Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali izklopite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem zagotovite nadaljnjo podporo, bomo stran prikazali brez slogov in JavaScripta.
Pomen spremljanja okoljskih vzorcev je bil zelo cenjen od začetka pandemije COVID-19 in nekatera prizadevanja za spremljanje se izvajajo z uporabo zlatega standarda, čeprav so tehnike, ki temeljijo na qPCR, drage. Elektrokemični biosenzorji DNK bi lahko zagotovili potencialno stroškovno učinkovito rešitev za spremljanje vzorcev vode iz okolja v državah z nizkim in srednjim dohodkom. V tem delu prikazujemo elektrokemično detekcijo amplikonov, pridobljenih iz faga Phi6, izoliranega iz vzorcev jezerske vode z dodatki (priljubljen nadomestek za SARS-CoV-2), z uporabo ENIG za dokončanje PCB elektrod brez spreminjanja površine.spol. Odziv elektrokemičnega senzorja je bil temeljito karakteriziran za dva fragmenta DNA različnih dolžin (\({117}\,\hbox {bp}\) in \({503}\,\hbox {bp}\)) in učinek soli v glavnih mešanicah PCR na interakcije metilen modro (MB)-DNA. Naši rezultati kažejo, da dolžina fragmentov DNA pomembno določa elektrokemijsko občutljivost in v tem delu dokazujejo, da je sposobnost zaznavanja dolgih pomnožev brez čiščenja produktov PCR z gelom pomembna za meritve vzorcev vode in situ.Popolnoma avtomatizirana rešitev za virusno obremenitev je dobra napoved.
Prenos virusa po vodi je že od 40. let 20. stoletja znan kot nevarnost za javno zdravje, s prvimi dokazi o prenosu otroške paralize in hepatitisa E1 po vodi. Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) je razvrstila več virusnih patogenov, ki se prenašajo po vodi, z zmernim do velikim zdravstvenim pomenom2. Tradicionalni virus metode odkrivanja temeljijo na tehnikah, ki temeljijo na zlatem standardu qPCR, ki so zelo občutljive in specifične, vendar zahtevajo usposobljeno osebje za testiranje v laboratoriju z dragimi instrumenti. Vendar pa v državah z nizkim in srednjim dohodkom (LMIC) z omejenimi viri človeški testiranje vzorcev bo verjetno imelo prednost pred spremljanjem vzorcev vode iz okolja. Zato so potrebne alternativne poceni metode za trajnostno spremljanje vzorcev vode in odpadne vode v realnem času v državah z nizkim in srednjim dohodkom kot zgodnje opozorilo o nastajajočih izbruhih bolezni, in jih tako zaščiti pred hudimi socialno-ekonomskimi vplivi pandemije virusa. Poceni elektrokemični biosenzorji za nukleinske kisline bi lahko zagotovili obetavno možno rešitev za to neizpolnjeno potrebo. Mnogi od teh biosenzorjev DNK delujejo tako, da so komplementarne verige DNK imobilizirane na elektrodi površino in hibridizirajo, ko je v vzorcu prisotno ujemajoče se zaporedje. To je nato mogoče pretvoriti v signal z različnimi elektrokemičnimi tehnikami z uporabo redoks mediatorjev, kot je kalijev železov/ferocianid. Metilen modra (MB) je ena takih redoks-aktivnih molekul, ki ima Poročali so, da se poleg bolj nespecifične vezave na enoverižno DNA vmešajo v dvoverižno DNA (dsDNA). Zaradi interkalacijske narave MB, da tvorijo komplekse MB-DNA, so priljubljena izbira kot redoks mediatorji v več elektrokemičnih DNA konfiguracije senzorjev 5,6,7,8,9. Čeprav je interkalacija MB v DNK nespecifična in je specifičnost tega elektrokemičnega senzorja v veliki meri odvisna od čistosti primerjev, uporabljenih za PCR ali izotermno pomnoževanje, je zelo primeren za izvajanje resničnih elektrokemični qPCR ali fluorescenčno izotermno pomnoževanje kot alternativa merjenju koncentracije DNK 9. V eni taki izvedbi so Won et al. Površino zlatih elektrod so v realnem času spremenili s 6-merkapto-1-heksanolom (MCH). merjenje pomnožev PCR z MB z uporabo diferencialne pulzne voltametrije (DPV)9. V drugih primerih so Ramirez et al. Odkrivanje SARS-CoV-2 v odpadni vodi z reakcijo RT-LAMP z uporabo MB s sitotiskanimi elektrodami. Platinaste elektrode so bile tudi uporabljajo kot in situ elektrode v mikrofluidni PCR platformi, zasnovani za elektrokemično odkrivanje amplikonov med reakcijami 8. Vse te študije zahtevajo modifikacijo površine elektrod, kar pomeni povečane stroške proizvodnje in obratovanja zaradi posebnih zahtev glede shranjevanja za stabilnost teh funkcionaliziranih elektrod.
