หลอดแช่แข็งโดยทั่วไปจะใช้สำหรับจัดเก็บเซลล์สายพันธุ์และวัสดุทางชีวภาพที่สำคัญอื่นๆ ในอุณหภูมิต่ำมาก โดยบรรจุในถังเก็บไนโตรเจนเหลว

มีหลายขั้นตอนในการเก็บรักษาเซลล์ในไนโตรเจนเหลวให้ประสบความสำเร็จ แม้ว่าหลักการพื้นฐานจะเป็นการแช่แข็งช้าๆ แต่เทคนิคที่ใช้จะขึ้นอยู่กับประเภทของเซลล์และสารป้องกันการแข็งตัวที่ใช้ มีข้อควรพิจารณาด้านความปลอดภัยและแนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุดหลายประการที่ต้องคำนึงถึงเมื่อจัดเก็บเซลล์ที่อุณหภูมิต่ำเช่นนี้

โพสต์นี้มีวัตถุประสงค์เพื่อให้ภาพรวมเกี่ยวกับวิธีการจัดเก็บขวดไครโอไวอัลในไนโตรเจนเหลว

Cryovial คืออะไร

ขวดแช่แข็งเป็นขวดขนาดเล็กที่มีฝาปิดที่ออกแบบมาเพื่อเก็บตัวอย่างของเหลวในอุณหภูมิที่ต่ำมาก ขวดเหล่านี้ช่วยให้เซลล์ที่เก็บรักษาในสารป้องกันการแข็งตัวจะไม่สัมผัสกับไนโตรเจนเหลวโดยตรง ซึ่งช่วยลดความเสี่ยงที่เซลล์จะแตก แต่ยังคงได้รับประโยชน์จากผลการทำความเย็นที่รุนแรงของไนโตรเจนเหลว

โดยทั่วไปขวดบรรจุยาจะมีปริมาตรและรูปแบบต่างๆ ให้เลือก โดยอาจมีเกลียวในหรือเกลียวนอก พร้อมก้นขวดแบบแบนหรือแบบโค้งมน นอกจากนี้ ยังมีแบบปลอดเชื้อและไม่ปลอดเชื้อให้เลือกอีกด้วย

ใครใช้ไซโรเวียลเพื่อเก็บเซลล์ในไนโตรเจนเหลว

ห้องปฏิบัติการของ NHS และเอกชนหลายแห่ง รวมถึงสถาบันวิจัยที่เชี่ยวชาญด้านการจัดเก็บเลือดจากสายสะดือ ชีววิทยาของเซลล์เยื่อบุผิว ภูมิคุ้มกันวิทยา และชีววิทยาของเซลล์ต้นกำเนิด ใช้ขวดแช่แข็งเพื่อเก็บรักษาเซลล์ด้วยการแช่แข็ง

เซลล์ที่เก็บรักษาไว้ด้วยวิธีนี้ ได้แก่ เซลล์ B และ T เซลล์ CHO เซลล์ต้นกำเนิดและเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด เซลล์ไฮบริดามา เซลล์ลำไส้ เซลล์แมคโครฟาจ เซลล์ต้นกำเนิดและเซลล์ต้นกำเนิดของมีเซนไคมอล เซลล์โมโนไซต์ เซลล์ไมอีโลม่า เซลล์ NK และเซลล์ต้นกำเนิดที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่าง

ภาพรวมวิธีการจัดเก็บ Cryovial ในไนโตรเจนเหลว

การแช่แข็งเป็นกระบวนการที่รักษาเซลล์และโครงสร้างทางชีวภาพอื่นๆ ด้วยการทำให้เย็นลงจนถึงอุณหภูมิที่ต่ำมาก เซลล์สามารถเก็บไว้ในไนโตรเจนเหลวได้เป็นเวลาหลายปีโดยไม่สูญเสียความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์ นี่คือโครงร่างของขั้นตอนที่ใช้

