Кріопробіркизазвичай використовуються для кріогенного зберігання клітинних ліній та інших критично важливих біологічних матеріалів у сосудах Дьюара, заповнених рідким азотом.

Існує кілька етапів успішного зберігання клітин у рідкому азоті. Хоча основним принципом є повільне заморожування, точна методика залежить від типу клітин та використовуваного кріопротектора. Існує кілька міркувань безпеки та найкращих практик, які слід враховувати під час зберігання клітин за таких низьких температур.

Ця публікація має на меті надати огляд того, як кріопробірки зберігаються в рідкому азоті.

Що таке кріопробірки

Кріопробірки – це невеликі флакони з кришками, призначені для зберігання рідких зразків за надзвичайно низьких температур. Вони гарантують, що клітини, що зберігаються в кріопротекторі, не контактуватимуть безпосередньо з рідким азотом, мінімізуючи ризик пошкодження клітин, водночас використовуючи надзвичайно високий охолоджувальний ефект рідкого азоту.

Флакони зазвичай доступні в різних об'ємах та конструкціях – вони можуть мати внутрішнє або зовнішнє різьблення, плоске або заокруглене дно. Також доступні стерильні та нестерильні формати.

Хто користуєтьсяСіровіалидля зберігання клітин у рідкому азоті

Низка лабораторій Національної служби охорони здоров'я та приватних лабораторій, а також дослідницькі установи, що спеціалізуються на банківському зберіганні пуповинної крові, біології епітеліальних клітин, імунології та біології стовбурових клітин, використовують кріопробірки для кріоконсервації клітин.

Клітини, збережені таким чином, включають B- та T-клітини, клітини CHO, гемопоетичні стовбурові клітини та клітини-попередники, гібридоми, кишкові клітини, макрофаги, мезенхімальні стовбурові клітини та клітини-попередники, моноцити, мієлому, NK-клітини та плюрипотентні стовбурові клітини.

Огляд зберігання кріопробірок у рідкому азоті

Кріоконсервація – це процес збереження клітин та інших біологічних структур шляхом охолодження їх до дуже низьких температур. Клітини можна зберігати в рідкому азоті роками без втрати життєздатності. Це короткий огляд використовуваних процедур.

Підготовка клітин

Точний метод приготування зразків залежатиме від типу клітин, але загалом клітини збирають та центрифугують для отримання багатого на клітини осаду. Потім цей осад ресуспендують у супернатанті, змішаному з кріопротектором або середовищем для кріоконсервації.

Кріоконсерваційне середовище

Це середовище використовується для збереження клітин у низькотемпературних середовищах, яким вони будуть піддаватися, шляхом пригнічення утворення внутрішньо- та позаклітинних кристалів і, отже, загибелі клітин. Їхня роль полягає у забезпеченні безпечного, захисного середовища для клітин і тканин під час процесів заморожування, зберігання та розморожування.

Середовище, таке як свіжозаморожена плазма (СЗП), розчин гепаринізованого плазмоліту або розчини без сироватки та тваринних компонентів, змішують з кріопротекторами, такими як диметилсульфоксид (ДМСО) або гліцерин.

Повторно розріджений осад зразка розподіляють по аліквотах у поліпропіленові кріопробірки, такі якКріогенні флакони для зберігання у компанії Suzhou Ace Biomedical.

Важливо не переповнювати кріопробірки, оскільки це збільшить ризик їх розтріскування та можливого витікання вмісту (1).

Контрольована швидкість заморожування

Зазвичай для успішної кріоконсервації клітин використовується повільна контрольована швидкість заморожування.

Після того, як зразки розподілені по кріогенних флаконах, їх поміщають на вологий лід або в холодильник при температурі 4℃, і процедуру заморожування починають протягом 5 хвилин. Як загальне правило, клітини охолоджують зі швидкістю від -1 до -3 за хвилину (2). Це досягається за допомогою програмованого охолоджувача або шляхом розміщення флаконів в ізольованій коробці, розміщеній у морозильній камері з контрольованою швидкістю за температури від -70°C до -90°C.