Shema poteka dela za elektrokemijsko detekcijo amplikonov, pridobljenih iz koncentriranih virusnih delcev v vzorcih jezerske vode.
Pred kratkim smo pokazali elektrokemično zaznavanje pomnožev SARS-CoV-2 z elektrodami za poceni tiskana vezja (PCB), ki temeljijo na DPV in ciklični voltametriji (CV), inducirani z adsorpcijo kompleksov MB-DNA na površini nespremenjenih elektrod) spremembe vrha trenutno11.Poročamo, da so daljši fragmenti DNK (N1-N2, \({943}\, \hbox), oblikovani z uporabo primerjev N1 forward in N2 reverse, ki jih priporoča CDC, v primerjavi s krajšimi fragmenti {bp}\)) pokazali boljšo linearnost v odzivu senzorja (N1, \(72\,\hbox {bp}\)), oblikovan z uporabo N1 prednjih in N1 povratnih primerjev. Te študije so opisane z uporabo razredčin DNK, pripravljenih v vodi brez nukleaze. Platforma je bila uporabljena tudi za odkrivanje SARS-CoV -2 pomnožkov v simuliranih vzorcih odpadne vode (pridobljenih z dodajanjem skupnih vzorcev RNA z RNA SARS-CoV-2). Ker je RNA dovzetna za striženje med izolacijo in nadaljnjo obdelavo,12,13 je težko pomnožiti daljše fragmente s tem heterogenim vzorcem. Zato je prikaz elektrokemičnega zaznavanja pomnožka SARS-CoV-2 v odpadni vodi omejen na krajši fragment \(72\,\hbox {bp}\) N1.
V tem delu smo raziskali izvedljivost elektrokemičnega zaznavanja faga Phi6 na osnovi ENIG PCB, koncentriranega in izoliranega iz vzorcev jezerske vode (slika 1). Fagi Phi6 so po velikosti (80–100 nm) primerljivi s SARS-CoV-2 in imajo tudi lipidno membrano in koničast protein. Zaradi teh razlogov je bakteriofag Phi6 priljubljen nadomestek za SARS-CoV-2 in druge patogene viruse RNA z ovojnico 14, 15. RNA, izolirana iz fagnih delcev, je bila uporabljena kot matrica za sintezo cDNA, ki ji je sledila PCR za pridobitev dveh fragmentov DNK dolžine 117 in 503 baznih parov. Glede na izziv pomnoževanja \(943\,\hbox {bp}\) fragmentov N1-N2 v našem prejšnjem delu ciljamo na fragmente vmesne dolžine (\(117 \,\hbox {bp}\) in \(503 \,\hbox {bp}\)), ki temelji na razpoložljivih primerjih. Odziv elektrokemičnega senzorja je bil sistematično proučen v širokem območju koncentracij (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) v \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Za oba fragmenta v prisotnosti MB je bil učinek soli na odziv senzorja opredeljen in navzkrižno potrjen s spektrofotometričnimi meritvami. Glavni prispevki tega dela so naslednji:
Dolžina fragmenta DNK in prisotnost soli v vzorcu močno vplivata na občutljivost.Naši rezultati kažejo, da je elektrokemična aktivnost odvisna od različnih mehanizmov interakcije MB, DNA in senzorja v voltametričnem odzivu, odvisno od koncentracije in dolžine DNA, pri čemer daljši fragmenti kažejo večjo občutljivost, čeprav sol negativno vpliva na elektrostatične interakcije med MB in DNK.
Koncentracija DNA določa mehanizem interakcije MB-DNA v nespremenjenih elektrodah. Dokazujemo, da so različni mehanizmi interakcije MB-DNA odvisni od koncentracije DNA. Pri koncentracijah DNA pod majhno količino \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), smo opazili, da je bil odziv elektrokemičnega toka v glavnem določen z adsorpcijo MB-DNA na elektrodi, medtem ko je bil pri nižjih koncentracijah Pri visokih koncentracijah DNA odziv elektrokemičnega toka določen s sterično inhibicijo redoks aktivnost zaradi vstavitve MB med bazne pare DNA.
Elektrokemično zaznavanje virusnih nukleinskih kislin v vzorcih jezerske vode na osnovi ENIG PCB. Opazovanja so bila potrjena z elektrokemijsko detekcijo \(503\,\hbox {bp}\) fragmentov DNA, dodanih Phi6, pridobljenih iz vzorcev vode iz jezera Powai, kampus IIT Mumbai Rezultat fag.
