KriyoviyallerGenellikle hücre hatlarının ve diğer kritik biyolojik materyallerin sıvı nitrojenle dolu dewarlarda kriyojenik depolanması için kullanılırlar.

Hücrelerin sıvı nitrojende başarılı bir şekilde saklanmasında birkaç aşama vardır. Temel prensip yavaş dondurma olsa da, kullanılan kesin teknik hücre türüne ve kullanılan kriyoprotektana bağlıdır. Hücreleri bu kadar düşük sıcaklıklarda saklarken dikkate alınması gereken birkaç güvenlik hususu ve en iyi uygulama vardır.

Bu yazının amacı kriyovyallerin sıvı nitrojen içerisinde nasıl saklandığına dair genel bir bakış sunmaktır.

Kriyovyaller Nelerdir?

Kriyovialler, sıvı örnekleri son derece düşük sıcaklıklarda saklamak için tasarlanmış küçük, kapaklı şişelerdir. Kriyoprotektanda saklanan hücrelerin sıvı nitrojenle doğrudan temas etmemesini sağlayarak, hücresel kırılma riskini en aza indirirken sıvı nitrojenin aşırı soğutma etkisinden yararlanmaya devam eder.

Şişeler genellikle çeşitli hacimlerde ve tasarımlarda mevcuttur - düz veya yuvarlak tabanlı, içten veya dıştan dişli olabilirler. Steril ve steril olmayan formatlar da mevcuttur.

Kimler KullanırCyrovial'larHücreleri Sıvı Azotta Depolamak

Göbek kordonu kanı bankacılığı, epitel hücre biyolojisi, immünoloji ve kök hücre biyolojisi alanlarında uzmanlaşmış çeşitli NHS ve özel laboratuvarlar ile araştırma kurumları, hücreleri kriyoprezervasyon yapmak için kriyovialleri kullanmaktadır.

Bu şekilde korunan hücreler arasında B ve T Hücreleri, CHO Hücreleri, Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücreler, Hibridomalar, Bağırsak Hücreleri, Makrofajlar, Mezenkimal Kök ve Progenitor Hücreler, Monositler, Miyelom, NK Hücreleri ve Pluripotent Kök Hücreler yer alır.

Kriyoviyallerin Sıvı Azotta Nasıl Saklanacağına Genel Bakış

Kriyoprezervasyon, hücreleri ve diğer biyolojik yapıları çok düşük sıcaklıklara soğutarak koruyan bir işlemdir. Hücreler, hücre canlılığını kaybetmeden yıllarca sıvı nitrojende saklanabilir. Bu, kullanılan prosedürlerin bir taslağıdır.

Hücre Hazırlığı

Örnekleri hazırlamanın kesin yöntemi hücre türüne bağlı olarak değişecektir, ancak genel olarak hücreler toplanır ve hücre açısından zengin bir pelet oluşturmak için santrifüj edilir. Bu pelet daha sonra kriyoprotektan veya kriyoprezervasyon ortamıyla karıştırılmış süpernatantta yeniden süspanse edilir.

Kriyoprezervasyon Ortamı

Bu ortam, hücreleri maruz kalacakları düşük sıcaklık ortamlarında, hücre içi ve hücre dışı kristallerin oluşumunu ve dolayısıyla hücre ölümünü engelleyerek korumak için kullanılır. Görevleri, dondurma, saklama ve çözme işlemleri sırasında hücreler ve dokular için güvenli ve koruyucu bir ortam sağlamaktır.

Taze dondurulmuş plazma (FFP), heparinize plazmalit solüsyonu veya serumsuz, hayvansal bileşen içermeyen solüsyonlar gibi bir ortam, dimetil sülfoksit (DMSO) veya gliserol gibi kriyoprotektanlarla karıştırılır.

Tekrar sıvılaştırılmış numune peleti, polipropilen kriyovyallere ayrılır, örneğin:Suzhou Ace Biomedical şirketi Kriyojenik Depolama Şişeleri.

Kriyovyalleri aşırı doldurmamak önemlidir, çünkü bu çatlama riskini ve içeriğin olası sızmasını artıracaktır (1).

Kontrollü Dondurma Oranı

Hücrelerin başarılı bir şekilde kriyoprezervasyonu için genellikle yavaş kontrollü bir dondurma oranı kullanılır.

Örnekler kriyojenik şişelere alikotlandıktan sonra ıslak buza veya 4℃'lik bir buzdolabına yerleştirilir ve dondurma prosedürü 5 dakika içinde başlatılır. Genel bir kılavuz olarak, hücreler dakikada -1 ila -3 oranında soğutulur (2). Bu, programlanabilir bir soğutucu kullanılarak veya şişelerin –70°C ila –90°C kontrollü hız dondurucusuna yerleştirilmiş yalıtımlı bir kutuya yerleştirilmesiyle elde edilir.

