Criofiolesunt utilizate în mod obișnuit pentru depozitarea criogenică a liniilor celulare și a altor materiale biologice critice, în recipiente Dewar umplute cu azot lichid.

Există mai multe etape implicate în conservarea cu succes a celulelor în azot lichid. Deși principiul de bază este congelarea lentă, tehnica exactă utilizată depinde de tipul de celulă și de crioprotectorul utilizat. Există mai multe considerații de siguranță și cele mai bune practici de luat în considerare atunci când se depozitează celule la temperaturi atât de scăzute.

Această postare își propune să ofere o imagine de ansamblu asupra modului în care criofiolele sunt depozitate în azot lichid.

Ce sunt criofiolele

Criofiolele sunt fiole mici, cu capac, concepute pentru depozitarea probelor lichide la temperaturi extrem de scăzute. Acestea asigură că celulele conservate în crioprotector nu intră în contact direct cu azotul lichid, reducând la minimum riscul de fracturi celulare, beneficiind în același timp de efectul extrem de răcoritor al azotului lichid.

Flacoanele sunt de obicei disponibile într-o gamă de volume și modele – pot fi filetate intern sau extern cu fund plat sau rotunjit. Sunt disponibile și formate sterile și nesterile.

Cine foloseșteCyrovialspentru a stoca celulele în azot lichid

O serie de laboratoare NHS și private, precum și instituții de cercetare specializate în stocarea sângelui din cordonul ombilical, biologia celulelor epiteliale, imunologie și biologia celulelor stem utilizează criofiole pentru crioconservarea celulelor.

Celulele conservate în acest mod includ celule B și T, celule CHO, celule stem și progenitoare hematopoietice, hibridoame, celule intestinale, macrofage, celule stem și progenitoare mezenchimale, monocite, mielom, celule NK și celule stem pluripotente.

Prezentare generală a modului de depozitare a criofiolelor în azot lichid

Crioconservarea este un proces care conservă celulele și alte structuri biologice prin răcirea lor la temperaturi foarte scăzute. Celulele pot fi stocate în azot lichid timp de ani de zile fără pierderea viabilității celulare. Aceasta este o prezentare generală a procedurilor utilizate.

Prepararea celulelor

Metoda exactă de preparare a probelor va varia în funcție de tipul de celulă, dar, în general, celulele sunt colectate și centrifugate pentru a obține o peletă bogată în celule. Această peletă este apoi resuspendată în supernatant amestecat cu crioprotector sau un mediu de crioconservare.

Mediu de crioconservare

Acest mediu este utilizat pentru a conserva celulele în mediile cu temperaturi scăzute la care vor fi supuse, prin inhibarea formării cristalelor intra și extracelulare și, implicit, a morții celulare. Rolul lor este de a oferi un mediu sigur și protector pentru celule și țesuturi în timpul proceselor de congelare, depozitare și decongelare.

Un mediu precum plasma proaspăt congelată (FFP), soluția de plasmaliți heparinizată sau soluțiile fără ser, fără componente animale, este amestecat cu crioprotectori precum dimetilsulfoxid (DMSO) sau glicerol.

Peleta de probă relichefiată este alicotată în criofiole de polipropilenă, cum ar fiSuzhou Ace Biomedical company Flacoane de depozitare criogenică.

Este important să nu umpleți excesiv criofiolele, deoarece acest lucru va crește riscul de crăpare și posibila eliberare a conținutului (1).

Rată de îngheț controlată

În general, pentru crioconservarea cu succes a celulelor se utilizează o rată de congelare lentă și controlată.

După ce probele sunt împărțite în flacoane criogenice, acestea sunt plasate pe gheață umedă sau într-un frigider la 4℃, iar procedura de congelare începe în decurs de 5 minute. Ca ghid general, celulele sunt răcite cu o rată de -1 până la -3 pe minut (2). Acest lucru se realizează folosind un răcitor programabil sau prin plasarea flacoanelor într-o cutie izolată plasată într-un congelator cu viteză controlată de la –70°C la –90°C.