Nizki stroški implementacije in možnost integracije v popolnoma avtomatizirane nadzorne sisteme, oligonukleotide ali aptamerje na elektrodah z daljšim rokom trajanja.
Fag Phi6 je virus dsRNA z ovojnico iz družine Cytoviridae, ki okuži Pseudomonas syringae. Genom faga Phi6 obstaja v obliki 3 fragmentov: S (\(2,95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4,07 \,\hbox {Kb}\)) in L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17. Ker fag Phi6 okuži nepatogeni sev BSL-1 Pseudomonas, je varen za uporabo in ga je mogoče enostavno gojiti v laboratoriju. Phage Phi6 in njegov gostitelj Pseudomonas syringae sta bila kupljena pri Referenčnem centru za bakterijske viruse Felix d'Herelle Univerze Laval v Kanadi (kataloške številke referenčnega centra so HER-102 oziroma HER-1102) Fag .Phi6 in njegov gostitelj sta bila oživljena po navodilih referenčnega centra. Fag Phi6 je bil očiščen z lizo plošče in eluiranjem, da smo dobili končne titre z \(\približno 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (enote, ki tvorijo plak/ mililiter).RNA je bila izolirana iz prečiščenih fagnih delcev z uporabo GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) v skladu z navodili proizvajalca. Na kratko, prečiščena suspenzija faga Phi6\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) je bila lizirana in lizat je bil naložen na centrifugalno kolono, da se je RNK lahko vezala na smolno kolono. RNK se nato eluira v elucijski raztopini \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), ki ga dobite v kompletu. Ocenite koncentracijo RNA z absorbanco pri \(260\,\hbox {nm}\). RNA je bila shranjena v alikvotih v \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) do nadaljnje uporabe.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Komplet za sintezo cDNA iScript (Bio -Rad Laboratories) je bila uporabljena kot predloga za sintezo cDNA po navodilih proizvajalca. Na kratko, reakcija sinteze cDNA je sestavljena iz 3 korakov: priprava pri \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , obratna transkripcija \({20}\,{\hbox {min}}\) pri \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) in obratno Snemalnik je v \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) za \({1}\,{\hbox {min }}\). Pri izvajanju na 1% agaroznem gelu je cDNA pokazala tri pasove, ki ustrezajo pričakovanim trem fragmentom RNA (podatki niso prikazani). Naslednji primerji so bili uporabljeni za pomnoževanje dveh fragmentov DNA dolžine 117 in 503 bp, z uporabo cDNA kot predloge za PCR v termociklerju miniPCR® mini8:
Primerja za \(117\,\hbox {bp}\) in \(503\,\hbox {bp}\) ustrezata 1476-1575 nukleotidom segmenta M in 458-943 nukleotidom segmenta L oziroma kisline Vse pomnožene produkte PCR smo podvrgli elektroforezi na 1 % agaroznih gelih in pomnoženo ciljno DNA očistili z uporabo GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Jezero v kampusu IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) je bilo uporabljeno za dodajanje fagnih delcev. Jezersko vodo so filtrirali skozi \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) membrano, da so odstranili suspendiranih delcev, nato pa je bil dodan fag Phi6. Dodajte \({1}\,{\hbox {ml}}\) od \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) v \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) filtrirano jezersko vodo, v \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Majhen alikvot je bil rezerviran za merjenje virusne obremenitve s testom plaka. Preizkusili smo dve različni metodi za koncentriranje virusnih delcev Phi6 z bodici: (1) metodo adsorpcije-obarjanja z aluminijevim hidroksidom,19 ki je bila potrjena za koncentracijo več virusov RNK z ovojnico iz okoljskih vzorcev in (2) ) Metoda koncentracije virusa na osnovi polietilen glikola (PEG) je bila prilagojena iz Flood et al.20. Ker je bilo ugotovljeno, da je učinkovitost rekuperacije metode na osnovi PEG boljša kot pri metodi z aluminijevim hidroksidom, je bila metoda na osnovi PEG uporabljena za koncentriranje delcev Phi6 iz vzorcev jezerske vode.