Sıvı Azota Transfer

Dondurulmuş kriyojenik şişeler daha sonra -135℃'nin altında bir sıcaklık sağlanması koşuluyla belirsiz süreler boyunca sıvı nitrojen tankına aktarılır.

Bu ultra düşük sıcaklıklar, sıvı veya buhar fazındaki azota daldırma yoluyla elde edilebilir.

Sıvı mı Buhar Fazı mı?

Sıvı faz azotunda depolamanın, soğuk sıcaklığı mutlak tutarlılıkla koruduğu bilinmektedir, ancak aşağıdaki nedenlerden dolayı genellikle önerilmez:

• Potansiyel bir tehlike olan büyük hacimli (derinlikli) sıvı nitrojene ihtiyaç vardır. Buna bağlı yanıklar veya boğulmalar gerçek bir risktir.
• Aspergillus, hep B gibi enfeksiyöz ajanlar tarafından çapraz bulaşma vakaları ve sıvı nitrojen ortamı yoluyla viral yayılmanın belgelenmiş vakaları (2,3)
• Sıvı nitrojenin daldırma sırasında şişelere sızma potansiyeli. Depolamadan çıkarılıp oda sıcaklığına ısıtıldığında, nitrojen hızla genişler. Sonuç olarak, şişe sıvı nitrojen depolamasından çıkarıldığında parçalanabilir ve hem uçan döküntülerden hem de içeriklere maruz kalmaktan kaynaklanan bir tehlike yaratabilir (1, 4).

Bu sebeplerden dolayı, ultra düşük sıcaklıkta depolama en yaygın olarak buhar fazı nitrojeninde yapılır. Numunelerin sıvı fazda depolanması gerektiğinde, özel kriyoflex boru kullanılmalıdır.

Buhar fazının dezavantajı, -135℃ ile -190℃ arasında sıcaklık dalgalanmalarına neden olan dikey bir sıcaklık gradyanının meydana gelebilmesidir. Bu, sıvı nitrojen seviyelerinin ve sıcaklık değişimlerinin dikkatli ve titiz bir şekilde izlenmesini gerektirir (5).

Birçok üretici kriyoviyallerin -135℃'ye kadar depolama için veya sadece buhar fazında kullanım için uygun olduğunu önermektedir.

Kriyoprezervasyonlu Hücrelerinizin Çözülmesi

Dondurulmuş bir kültür için çözme prosedürü streslidir ve hücrelerin optimum canlılığını, geri kazanımını ve işlevselliğini sağlamak için uygun elleçleme ve teknik gereklidir. Kesin çözme protokolleri belirli hücre tiplerine bağlı olacaktır. Ancak, hızlı çözme şunlar için standart olarak kabul edilir:

• Hücresel iyileşme üzerindeki herhangi bir etkiyi azaltın
• Dondurucu ortamda bulunan çözünen maddelere maruz kalma süresini azaltmaya yardımcı olun
• Buzun yeniden kristalleşmesiyle oluşabilecek hasarı en aza indirin

Numuneleri çözmek için genellikle su banyoları, boncuk banyoları veya özel otomatik cihazlar kullanılır.

Genellikle 1 hücre hattı, önceden ısıtılmış büyüme ortamında yıkanmadan önce, şişede çok az buz kalana kadar 37℃'lik su banyosunda hafifçe döndürülerek 1-2 dakika boyunca çözülür.

Memeli embriyoları gibi bazı hücreler için yavaş ısınma, hayatta kalmaları için olmazsa olmazdır.

Hücreler artık hücre kültürü, hücre izolasyonu veya hematopoetik kök hücreler söz konusu olduğunda miyeloablatif tedaviden önce donör kök hücrelerinin bütünlüğünü garanti altına almak için canlılık çalışmaları için hazırdır.

Kültürde plakalama için hücre konsantrasyonlarını belirlemek üzere hücre sayımı yapmak için kullanılan önceden yıkanmış numunenin küçük alikotlarını almak normal bir uygulamadır. Daha sonra hücre izolasyon prosedürlerinin sonuçlarını değerlendirebilir ve hücre canlılığını belirleyebilirsiniz.

Kriyoviyallerin Depolanması İçin En İyi Uygulamalar

Kriyovyallerde saklanan numunelerin başarılı bir şekilde kriyoprezervasyonu, uygun depolama ve kayıt tutma da dahil olmak üzere protokoldeki birçok öğeye bağlıdır.