Transfer în azot lichid

Flacoanele criogenice congelate sunt apoi transferate într-un rezervor de azot lichid pentru perioade nelimitate, cu condiția să se mențină o temperatură mai mică de -135 ℃.

Aceste temperaturi ultra-scăzute pot fi obținute prin imersie în azot în fază lichidă sau de vapori.

Fază lichidă sau de vapori?

Depozitarea în azot în fază lichidă este cunoscută pentru menținerea temperaturii scăzute cu o consistență absolută, dar adesea nu este recomandată din următoarele motive:

• Nevoia de volume mari (adâncime) de azot lichid, care reprezintă un pericol potențial. Arsurile sau asfixierea cauzate de aceasta reprezintă un risc real.
• Cazuri documentate de contaminare încrucișată cu agenți infecțioși precum aspergillus, hepatita B și răspândire virală prin mediul de azot lichid (2,3)
• Posibilitatea ca azotul lichid să se scurgă în fiole în timpul imersiei. Când este scos din depozit și încălzit la temperatura camerei, azotul se extinde rapid. În consecință, fiola se poate sparge atunci când este scoasă din depozitul de azot lichid, creând un pericol atât din cauza resturilor proiectate, cât și a expunerii la conținut (1, 4).

Din aceste motive, depozitarea la temperaturi ultra-scăzute se face cel mai frecvent în azot în fază de vapori. Atunci când probele trebuie depozitate în fază lichidă, trebuie utilizate tuburi crioflex specializate.

Dezavantajul fazei de vapori este că poate apărea un gradient vertical de temperatură, rezultând fluctuații de temperatură între -135℃ și -190℃. Acest lucru necesită o monitorizare atentă și diligentă a nivelurilor de azot lichid și a variațiilor de temperatură (5).

Mulți producători recomandă ca criofiolele să fie potrivite pentru depozitare până la -135℃ sau pentru utilizare numai în fază de vapori.

Decongelarea celulelor crioconservate

Procedura de decongelare este stresantă pentru o cultură congelată, iar manipularea și tehnica adecvate sunt necesare pentru a asigura viabilitatea, recuperarea și funcționalitatea optime a celulelor. Protocoalele exacte de decongelare vor depinde de tipurile specifice de celule. Cu toate acestea, decongelarea rapidă este considerată standard pentru:

• Reduce orice impact asupra recuperării celulare
• Ajută la reducerea timpului de expunere la substanțele dizolvate prezente în mediul de congelare
• Minimizează orice daune prin recristalizarea gheții

Băile de apă, băile cu sfere sau instrumentele automate specializate sunt utilizate în mod obișnuit pentru decongelarea probelor.

Cel mai frecvent, se dezgheață o linie celulară pe rând, timp de 1-2 minute, prin agitare ușoară într-o baie de apă la 37℃, până când rămâne doar puțină gheață în fiolă, înainte de a fi spălate într-un mediu de creștere preîncălzit.

Pentru unele celule, cum ar fi embrionii de mamifere, încălzirea lentă este esențială pentru supraviețuirea lor.

Celulele sunt acum pregătite pentru cultura celulară, izolarea celulelor sau, în cazul celulelor stem hematopoietice, pentru studii de viabilitate pentru a garanta integritatea celulelor stem donatoare înainte de terapia mieloablativă.

Este o practică normală să se preleveze mici alicote din proba pre-spălată utilizată pentru a efectua o numărătoare celulară pentru a determina concentrațiile celulare pentru cultivare. Apoi, puteți evalua rezultatele procedurilor de izolare a celulelor și puteți determina viabilitatea celulară.

Cele mai bune practici pentru depozitarea criofiolelor

Crioconservarea cu succes a probelor depozitate în criofiole depinde de mulți elemente din protocol, inclusiv depozitarea corespunzătoare și păstrarea înregistrărilor.