Uporabljena metoda PEG je bila naslednja: PEG 8000 in \(\hbox {NaCl}\) sta bila dodana vzorcem jezerske vode z dodatkom Phi6, da dobimo 8 % PEG 8000 in \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). Vzorci so bili inkubirani na stresalniku\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), nato centrifugirano pri \(4700 \,\hbox {g}\) je \({45}\,{\hbox {min}}\). Zavrzite supernatant in ponovno suspendirajte pelet v \({1}\, {\hbox {ml}}\) v istem supernatantu. Vsi poskusi z dodajanjem in koncentracijo virusa so bili izvedeni v trojniku. Po koncentraciji je bil majhen alikvot rezerviran za merjenje učinkovitosti obnovitve s testom plakov. RNK smo izolirali, kot je opisano prej, in eluirali v elucijskem pufru, dobavljenem s kompletom\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Ker se koncentracija RNA razlikuje od vzorca do vzorca v trojniku, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) RNA se uporablja za vse tri ne glede na njegovo koncentracijo. Sinteza cDNA vzorcev. Sinteza cDNA je bila izvedena, kot je opisano prej.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA je bil uporabljen kot predloga za \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR za 35 ciklov za pomnoževanje \ (117\,\hbox {bp}\) in \(503\,\hbox { bp}\) fragmenti. Ti vzorci so predstavljeni kot "1:1", tj. brez redčenja. Kontrola brez predloge (NTC) je bila nastavljena kot negativna kontrola, medtem ko je bila nastavljena cDNA, sintetizirana z uporabo RNA, izolirane iz prečiščenega faga kot predlogo za pozitivno kontrolo (PC). Kvantitativni PCR (qPCR) je bil izveden v instrumentu Stratagene Mx3000P RT-PCR z uporabo Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reakcije so bile nastavljene v treh izvodih kot prej Prag cikla (Ct) je bil zabeležen za vse vzorce. Poleg tega so bili razredčeni vzorci \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) z uporabo cDNA, razredčene 1:100 v filtrirani jezerski vodi kot \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR za 35 ciklov. Ti vzorci so predstavljeni kot »1:100«.
Elektrode PCB so izdelane s komercialno dostopnim nizkocenovnim postopkom Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) brez potrebe po dodatnem pozlačevanju. Specifikacije elektrod ENIG PCB so podrobno opisane v našem prejšnjem delu11. Za elektrode ENIG PCB so tradicionalne metode čiščenja elektrod, kot je npr. piranske raztopine ali ciklične voltametrije z žveplovo kislino ni priporočljivo, saj lahko povzročita luščenje tanke zlate plasti (debelina \(\približno\) \(100\,\hbox {nm }\)) in izpostavita spodnje bakrene plasti, ki so nagnjene do korozije 21, 22, 23, 24, 25. Zato očistite elektrode s krpo, ki ne pušča vlaken, navlaženo z IPA. Vzorec za testiranje je bil inkubiran z \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB v \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) za enostavno vstavljanje. V našem prejšnjem delu smo opazili, da sta se občutljivost in linearnost senzorja izboljšali s povečanjem koncentracije MB 11. Na podlagi optimizacij, o katerih smo poročali v prejšnjem delu, smo uporabili \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB koncentracije za vključitev DNK v to študijo. Elektrokemično detekcijo dvoverižne DNK (ds-DNK) je mogoče doseči z anionskimi ali kationskimi interkalatorji. Čeprav anionski interkalatorji zaznavajo DNK z boljšo selektivnostjo, potrebujejo inkubacijo čez noč, kar ima za posledico daljše čase detekcije. po drugi strani pa kationski interkalatorji, kot je MB, zahtevajo krajše inkubacijske čase, približno \({1}\,{\hbox {h}}\) za elektrokemično detekcijo ds-DNA6. Vsaka meritev vključuje oddajanje vzorca za testiranje na elektrodo\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), nato čiščenje s krpo, navlaženo z IPA, preden nadaljujete z drugim vzorcem.ena meritev. Vsak vzorec je bil preizkušen na 5 različnih elektrodah, razen če ni navedeno drugače. Meritve DPV in CV so bile izvedene s potenciostatom PalmSens Sensit Smart, programska oprema PSTrace pa je bila uporabljena za konfiguracijo potenciostata in zajem podatkov, vključno z izračuni temenskega toka. Uporabljene so naslednje nastavitve za meritve DPV in CV:
DPV: Ravnotežni čas = \(8\,\hbox {s}\), korak napetosti = \(3\,\hbox {mV}\), pulzna napetost = \(25\,\hbox {mV}\), trajanje impulza = \(50\,\hbox {ms}\), hitrost skeniranja = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Ravnotežni čas = \(8\,\hbox {s}\), korak napetosti = \(3\,\hbox {mV}\), hitrost premikanja = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Najvišji tokovi, dobljeni iz voltamogramov DNK, kompleksirane z \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \ (503\,\hbox {bp}\) življenjepis, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) življenjepis.