การเตรียมเซลล์

วิธีการที่แน่นอนในการเตรียมตัวอย่างจะแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์ แต่โดยทั่วไปแล้ว เซลล์จะถูกเก็บรวบรวมและปั่นเหวี่ยงเพื่อสร้างเม็ดที่มีเซลล์จำนวนมาก จากนั้นจึงนำเม็ดนี้ไปแขวนลอยใหม่ในของเหลวส่วนบนที่ผสมกับสารป้องกันการแข็งตัวหรือสารถนอมรักษาด้วยการแช่แข็ง

สารแช่แข็งเพื่อถนอมอาหาร

สื่อชนิดนี้ใช้ในการรักษาเซลล์ในสภาพแวดล้อมที่มีอุณหภูมิต่ำ โดยยับยั้งการก่อตัวของผลึกภายในและภายนอกเซลล์ ซึ่งจะทำให้เซลล์ตายได้ สื่อชนิดนี้มีหน้าที่สร้างสภาพแวดล้อมที่ปลอดภัยและปกป้องเซลล์และเนื้อเยื่อระหว่างกระบวนการแช่แข็ง จัดเก็บ และละลาย

ส่วนผสม เช่น พลาสมาแช่แข็งสด (FFP) สารละลายพลาสมาไลต์ที่ผ่านเฮปาริน หรือสารละลายที่ไม่มีซีรั่มและส่วนประกอบของสัตว์ จะถูกผสมกับสารป้องกันการแข็งตัว เช่น ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO) หรือกลีเซอรอล

เม็ดตัวอย่างที่ผ่านการทำให้เป็นของเหลวใหม่จะถูกแบ่งส่วนลงในหลอดแช่แข็งที่ทำจากโพลีโพรพีลีน เช่นขวดเก็บความเย็นของบริษัท Suzhou Ace Biomedical.

สิ่งสำคัญคือต้องไม่เติมของเหลวในหลอดไครโอไวอัลจนเต็มเกินไป เพราะจะเพิ่มความเสี่ยงต่อการแตกร้าวและอาจทำให้ของเหลวที่บรรจุอยู่ภายในรั่วไหลออกมาได้ (1)

อัตราการแช่แข็งที่ควบคุมได้

โดยทั่วไปแล้ว อัตราการแช่แข็งแบบควบคุมช้าจะถูกนำมาใช้ในการเก็บรักษาเซลล์ด้วยการแช่แข็งที่ประสบความสำเร็จ

หลังจากแบ่งตัวอย่างใส่ในขวดแช่แข็งแล้ว ให้วางตัวอย่างบนน้ำแข็งหรือในตู้เย็น 4℃ และเริ่มขั้นตอนการแช่แข็งภายใน 5 นาที โดยทั่วไป เซลล์จะถูกทำให้เย็นลงด้วยอัตรา -1 ถึง -3 ต่อหนึ่งนาที (2) ซึ่งทำได้โดยใช้เครื่องทำความเย็นแบบตั้งโปรแกรมได้หรือโดยการวางขวดไว้ในกล่องฉนวนที่วางอยู่ในตู้แช่แข็งที่มีการควบคุมอัตรา -70°C ถึง -90°C

ถ่ายโอนไปยังไนโตรเจนเหลว

จากนั้นขวดไครโอเจนิกที่แช่แข็งจะถูกถ่ายโอนไปยังถังไนโตรเจนเหลวเป็นระยะเวลาไม่จำกัด โดยต้องรักษาอุณหภูมิให้ต่ำกว่า -135℃

อุณหภูมิต่ำพิเศษเหล่านี้สามารถทำได้โดยการแช่ในไนโตรเจนในสถานะของเหลวหรือไอ

เฟสของเหลวหรือไอ?