• Împărțirea celulelor între locații de stocare– Dacă volumele permit, separați celulele în flacoane și depozitați-le în locații separate pentru a reduce riscul de pierdere a probelor din cauza defecțiunilor echipamentului.
• Preveniți contaminarea încrucișată– Optați pentru flacoane criogenice sterile de unică folosință sau autoclave înainte de utilizarea ulterioară
• Folosiți fiole de dimensiuni adecvate pentru celulele dumneavoastră– flacoanele sunt disponibile într-o gamă de volume între 1 și 5 ml. Evitați umplerea excesivă a flacoanelor pentru a reduce riscul de crăpare.
• Selectați fiole criogenice cu filet intern sau extern– Unele universități recomandă fiolele cu filet intern din motive de siguranță – acestea pot preveni și contaminarea în timpul umplerii sau la depozitarea în azot lichid.
• Prevenirea scurgerilor- Utilizați garnituri bi-injectate turnate în capacul filetat sau inele O pentru a preveni scurgerile și contaminarea.
• Folosește coduri de bare 2D și etichetează flacoanele– pentru a asigura trasabilitatea, flacoanele cu suprafețe mari de scriere permit etichetarea adecvată a fiecărui flacon. Codurile de bare 2D pot ajuta la gestionarea depozitării și la păstrarea evidențelor. Capacele codificate prin culori sunt utile pentru o identificare mai ușoară.
• Întreținere adecvată a depozitării- Pentru a se asigura că celulele nu se pierd, vasele de depozitare trebuie să monitorizeze constant temperatura și nivelurile de azot lichid. Trebuie instalate alarme pentru a alerta utilizatorii cu privire la erori.

Măsuri de siguranță

Azotul lichid a devenit o practică obișnuită în cercetarea modernă, dar prezintă riscul de vătămări grave dacă este utilizat incorect.

Trebuie purtat echipament individual de protecție (EIP) adecvat pentru a reduce la minimum riscul de degerături, arsuri și alte incidente adverse la manipularea azotului lichid. Purtați

• Mănuși criogenice
• Halat de laborator
• Mască facială completă rezistentă la impact, care acoperă și gâtul
• Pantofi cu vârful închis
• Șorț din plastic rezistent la stropire

Frigiderele cu azot lichid ar trebui amplasate în zone bine ventilate pentru a minimiza riscul de asfixiere – azotul eliberat se vaporizează și înlocuiește oxigenul atmosferic. Magazinele cu volum mare de oxigen ar trebui să aibă sisteme de alarmă pentru nivel scăzut de oxigen.

Lucrul în perechi atunci când se manipulează azot lichid este ideal, iar utilizarea acestuia în afara orelor normale de lucru ar trebui interzisă.

Criofiale pentru a vă susține fluxul de lucru

Compania Suzhou Ace Biomedical oferă o gamă largă de produse care satisfac nevoile dumneavoastră de crioconservare pentru diferite tipuri de celule. Portofoliul include o gamă de tuburi, precum și o gamă de crioflacoane sterile.

Criofiolele noastre sunt:

• Capac cu filet de laborator 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml criofiole criogenice cu fund conic și garnitură

  ● Specificații 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, cu fustă sau fără fustă
  ● Sunt disponibile modele conice sau independente, sterile sau nesterile
  ● Tuburile cu capac filetat sunt fabricate din polipropilenă de calitate medicală
  ● Flacoanele criotub din PP pot fi congelate și decongelate în mod repetat
  ●Designul capacului extern poate reduce probabilitatea de contaminare în timpul tratamentului probei.
  ● Tuburi criogenice cu capac filetat Filet universal pentru utilizare
  ● Țevile se potrivesc la majoritatea rotoarelor comune
  ● Tuburile criogenice cu inel O se potrivesc cu congelatoare standard de 1 inch și 2 inch, cu 48 de godeuri, 81 de godeuri, 96 de godeuri și 100 de godeuri
  ● Autoclavabil până la 121°C și congelabil până la -86°C

  NR. PIESĂ	MATERIAL	VOLUM	CAPACCULOARE	PCS/SAC	GENȚI/CUTIE
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Negru, Galben, Albastru, Roșu, Mov, Alb	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Negru, Galben, Albastru, Roșu, Mov, Alb	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Negru, Galben, Albastru, Roșu, Mov, Alb	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Negru, Galben, Albastru, Roșu, Mov, Alb	500	10