Voltamogrami DPV in CV so bili pridobljeni na elektrodah ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB v kompleksu z DNA (pri koncentracijah 10–\({20}\,{\ hbox {ng) }/{\upmu \hbox {l}}}\) tj. 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) za \(117\,\hbox {bp}\ ) in 0,03 –\({0,06}\,{\upmu \hbox {M}}\) za \(503\,\hbox {bp}\)). Reprezentativni voltamogrami so prikazani na sliki S1 v dodatnih informacijah. Slika 2 prikazuje rezultate meritev DPV in CV (najvišji tok) z uporabo produktov PCR, prečiščenih z gelom. V primerjavi z meritvami CV kažejo meritve DPV višjo občutljivost (tok kot funkcija koncentracije DNA), ker kapacitivni tokovi ozadja pri meritvah CV skrivajo Faradaicove tokove 26. Podatki za vsako polje v škatli vsebuje meritve s 5 elektrodami. Vse meritve uporabljajo isti nabor elektrod, da se izognejo merilnim napakam zaradi variacije med elektrodami. Opazili smo naraščajoči trend pri DPV in CV izmerjenih vrhovih tokov za nižje koncentracije DNA , daljši (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ v primerjavi z \(117) ) fragmentom. To je skladno s pričakovanim trendom adsorpcije elektrod, o katerem smo poročali v našem prejšnjem delu. adsorpcija kompleksa MB-DNA olajša prenos naboja na elektrodi, kar prispeva k povečanju vršnega toka. Druge študije so pokazale učinek velikosti in zaporedja oligonukleotidov na interkalacijo MB-DNA27,28,29,30.Gvanin - vsebnost citozina (GC) v dveh amplikonih (\(117\,\hbox {bp}\) in \(503\,\hbox {bp}\)) je bila približno 50 %, kar kaže, da je opazovanje Razlika je posledica Vendar pa za višje koncentracije DNA (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), za \(503\,\hbox {bp} \) in \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) za \(117\,\hbox {bp}\)), opazimo dve ojačanji vrhovi tokov podvodnikov so zmanjšani tako pri meritvah DPV kot CV. To je zato, ker se MB nasiči in interkalira med baznimi pari DNA, kar ima za posledico sterično inhibicijo redoks aktivnosti reducibilne skupine v MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Soli, prisotne v glavnih mešanicah PCR, motijo elektrostatične interakcije med MB in DNK, zato z dodajanjem \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) z \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) z gelom očiščen produkt MB za preučevanje učinka soli na interakcijo MB-DNK. Kot je prikazano na sliki 3, smo opazili, da pri višjih koncentracijah DNK (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) in \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) za \(117\,\hbox {bp} \)), v DPV in CV. Dodatek soli ni bistveno vplival na meritve (glejte sliko S2 v dodatnih informacijah za reprezentativne voltamograme). pri nižjih koncentracijah DNK dodatek soli močno zmanjša občutljivost, kar povzroči nobeno pomembno spremembo toka s koncentracijo DNK. O podobnih negativnih učinkih soli na interakcije in interkalacijo MB-DNK so že poročali drugi raziskovalci33,34.\(\hbox { Kationi Mg}^{2+}\) se vežejo na negativno fosfatno ogrodje DNK in s tem ovirajo elektrostatično interakcijo med MB in DNK. Pri višjih koncentracijah DNK povzroči sterična inhibicija redoks-aktivnih MB nižje vršne tokove, zato elektrostatične interakcije ne vplivajo bistveno na odziv senzorja. Ključna točka je, da je ta biosenzor bolj primeren za zaznavanje višjih koncentracij DNK (redko \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ali višje), za popolnoma avtomatizirano obdelavo vzorcev okoljske vode, kjer čiščenje produktov PCR z gelom morda ni izvedljivo.
Območje pod absorpcijsko krivuljo za območje valovnih dolžin 600–700 \(\hbox {nm}\) za različne koncentracije DNA v kompleksu z \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) s soljo in brez nje (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) s soljo in brez (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Koncentracije DNK, ki ustrezajo \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB vzorcev Brez DNK.