• Hücreleri depolama konumları arasında bölün– Hacimler izin veriyorsa, hücreleri şişelere bölün ve ekipman arızaları nedeniyle numune kaybı riskini azaltmak için ayrı yerlerde saklayın.
• Çapraz bulaşmayı önleyin– Sonraki kullanımdan önce tek kullanımlık steril kriyojenik şişeleri veya otoklavı tercih edin
• Hücreleriniz için uygun büyüklükte şişeler kullanın– flakonlar 1 ila 5 ml arasında değişen hacimlerde gelir. Çatlama riskini azaltmak için flakonları aşırı doldurmaktan kaçının.
• Dahili veya harici dişli kriyojenik şişeleri seçin– İçten dişli şişeler bazı üniversiteler tarafından güvenlik önlemleri açısından önerilmektedir; ayrıca bunlar dolum sırasında veya sıvı nitrojende saklandığında kontaminasyonu da önleyebilir.
• Sızıntıyı Önleyin- Sızıntıyı ve kirlenmeyi önlemek için vidalı kapağa veya O-ringlere kalıplanmış çift enjeksiyonlu contalar kullanın.
• 2D barkodlar kullanın ve şişeleri etiketleyin– İzlenebilirliği sağlamak için, geniş yazma alanlarına sahip şişeler her şişenin uygun şekilde etiketlenmesini sağlar. 2D barkodlar depolama yönetimi ve kayıt tutma konusunda yardımcı olabilir. Renk kodlu kapaklar daha kolay tanımlama için faydalıdır.
• Yeterli depolama bakımı- Hücrelerin kaybolmamasını sağlamak için depolama kapları sıcaklığı ve sıvı nitrojen seviyelerini sürekli izlemelidir. Kullanıcıları hatalar konusunda uyarmak için alarmlar takılmalıdır.

Güvenlik Önlemleri

Sıvı azot, modern araştırmalarda yaygın bir uygulama haline gelmiştir ancak yanlış kullanıldığında ciddi yaralanmalara yol açma riski taşımaktadır.

Sıvı nitrojenle çalışırken donma, yanma ve diğer olumsuz olayların riskini en aza indirmek için uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyilmelidir.

• Kriyojenik eldivenler
• Laboratuvar önlüğü
• Boynu da kaplayan darbeye dayanıklı tam yüz siperi
• Kapalı burunlu ayakkabılar
• Sıçramaya dayanıklı plastik önlük

Sıvı nitrojen buzdolapları, boğulma riskini en aza indirmek için iyi havalandırılan alanlara yerleştirilmelidir - kaçan nitrojen buharlaşır ve atmosferik oksijenin yerini alır. Büyük hacimli mağazalarda düşük oksijen alarm sistemleri bulunmalıdır.

Sıvı azotla çalışırken çiftler halinde çalışmak idealdir ve normal çalışma saatleri dışında kullanımı yasaklanmalıdır.

İş Akışınızı Desteklemek İçin Kriyoviyaller

Suzhou Ace Biomedical şirketi, farklı hücre tipleri için kriyoprezervasyon ihtiyaçlarınızı karşılayan geniş bir ürün yelpazesi sunmaktadır. Portföy, bir dizi tüp ve bir dizi steril kriyovial içerir.

Kriyoviyallerimiz şunlardır:

• Laboratuvar Vidalı Kapaklı 0,5 mL 1,5 mL 2,0 mL Kriyovial Kriyojenik Şişeler Contalı Konik Tabanlı Kriyotüp

  ● 0.5ml, 1.5ml, 2.0ml spesifikasyonlu, etekli veya eteksiz
  ● Konik veya kendi kendine duran tasarım, steril veya steril olmayan her ikisi de mevcuttur
  ● Vidalı kapaklı tüpler tıbbi sınıf polipropilenden yapılmıştır
  ● PP Kriyotüp Şişeleri tekrar tekrar dondurulabilir ve çözülebilir
  ●Dış kapak tasarımı, numune işleme sırasında kontaminasyon olasılığını azaltabilir.
  ● Vidalı kapaklı kriyojenik tüpler için evrensel vida dişleri
  ● Borular en yaygın rotorlara uygundur
  ● Kriyojenik tüp o-ring boruları standart 1 inç ve 2 inç, 48 kuyulu, 81 kuyulu, 96 kuyulu ve 100 kuyulu dondurucu kutularına uygundur
  ● 121°C'ye kadar otoklavlanabilir ve -86°C'ye kadar dondurulabilir

  PARÇA NO	MALZEME	HACİM	KAPRENK	Adetler/ÇANTA	ÇANTALAR/KASA
  EYLEM 05-BL-N	PP	0,5 ml	Siyah, Sarı, Mavi, Kırmızı, Mor, Beyaz	500	10
  15. BÖLÜM-BL-N	PP	1,5ML	Siyah, Sarı, Mavi, Kırmızı, Mor, Beyaz	500	10
  15.EYLEM-BL-NW	PP	1,5ML	Siyah, Sarı, Mavi, Kırmızı, Mor, Beyaz	500	10
  EYLEM20-BL-N	PP	2,0 ml	Siyah, Sarı, Mavi, Kırmızı, Mor, Beyaz	500	10