar shuni ko‘rsatdiki, RNK ning atrof-muhitdagi degradatsiyasi va izolyatsiyalash vaqtida qo‘shilish ehtimoli tufayli uzunroq fragmentlarni kuchaytirish har doim ham samarali emas11,41,42,43,44 .Biz PEG asosidagi virus kontsentratsiyasi usuli alyuminiy gidroksid asosidagi virus kontsentratsiyasi usulidan ko'ra ko'l suvi namunalarida Phi-6 fagini konsentratsiyalashda samaraliroq ekanligini kuzatdik. Uzoq DNK parchalarini aniqlash qobiliyati multipleks PCR talabini engib o'tishini isbotladi. bir nechta qisqaroq uzunlikdagi shablonlarni kuchaytirish va o'zaro bog'liqlik ehtimolini kamaytirish uchun.
Biologik namunalar kam, shuning uchun sinov uchun minimal namunalarni talab qiladigan biosensorni loyihalashga ehtiyoj bor. Ushbu tadqiqotda foydalanilgan ENIG PCB elektrodlari faqat \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ talab qilinadi. ) elektrodlarning samarali maydonini qoplash uchun sinov uchun namunalar. Bundan tashqari, xuddi shu elektrodni keyingi namunani yuborishdan oldin tozalashdan keyin qayta ishlatish mumkin. Kuchaytirilgan namunalar metilen ko'kidan boshqa kimyoviy moddalarni qo'shishni talab qilmaydi, bu arzon va tez-tez ishlatiladigan kimyoviy. Har bir elektrodning ishlab chiqarilishi taxminan $0,55 (yoki 40 INR) turadi, bu biosensor mavjud aniqlash texnologiyalariga tejamkor muqobil bo'lishi mumkin. 2-jadvalda bu ishning adabiyotda uzoq vaqt davomida keltirilgan boshqa sensorlar bilan taqqoslanishi ko'rsatilgan. Geterogen namunalardagi DNK fragmentlari.
MB-ga asoslangan elektrokimyoviy aniqlash protokollari PCRning o'ziga xosligiga tayanishini hisobga olsak, bu usulning asosiy cheklovi chiqindi suv va ko'l suvi kabi heterojen namunalarda o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirilishi yoki past tozalikdagi primerlardan foydalanish imkoniyatidir. o'zgartirilmagan ENIG PCB elektrodlari yordamida tozalanmagan PCR mahsulotlarini DNKni aniqlash uchun elektrokimyoviy aniqlash usullari, foydalanilmagan dNTPlar va primerlar tomonidan kiritilgan xatolarni yaxshiroq tushunish va reaktsiya shartlari va tahlil protokollarini optimallashtirish kerak. pH, harorat va biologik kabi qo'shimcha fizik-kimyoviy parametrlar O'lchovning aniqligini oshirish uchun suv namunasining kislorodga bo'lgan ehtiyojini (BOD) ham o'lchash kerak bo'lishi mumkin.