Za nadaljnje preverjanje zgornjih rezultatov smo izvedli optične meritve z UV/Vis spektrofotometrom (Thermo Scientific Multiskan GO), vzorci \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) so bili uporabljeni za vsako Merjenje. Absorpcijski podpis se zmanjšuje z naraščajočo koncentracijo DNA, kot je razvidno iz trenda površine pod absorpcijsko krivuljo za območje valovnih dolžin \(600\,\hbox {nm}\) do \(700\,\hbox { nm}\), kot je prikazano na sliki 4 (absorpcijski spekter je prikazan na sliki S3 v dodatnih informacijah). Za vzorce s koncentracijami DNK, manjšimi od \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), ni bilo pomembne razlike v privzemu med vzorci, ki vsebujejo DNK, in vzorci, ki vsebujejo samo MB (za \(503\,\hbox {bp}\) in \(117\,\hbox {bp}\ ) dolžinskih fragmentov), kar kaže na odsotnost sterične inhibicije redoks-aktivnega MB. Pri višjih koncentracijah DNA smo opazili postopno zmanjšanje absorbančnega signala in opazili manjše zmanjšanje absorbance v prisotnosti soli. Te rezultate smo pripisali molekularnim interakcije in sterična inhibicija z zlaganjem baz v hibridih DNA. Naši rezultati so skladni s poročili v literaturi o spektroskopskih študijah interkalacije MB-DNA, ki hipokromatičnost povezujejo z zmanjšanimi ravnmi energije v \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) elektronski prehodi zaradi interkalacijskih plasti 36, 37, 38.
Elektroforeza faga Phi6 v agaroznem gelu: produkti PCR dolžine \(117\,\hbox {bp}\) in \(503\,\hbox {bp}\) iz vzorcev jezerske vode. Marker M-DNA;NTC-no-template kontrola, primerji, ki vsebujejo ustrezne amplikone;PC pozitivna kontrola;1, 2, 3-nerazredčeni (1:1) vzorci jezerske vode z dodatkom v trojniku. Trak je viden pri \(\približno 50\,\hbox {bp}\) zaradi neuporabljenih oligonukleotidov v \(503\,\ hbox {bp}\) pas.
Uporabnost senzorja smo ovrednotili z uporabo vzorcev vode iz jezera Powai, ki smo jim dodali fag Phi6. Koncentracije RNA, izolirane iz vzorcev vode, dodanih s fagi, so bile v razponu od 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), medtem ko so tisti, izolirani iz očiščenih suspenzij fagov. RNA je bila ocenjena kot \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) z učinkovitostjo obnovitve približno 1 %.RNA je bila obratno prepisana v cDNA in uporabljena kot predloga za PCR in qPCR. Velikost produkta je bila potrjena z elektroforezo v agaroznem gelu (slika 5) pred testiranjem s senzorjem. Ti vzorci niso prečiščeni z gelom in zato vsebujejo vse komponente PCR kot kot tudi pomnožki, ki vas zanimajo. Vrednosti Ct, zabeležene med qPCR (tabela 1), so pokazale, da korelirajo s koncentracijo RNA, izolirane iz ustreznih vzorcev vode z dodatkom. Vrednost Ct razkriva število ciklov, potrebnih za fluorescenčni signal presegajo prag ali signal ozadja. Višje vrednosti Ct kažejo na nižje koncentracije predloge in obratno. Vrednosti Ct vzorcev NTC so bile tako visoke, kot je bilo pričakovano. Razlika v \(\približno 3\) vrednostih Ct med pozitivna kontrola in testni vzorec nadalje kažeta, da ima vsak testni vzorec približno 1 % šablone v primerjavi s pozitivno kontrolo. Prej smo razpravljali, da daljši amplikoni vodijo k boljši občutljivosti. Pomnoževanje daljših fragmentov, izoliranih iz heterogenih okoljskih vzorcev, je zahtevno glede na pomanjkljivosti nizke koncentracije virusa in razgradnje RNA. Vendar smo z našo obogatitvijo virusa in protokolom za pomnoževanje PCR uspeli uspešno pomnožiti \(503\,\hbox {bp}\) fragment za elektrokemijsko zaznavanje.