Перехід на рідкий азот

Заморожені кріогенні флакони потім переносять у резервуар з рідким азотом на невизначений термін за умови підтримки температури нижче -135℃.

Ці наднизькі температури можна отримати шляхом занурення в рідкий або пароподібний азот.

Рідка чи пароподібна фаза?

Відомо, що зберігання в рідкофазному азоті підтримує холодну температуру з абсолютною стабільністю, але часто не рекомендується з таких причин:

• Потреба у великих об'ємах (глибина) рідкого азоту, що є потенційною небезпекою. Опіки або задуха внаслідок цього є реальним ризиком.
• Задокументовані випадки перехресного забруднення інфекційними агентами, такими як аспергіллез, гепатит B, та поширення вірусу через рідке азотне середовище (2,3)
• Можливість потрапляння рідкого азоту у флакони під час занурення. Після виймання зі сховища та нагрівання до кімнатної температури азот швидко розширюється. Як наслідок, флакон може розбитися після виймання зі сховища рідкого азоту, створюючи небезпеку як від летючих уламків, так і від контакту з вмістом (1, 4).

З цих причин зберігання за наднизьких температур найчастіше здійснюється в пароподібному азоті. Коли зразки необхідно зберігати в рідкій фазі, слід використовувати спеціальні кріофлексні трубки.

Недоліком парової фази є те, що може виникати вертикальний градієнт температури, що призводить до коливань температури від -135℃ до -190℃. Це вимагає ретельного та старанного контролю рівня рідкого азоту та коливань температури (5).

Багато виробників рекомендують кріопробірки для зберігання за температури до -135℃ або для використання лише в пароподібній фазі.

Розморожування кріоконсервованих клітин

Процедура розморожування є стресовою для замороженої культури, тому для забезпечення оптимальної життєздатності, відновлення та функціональності клітин необхідне належне поводження та техніка. Точні протоколи розморожування залежатимуть від конкретних типів клітин. Однак швидке розморожування вважається стандартним для:

• Зменшення будь-якого впливу на відновлення клітин
• Допомагають скоротити час впливу розчинених речовин, присутніх у заморожувальних середовищах
• Мінімізуйте будь-які пошкодження від перекристалізації льоду

Для розморожування зразків зазвичай використовуються водяні бані, кулькові бані або спеціалізовані автоматизовані прилади.

Найчастіше розморожують одну клітинну лінію протягом 1-2 хвилин, обережно помішуючи їх у водяній бані при температурі 37℃, доки у флаконі не залишиться лише трохи льоду, перш ніж промивати їх у попередньо підігрітому середовищі для росту.

Для деяких клітин, таких як ембріони ссавців, повільне нагрівання є важливим для їхнього виживання.

Тепер клітини готові до культивування клітин, виділення клітин або, у випадку гемопоетичних стовбурових клітин, досліджень життєздатності, щоб гарантувати цілісність донорських стовбурових клітин перед мієлоаблятивною терапією.

Зазвичай беруть невеликі аліквоти попередньо промитого зразка, який використовується для підрахунку клітин, щоб визначити їх концентрацію для посіву в культуру. Потім можна оцінити результати процедур виділення клітин та визначити їх життєздатність.

Найкращі практики зберігання кріопробірок

Успішна кріоконсервація зразків, що зберігаються в кріопробірках, залежить від багатьох елементів протоколу, включаючи належне зберігання та ведення обліку.