Xulosa qilib aytganda, biz atrof-muhit (ko'l suvi) namunalarida virusni aniqlash uchun arzon elektrokimyoviy ENIG PCB sensorini taklif qilamiz. Sezuvchanlikni saqlab qolish uchun kriyojenik saqlashni talab qiladigan immobilizatsiyalangan oligonükleotid elektrodlari yoki DNKni aniqlash uchun maxsus substratlardan farqli o'laroq, bizning texnikamiz o'zgartirilmagan PCBdan foydalanadi. uzoqroq saqlash muddati va maxsus saqlash talablari bo'lmagan elektrodlar va shuning uchun LMIClarda qo'llaniladigan avtomatlashtirilgan namunalarni qayta ishlash bilan o'lchash echimlarini ishlab chiqish uchun mos keladi. Biosensor maqsadli amplikonlarni tezkor aniqlash uchun arzon DNK-interkalatsiya qiluvchi redoks bo'yoqlardan (MB) foydalanadi. Nonspesifik kuchaytirish atrof-muhit namunalarida keng tarqalgan MBlarning bir va ikki zanjirli oligonükleotidlarga o'ziga xos bo'lmagan bog'lanishi tufayli ushbu sezish usulining o'ziga xosligini pasaytiradi.Shuning uchun bu testning o'ziga xosligi primerlar va PCR reaktsiyasi shartlarini optimallashtirishga bog'liq.Bundan tashqari, CV va sinovdan o'tgan namunalardan olingan DPV cho'qqi oqimlari har bir test uchun salbiy nazoratdan (NTC) olingan javoblarga nisbatan talqin qilinishi kerak. Ushbu ishda taqdim etilgan elektrokimyoviy sensor dizaynlari va usullari to'liq avtomatlashtirilgan va past darajani ishlab chiqish uchun autosamplerlar bilan birlashtirilishi mumkin. -namunalarni to'plash va tahlil qilish va natijalarni laboratoriyaga simsiz uzatish mumkin bo'lgan xarajat echimi.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Suv namunalaridan viruslarning dastlabki kontsentratsiyasi usullari: so'nggi tadqiqotlarni ko'rib chiqish va meta-tahlil qilish.J.Ilova.mikroorganizm.115, 1-11-betlar (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Suv orqali o'tadigan viruslar: xavfsiz ichimlik suvi uchun to'siqlar. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. va boshqalar. Past va o'rta daromadli mamlakatlarda COVID-19 ni iqtisodiy jihatdan samarali keng ko'lamli nazorat qilish uchun oqava suv epidemiologiyasi: muammolar va imkoniyatlar.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nuklein kislota elektrokimyosi. Kimyoviy.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Tomson, AJ & Butt, JN Metilen ko'k oltin substratlarda immobilizatsiyalangan bir va ikki qatorli oligonükleotidlarning elektrokimyoviy diskriminatori sifatida. 126-tahlilchi, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ DNK gibridizatsiyasini elektrokimyoviy o'tkazish uchun kation va anion interkalatorlarini uzoq masofali elektron o'tkazish yo'li bilan taqqoslash.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ DNK orqali zaryad o'tkazish: selektiv elektrokimyoviy DNK biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH va boshqalar. Bir vaqtning o'zida elektrokimyoviy aniqlash.biologik sensor.Bioelektronika.24, 2131-2136 (2009) bilan real vaqtda PCR mikrofluidik qurilma.
Win, BY va boshqalar.Signal mexanizmini o'rganish va metilen ko'kning DNK bilan o'zaro ta'siriga asoslangan elektrokimyoviy real vaqtda PCR tizimining ishlashini tekshirish. Analyst 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG va boshqalar. Oqava suv namunalarida sars-cov-2 ni aniqlash uchun Loop vositachiligidagi izotermik kuchaytirishga asoslangan elektrokimyoviy sensor.J.Atrof-muhit.Kimyoviy.Britaniya.10, 107488 (2022).
Kumar, M. va boshqalar. PCB elektrodlari bilan SARS-CoV-2 amplikonlarini elektrokimyoviy aniqlash. Sensor faollashtirilgan. B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. SARS-CoV-2 RNKni chiqindi suvning qattiq qismida samarali aniqlash.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. va boshqalar. Oqava suvlarda SARS-CoV-2 ni aniqlashning analitik usullari: protokol va kelajak istiqbollari. TraC trendli anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Shisha yuzalarga yotqizilgan bug'langan so'lak tomchilarida Phi6 (SARS-CoV-2 surrogati) o'ralgan bakteriofagining omon qolishi.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Erkin yashovchi amyobada SARS-CoV-2 surrogatining (Phi6) ekologik barqarorligi.Suv salomatligi 20, 83 (2021).
Mindich, L. Ikki zanjirli RNK bakteriofagining uchta genomik fragmentlarining aniq qadoqlanishi \(\varphi\)6.mikroorganizm.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH RNK fagining ikkilamchi tuzilishi \ (\ varphi \) 6 qadoqlash mintaqasi. RNK 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al. Fags on the Tap - Bakteriofaglarning laboratoriya zahiralarini tayyorlash uchun tez va samarali protokol.PeerJ 4, e2261 (2016).
Yuborilgan vaqt: 27-may 2022-yil