การจัดเก็บในไนโตรเจนเหลวเป็นที่ทราบกันดีว่าสามารถรักษาอุณหภูมิความเย็นได้อย่างคงที่และสม่ำเสมอ แต่บ่อยครั้งที่ไม่แนะนำให้ทำเช่นนั้นด้วยเหตุผลดังต่อไปนี้:

• ความต้องการไนโตรเจนเหลวในปริมาณมาก (ความลึก) ซึ่งอาจก่อให้เกิดอันตรายได้ อาจทำให้เกิดการไหม้หรือขาดอากาศหายใจได้
• รายงานกรณีการปนเปื้อนข้ามสายพันธุ์จากเชื้อก่อโรค เช่น เชื้อราแอสเปอร์จิลลัส ไวรัสตับอักเสบบี และการแพร่กระจายของไวรัสผ่านตัวกลางไนโตรเจนเหลว (2,3)
• ไนโตรเจนเหลวอาจรั่วไหลเข้าไปในขวดได้ระหว่างการแช่ เมื่อนำออกจากที่เก็บและอุ่นจนถึงอุณหภูมิห้อง ไนโตรเจนจะขยายตัวอย่างรวดเร็ว ดังนั้น ขวดอาจแตกได้เมื่อนำออกจากที่เก็บไนโตรเจนเหลว ซึ่งอาจก่อให้เกิดอันตรายจากเศษวัสดุที่ปลิวว่อนและการสัมผัสกับสิ่งที่บรรจุอยู่ภายใน (1, 4)

ด้วยเหตุผลเหล่านี้ การจัดเก็บที่อุณหภูมิต่ำเป็นพิเศษจึงมักอยู่ในไนโตรเจนในเฟสไอ เมื่อต้องจัดเก็บตัวอย่างในเฟสของเหลว ควรใช้ท่อ cryoflex เฉพาะทาง

ข้อเสียของเฟสไอคืออาจเกิดการไล่ระดับอุณหภูมิในแนวตั้ง ส่งผลให้มีความผันผวนของอุณหภูมิระหว่าง -135℃ และ -190℃ ซึ่งจำเป็นต้องตรวจสอบระดับไนโตรเจนเหลวและการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิอย่างระมัดระวังและสม่ำเสมอ (5)

ผู้ผลิตหลายรายแนะนำว่าขวดไครโอไวอัลเหมาะสำหรับการจัดเก็บที่อุณหภูมิต่ำถึง -135℃ หรือสำหรับใช้ในเฟสไอเท่านั้น

การละลายเซลล์แช่แข็งของคุณ

ขั้นตอนการละลายน้ำแข็งนั้นสร้างความเครียดให้กับวัฒนธรรมที่แช่แข็ง และจำเป็นต้องมีการจัดการและเทคนิคที่เหมาะสมเพื่อให้แน่ใจว่าเซลล์จะมีความสามารถในการดำรงชีวิต การฟื้นตัว และการทำงานที่ดีที่สุด โปรโตคอลการละลายน้ำแข็งที่แน่นอนจะขึ้นอยู่กับประเภทของเซลล์เฉพาะ อย่างไรก็ตาม การละลายน้ำแข็งอย่างรวดเร็วถือเป็นมาตรฐานสำหรับ:

• ลดผลกระทบต่อการฟื้นฟูเซลล์
• ช่วยลดเวลาในการสัมผัสกับสารละลายที่มีอยู่ในสื่อแช่แข็ง
• ลดความเสียหายให้เหลือน้อยที่สุดด้วยการตกผลึกน้ำแข็งอีกครั้ง

อ่างน้ำ อ่างลูกปัด หรือเครื่องมืออัตโนมัติเฉพาะทางมักใช้ในการละลายตัวอย่าง

ส่วนใหญ่แล้ว เซลล์ 1 เซลล์จะถูกละลายครั้งละ 1-2 นาที โดยการหมุนเบาๆ ในอ่างน้ำ 37℃ จนกระทั่งเหลือน้ำแข็งเพียงเล็กน้อยในขวด ก่อนจะล้างในอาหารเลี้ยงเชื้อที่อุ่นไว้ล่วงหน้า

สำหรับเซลล์บางประเภท เช่น เอ็มบริโอของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ภาวะโลกร้อนช้าๆ ถือเป็นสิ่งจำเป็นต่อการอยู่รอดของเซลล์เหล่านั้น

ขณะนี้ เซลล์พร้อมสำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ การแยกเซลล์ หรือในกรณีของเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด – การศึกษาความสามารถในการมีชีวิตเพื่อรับรองความสมบูรณ์ของเซลล์ต้นกำเนิดของผู้บริจาคก่อนการบำบัดด้วยการทำลายไขกระดูก