Slika 6 prikazuje rezultate elektrokemičnega senzorja pomnožka fragmenta \(503\,\hbox {bp}\), oba z uporabo nerazredčene cDNA kot matrice (1:1) in 100-krat razredčene cDNA kot matrice (1:100), izvedenega PCR , v primerjavi z NTC in PC (glejte sliko S4 v dodatnih informacijah za reprezentativne voltamograme). Vsako polje v škatli na sliki 6 vsebuje meritve treh vzorcev na 5 elektrodah. Za merjenje vseh vzorcev so bile uporabljene iste elektrode, da bi se izognili napakam zaradi elektrod V primerjavi z meritvami CV kažejo meritve DPV boljšo ločljivost za razlikovanje testnih in osebnih vzorcev od NTC, ker so, kot je bilo že omenjeno, Faradaični tokovi skriti zaradi kapacitivnih tokov v ozadju v slednjih. Za daljše amplikone smo opazili, da negativna kontrola (NTC) je povzročila višje vrhove CV in DPV glede na pozitivno kontrolo, medtem ko so pozitivni in nerazredčeni testni vzorci pokazali podobne višine vrhov vrhov DPV. Izmerjene srednje in mediane vrednosti za vsako nerazredčeno (1:1) ) preskusni vzorec in PC je mogoče jasno ločiti iz izhoda senzorja za vzorec NTC, medtem ko je ločljivost za vzorec, razredčen v razmerju 1:100, manj izrazita. Pri 100-kratni razredčitvi cDNA med gelsko elektroforezo nismo opazili nobenih pasov (proge niso prikazane na sliki 5), ustrezni vršni tokovi DPV in CV pa so bili podobni pričakovanim za NTC. Rezultati za fragment \(117\,\hbox {bp}\) so prikazani v dodatnih informacijah. Negativni kontrola je povzročila elektrokemični odziv senzorja PCB zaradi adsorpcije prostega MB na elektrodi in interakcije MB z enoverižnim začetnim oligonukleotidom. Zato je treba vsakič, ko testiramo vzorec, izvesti negativno kontrolo in temenski tok preskusnega vzorca v primerjavi z temenskim tokom, pridobljenim z negativno kontrolo, da se doseže diferencialna (relativna) meritev39,40 za razvrstitev preskusnega vzorca kot pozitivnega ali negativnega.
(a) DPV in (b) vrhovni tok CV za elektrokemično detekcijo \(503\,\hbox {bp}\) fragmentov v vzorcih jezerske vode. Testni vzorci so bili izmerjeni v treh izvodih in primerjani s kontrolami brez predloge (NTC) in pozitivne kontrole (PC).
Naše ugotovitve ponazarjajo različne mehanizme, ki vplivajo na delovanje elektrokemičnih senzorjev za amplikone različnih dolžin za različne DNK, s koncentracijami, preverjenimi z optičnimi meritvami z UV/Vis spektrofotometrom. Naša opažanja poudarjajo vpogled, da se daljši fragmenti DNK razdrobijo do \(\približno\) \(500\,\hbox {bp}\) je mogoče zaznati z večjo občutljivostjo in da prisotnost soli v vzorcu ne Občutljivost Koncentracija DNK, ki vpliva na večjo občutljivost (redko \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) in zgoraj). Poleg tega smo raziskali učinek različnih vrst vzorcev, vključno z gelsko prečiščenimi amplikoni z dodano soljo in brez nje ter dodatkom vzorcev jezerske vode pri meritvah DPV in CV.Opazili smo, da je DPV zagotovil boljšo ločljivost, saj kapacitivni tok v ozadju vpliva tudi na meritev CV, zaradi česar je manj občutljiva.
Pomnoževanje daljših fragmentov je odvisno od celovitosti virusne genomske RNA. Več študij je pokazalo, da pomnoževanje daljših fragmentov ni vedno učinkovito zaradi razgradnje RNA v okolju in možnosti spajanja med izolacijo 11,41,42,43,44 Opazili smo, da je bila metoda koncentracije virusa na osnovi PEG bolj učinkovita pri koncentriranju faga Phi-6, dodanega v vzorce jezerske vode, kot metoda koncentracije virusa na osnovi aluminijevega hidroksida. Izkazalo se je, da sposobnost zaznavanja dolgih fragmentov DNK premaga zahtevo po multipleksni PCR za razširitev več predlog s krajšo dolžino in zmanjšanje možnosti navzkrižne specifičnosti.
Bioloških vzorcev je malo, zato je treba oblikovati biosenzor, ki zahteva minimalno število vzorcev za testiranje. Elektrode ENIG PCB, uporabljene v tej študiji, zahtevajo samo \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) vzorci za testiranje, da pokrijejo učinkovito površino elektrod. Poleg tega lahko isto elektrodo ponovno uporabite po čiščenju pred razdeljevanjem naslednjega vzorca. Ojačani vzorci ne zahtevajo dodajanja nobenih drugih kemikalij razen metilenskega modrega, ki je poceni in pogosto uporabljena kemikalija. Ker vsaka elektroda stane približno 0,55 USD (ali 40 INR) za izdelavo, je ta biosenzor lahko stroškovno učinkovita alternativa obstoječim tehnologijam zaznavanja. Tabela 2 prikazuje primerjavo tega dela z drugimi senzorji, o katerih je literatura poročala že dolgo. DNK fragmenti v heterogenih vzorcih.