• Розділення комірок між місцями зберігання– Якщо дозволяють об’єми, розділіть кювети між флаконами та зберігайте їх в окремих місцях, щоб зменшити ризик втрати зразків через несправності обладнання.
• Запобігання перехресному забрудненню– Перед подальшим використанням оберіть одноразові стерильні кріогенні флакони або автоклав.
• Використовуйте флакони відповідного розміру для ваших клітин– флакони випускаються об’ємом від 1 до 5 мл. Уникайте переповнення флаконів, щоб зменшити ризик їх розтріскування.
• Виберіть кріогенні флакони з внутрішнім або зовнішнім різьбленням– Деякі університети рекомендують використовувати флакони з внутрішнім різьбленням з міркувань безпеки – вони також можуть запобігти забрудненню під час наповнення або зберігання в рідкому азоті.
• Запобігання витоку- Використовуйте подвійні ущільнення, влиті в гвинтову кришку або кільця ущільнювачів, щоб запобігти протіканню та забрудненню.
• Використовуйте 2D штрих-коди та маркуйте флакони– для забезпечення відстеження флакони з великими полями для письма дозволяють належним чином маркувати кожен флакон. Двовимірні штрих-коди можуть допомогти в управлінні зберіганням та веденні обліку. Кольорове кодування кришок корисне для легшої ідентифікації.
• Належне обслуговування сховища- Щоб запобігти втраті клітин, у резервуарах для зберігання слід постійно контролювати температуру та рівень рідкого азоту. Слід встановити сигналізацію для сповіщення користувачів про помилки.

Заходи безпеки

Рідкий азот став поширеною практикою в сучасних дослідженнях, але несе ризик серйозних травм при неправильному використанні.

Щоб мінімізувати ризик обмороження, опіків та інших несприятливих інцидентів під час роботи з рідким азотом, слід використовувати належні засоби індивідуального захисту (ЗІЗ).

• Кріогенні рукавички
• Лабораторний халат
• Ударостійкий повнолицьовий щиток, який також закриває шию
• Взуття із закритим носком
• Бризкозахисний пластиковий фартух

Холодильники з рідким азотом слід розміщувати в добре провітрюваних приміщеннях, щоб мінімізувати ризик задухи – азот, що випаровується, витісняє атмосферний кисень. Сховища великого обсягу повинні бути обладнані системами сигналізації низького рівня кисню.

Ідеальною є робота в парах під час роботи з рідким азотом, а його використання поза звичайним робочим часом має бути заборонено.

Кріопробірки для підтримки вашого робочого процесу

Компанія Suzhou Ace Biomedical пропонує широкий вибір продуктів, що відповідають вашим потребам у кріоконсервації різних типів клітин. Асортимент включає низку пробірок, а також низку стерильних кріопробінок.

Наші кріопробірки:

• Лабораторна кришка з гвинтовою кришкою 0,5 мл 1,5 мл 2,0 мл Кріовіальні кріогенні флакони з конічним дном Кріопробірка з прокладкою

  ● Специфікація 0,5 мл, 1,5 мл, 2,0 мл, зі спідницею або без спідниці
  ● Доступні конічна або окремостояча конструкція, стерильна або нестерильна
  ● Тюбики з гвинтовою кришкою виготовлені з поліпропілену медичного класу
  ● Кріопробірки з поліпропілену можна багаторазово заморожувати та розморожувати
  ● Конструкція зовнішньої кришки може зменшити ймовірність забруднення під час обробки зразка.
  ● Кріогенні пробірки з гвинтовою кришкою Універсальна різьба для використання
  ● Трубки підходять для більшості поширених роторів
  ● Кріогенні трубки з кільцевими ущільнювачами підходять для стандартних морозильних камер діаметром 1 дюйм та 2 дюйми, на 48, 81, 96 та 100 лунок
  ● Автоклавується до 121°C та заморожується до -86°C

  НОМЕР ЧАСТИНИ	МАТЕРІАЛ	ОБ'ЄМ	Загальна торгова зонаКОЛІР	ПК/СУМКА	СУМКИ/ФУТБОЛ
  ACT05-BL-N	PP	0,5 мл	Чорний, жовтий, синій, червоний, фіолетовий, білий	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 мл	Чорний, жовтий, синій, червоний, фіолетовий, білий	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 мл	Чорний, жовтий, синій, червоний, фіолетовий, білий	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 мл	Чорний, жовтий, синій, червоний, фіолетовий, білий	500	10