เป็นเรื่องปกติที่จะต้องใช้ตัวอย่างที่ล้างแล้วจำนวนเล็กน้อยในการนับเซลล์เพื่อกำหนดความเข้มข้นของเซลล์สำหรับการเพาะเลี้ยงในวัฒนธรรม จากนั้นคุณจึงสามารถประเมินผลของขั้นตอนการแยกเซลล์และกำหนดความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์ได้

แนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุดสำหรับการจัดเก็บขวดไครโอเวียล

การแช่แข็งตัวอย่างที่เก็บไว้ในขวดแช่แข็งให้ประสบความสำเร็จนั้นต้องอาศัยองค์ประกอบหลายประการในโปรโตคอล รวมถึงการจัดเก็บและบันทึกข้อมูลที่ถูกต้อง

• แยกเซลล์ระหว่างตำแหน่งจัดเก็บ– หากปริมาตรเอื้ออำนวย ให้แบ่งเซลล์ออกเป็นขวดและเก็บไว้ในสถานที่แยกกัน เพื่อลดความเสี่ยงของการสูญเสียตัวอย่างอันเนื่องมาจากอุปกรณ์ล้มเหลว
• ป้องกันการปนเปื้อนข้าม– เลือกใช้ขวดแช่เย็นที่ผ่านการฆ่าเชื้อแบบใช้ครั้งเดียวหรือหม้ออัดไอน้ำก่อนใช้งานครั้งต่อไป
• ใช้ขวดที่มีขนาดเหมาะสมกับเซลล์ของคุณ– ขวดบรรจุยาจะมีปริมาตรตั้งแต่ 1 ถึง 5 มิลลิลิตร หลีกเลี่ยงการเติมยาจนเต็มขวดมากเกินไปเพื่อลดความเสี่ยงในการแตกร้าว
• เลือกขวดไครโอเจนิกแบบเกลียวภายในหรือเกลียวภายนอก– มหาวิทยาลัยบางแห่งแนะนำให้ใช้ขวดที่มีเกลียวภายในเพื่อความปลอดภัย – นอกจากนี้ยังช่วยป้องกันการปนเปื้อนระหว่างการบรรจุหรือเมื่อเก็บไว้ในไนโตรเจนเหลวได้อีกด้วย
• ป้องกันการรั่วไหล- ใช้ซีลฉีดสองชั้นที่ขึ้นรูปเป็นฝาเกลียวหรือโอริงเพื่อป้องกันการรั่วไหลและการปนเปื้อน
• ใช้บาร์โค้ด 2 มิติและฉลากขวด– เพื่อให้แน่ใจว่าสามารถติดตามได้ ขวดที่มีพื้นที่เขียนขนาดใหญ่จะช่วยให้สามารถติดฉลากบนขวดแต่ละขวดได้อย่างเหมาะสม บาร์โค้ด 2 มิติสามารถช่วยในการจัดการการจัดเก็บและการบันทึกข้อมูลได้ ฝาขวดที่มีรหัสสีมีประโยชน์สำหรับการระบุที่ง่ายขึ้น
• การบำรุงรักษาพื้นที่จัดเก็บอย่างเหมาะสม- เพื่อให้แน่ใจว่าเซลล์จะไม่สูญหาย ภาชนะจัดเก็บควรตรวจสอบอุณหภูมิและระดับไนโตรเจนเหลวอย่างต่อเนื่อง ควรติดตั้งสัญญาณเตือนเพื่อแจ้งให้ผู้ใช้ทราบถึงข้อผิดพลาด

ข้อควรระวังเพื่อความปลอดภัย

ไนโตรเจนเหลวกลายเป็นวิธีการทั่วไปในการวิจัยสมัยใหม่ แต่มีความเสี่ยงที่จะบาดเจ็บสาหัสได้หากใช้ไม่ถูกต้อง

ควรสวมอุปกรณ์ป้องกันส่วนบุคคล (PPE) ที่เหมาะสมเพื่อลดความเสี่ยงของอาการบาดแผลจากความหนาวเย็น ไฟไหม้ และเหตุการณ์ไม่พึงประสงค์อื่นๆ เมื่อต้องจัดการกับไนโตรเจนเหลว