Glede na to, da se protokoli za elektrokemično detekcijo na podlagi MB opirajo na specifičnost PCR, je glavna omejitev te metode možnost nespecifičnega pomnoževanja v heterogenih vzorcih, kot sta odpadna in jezerska voda, ali uporaba primerjev nizke čistosti. Za izboljšanje občutljivosti elektrokemičnih detekcijskih metod za detekcijo DNK neprečiščenih produktov PCR z uporabo nespremenjenih elektrod ENIG PCB, je potrebno bolje razumeti napake, ki jih povzročajo neuporabljeni dNTP in primerji, ter optimizirati reakcijske pogoje in testne protokole. Dodatni fizikalno-kemijski parametri, kot so pH, temperatura in biološki morda bo treba izmeriti tudi potrebo po kisiku (BPK) vzorca vode, da se izboljša natančnost meritve.
Za zaključek predlagamo poceni elektrokemični senzor ENIG PCB za odkrivanje virusov v okoljskih (jezerska voda) vzorcih. Za razliko od imobiliziranih oligonukleotidnih elektrod ali prilagojenih substratov za zaznavanje DNK, ki zahtevajo kriogeno shranjevanje za ohranitev občutljivosti,53,54 naša tehnika uporablja nespremenjen PCB elektrode z daljšim rokom uporabnosti in brez posebnih zahtev glede shranjevanja in so zato primerne za razvoj merilnih rešitev z avtomatizirano obdelavo vzorcev, ki se uporabljajo v LMIC. Biosenzor uporablja poceni redoks barvila (MB) za interkalacijo DNA za hitro odkrivanje ciljnih pomnožev. Nespecifično pomnoževanje običajno v okoljskih vzorcih, zmanjša specifičnost te metode zaznavanja zaradi nespecifične vezave MB na eno- in dvoverižne oligonukleotide. Zato je specifičnost tega testa odvisna od optimizacije primerjev in reakcijskih pogojev PCR. Poleg tega CV in DPV temenske tokove, dobljene iz testiranih vzorcev, je treba interpretirati glede na odzive, dobljene iz negativne kontrole (NTC) za vsak test. Zasnove in metode elektrokemičnega senzorja, predstavljene v tem delu, je mogoče integrirati s samodejnimi vzorčevalniki za razvoj popolnoma avtomatiziranega in nizkega -cenovna rešitev, ki lahko zbira in analizira vzorce ter brezžično prenaša rezultate nazaj v laboratorij.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Metode za začetno koncentracijo virusov iz vzorcev vode: pregled in meta-analiza nedavnih študij. J.Application.microorganism.115, str. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Vodni virusi: ovire za varno pitno vodo. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Epidemiologija odpadne vode za stroškovno učinkovito obsežno spremljanje COVID-19 v državah z nizkim in srednjim dohodkom: izzivi in priložnosti. Voda 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Elektrokemija nukleinske kisline. Chemical. Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Metilen modro kot elektrokemijski diskriminator eno- in dvoverižnih oligonukleotidov, imobiliziranih na zlatih substratih. Analyst 126, 1756–1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Primerjava kationskih in anionskih interkalatorjev za elektrokemično transdukcijo hibridizacije DNA s prenosom elektronov na velike razdalje.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Prenos naboja skozi DNA: selektivni elektrokemični DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al. Mikrofluidna naprava PCR v realnem času s sočasno elektrokemijsko detekcijo. Biološki senzor. Bioelektronika. 24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al. Študija mehanizma signaliziranja in preverjanje delovanja elektrokemičnega sistema PCR v realnem času, ki temelji na interakciji metilen modrega z DNA. Analyst 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. Elektrokemični senzor za zaznavanje sars-cov-2 v vzorcih odpadne vode, posredovan z zanko, ki temelji na izotermnem ojačanju. J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. Elektrokemijsko zaznavanje amplikonov SARS-CoV-2 s PCB elektrodami. Senzor je aktiviran. B Chemistry. 343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Učinkovito odkrivanje SARS-CoV-2 RNA v trdni frakciji odpadne vode.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. Analitične metode za odkrivanje SARS-CoV-2 v odpadni vodi: protokol in prihodnje perspektive. TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Preživetje bakteriofaga z ovojnico Phi6 (nadomestek za SARS-CoV-2) v izhlapelih kapljicah sline, odloženih na steklene površine.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Okoljska obstojnost nadomestka SARS-CoV-2 (Phi6) pri prostoživečih amebah.J.Zdravje vode 20, 83 (2021).
Mindich, L. Natančno pakiranje treh genomskih fragmentov dvojnoverižne RNA bakteriofaga\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Sekundarna struktura pakirnega območja faga\(\varphi\)6 DH RNA.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al. Phages on the Tap – hiter in učinkovit protokol za pripravo laboratorijskih zalog bakteriofagov. PeerJ 4, e2261 (2016).
Čas objave: 27. maj 2022