• ถุงมือไครโอเจนิก
• เสื้อคลุมห้องแล็ป
• ชิลด์หน้าแบบเต็มตัวที่ทนทานต่อแรงกระแทกและยังครอบคลุมถึงคอด้วย
• รองเท้าหัวปิด
• ผ้ากันเปื้อนพลาสติกกันน้ำกระเซ็น

ควรวางตู้เย็นไนโตรเจนเหลวในบริเวณที่มีการระบายอากาศที่ดีเพื่อลดความเสี่ยงในการขาดอากาศหายใจ เนื่องจากไนโตรเจนที่ระเหยออกมาจะระเหยและแทนที่ออกซิเจนในบรรยากาศ ร้านค้าที่มีปริมาณมากควรมีระบบเตือนเมื่อออกซิเจนต่ำ

การทำงานเป็นคู่เมื่อต้องจัดการกับไนโตรเจนเหลวนั้นถือเป็นเรื่องที่เหมาะสม และควรห้ามใช้นอกเวลาทำงานปกติ

Cryovials เพื่อรองรับการทำงานของคุณ

บริษัท Suzhou Ace Biomedical นำเสนอผลิตภัณฑ์หลากหลายชนิดที่ตอบสนองความต้องการการแช่แข็งเซลล์ประเภทต่างๆ ผลิตภัณฑ์ประกอบด้วยหลอดทดลองและหลอดแช่แข็งปลอดเชื้อหลายประเภท

ขวดไครโอเวียลของเราคือ:

• ฝาเกลียวสำหรับห้องทดลอง 0.5 มล. 1.5 มล. 2.0 มล. ขวด Cryovial Cryogenic แบบก้นกรวยพร้อมปะเก็น

  ● สเปค 0.5มล.,1.5มล.,2.0มล. มีกระโปรงหรือไม่มีกระโปรงก็ได้
  ● มีให้เลือกทั้งแบบทรงกรวยและแบบตั้งอิสระ ทั้งแบบปลอดเชื้อและไม่ปลอดเชื้อ
  ● หลอดฝาเกลียวทำจากโพลีโพรพีลีนเกรดทางการแพทย์
  ● ขวด PP Cryotube สามารถแช่แข็งและละลายซ้ำได้
  ● การออกแบบฝาภายนอกช่วยลดโอกาสการปนเปื้อนในระหว่างการบำบัดตัวอย่าง
  ● ฝาเกลียว ท่อไครโอเจนิก เกลียวสากล สำหรับการใช้งาน
  ● ท่อเหมาะกับโรเตอร์ทั่วไปส่วนใหญ่
  ● ท่อโอริงสำหรับท่อไครโอเจนิกเหมาะกับกล่องแช่แข็งขนาดมาตรฐาน 1 นิ้ว และ 2 นิ้ว 48 หลุม 81 หลุม 96 หลุม และ 100 หลุม
  ● สามารถนึ่งฆ่าเชื้อได้ที่อุณหภูมิ 121°C และแช่แข็งได้ที่อุณหภูมิ -86°C

  หมายเลขชิ้นส่วน	วัสดุ	ปริมาณ	หมวกสี	พีซีเอส/ถุง	กระเป๋า/เคส
  ACT05-BL-เอ็น	PP	0.5มล.	สีดำ,สีเหลือง,สีน้ำเงิน,สีแดง,สีม่วง,สีขาว	500	10
  ACT15-BL-เอ็น	PP	1.5มล.	สีดำ,สีเหลือง,สีน้ำเงิน,สีแดง,สีม่วง,สีขาว	500	10
  ACT15-BL-ตะวันตกเฉียงเหนือ	PP	1.5มล.	สีดำ,สีเหลือง,สีน้ำเงิน,สีแดง,สีม่วง,สีขาว	500	10
  ACT20-BL-เอ็น	PP	2.0มล.	สีดำ,สีเหลือง,สีน้ำเงิน,สีแดง,สีม่วง,สีขาว	500	10