लामो एम्प्लिकनहरूले PCB इलेक्ट्रोडहरू प्रयोग गरेर पानीको नमूनाहरूमा भाइरल न्यूक्लिक एसिडहरूको इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सिङको लागि राम्रो संवेदनशीलता प्रदान गर्दछ।

Nature.com मा जानुभएकोमा धन्यवाद।तपाईँले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजर संस्करणमा CSS को लागि सीमित समर्थन छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अपडेट गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड बन्द गर्नुहोस्)।यस बीचमा, सुनिश्चित गर्न। निरन्तर समर्थन, हामी शैली र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट प्रदर्शन गर्नेछौं।
कोभिड-१९ महामारीको शुरुवातदेखि नै वातावरणीय नमूनाहरूको अनुगमनको महत्त्वलाई धेरै प्रशंसा गरिएको छ, र qPCR-आधारित प्रविधिहरू महँगो भए तापनि सुनको मानक प्रयोग गरी केही अनुगमन प्रयासहरू भइरहेका छन्। न्यून र मध्यम आय भएका देशहरूमा वातावरणीय पानीका नमूनाहरू अनुगमनका लागि समाधान। यस कार्यमा, हामीले ENIG प्रयोग गरी स्पाइक लेक पानीका नमूनाहरू (SARS-CoV-2 का लागि लोकप्रिय सरोगेट) बाट अलग गरिएको Phi6 फेजबाट प्राप्त एम्प्लिकनहरूको इलेक्ट्रोकेमिकल पत्ता लगाउने प्रदर्शन गर्छौं। सतह परिमार्जन बिना PCB इलेक्ट्रोड पूरा गर्न।सेक्स। इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सर प्रतिक्रियालाई विभिन्न लम्बाइका दुई DNA टुक्राहरू (\({117}\,\hbox {bp}\) र \({503}\,\hbox {bp}\)) को लागि राम्रोसँग चित्रण गरिएको थियो, र मिथाइलिन नीलो (MB)-DNA अन्तरक्रियामा PCR मास्टर मिक्सहरूमा नुनको प्रभाव। हाम्रो नतिजाहरूले DNA टुक्राहरूको लम्बाइले इलेक्ट्रोकेमिकल संवेदनशीलतालाई महत्त्वपूर्ण रूपमा निर्धारण गर्छ र PCR उत्पादनहरूको जेल शुद्धीकरण बिना लामो एम्प्लिकनहरू पत्ता लगाउन सक्ने क्षमता देखाउँछ। पानी नमूनाहरूको स्थिति मापनको लागि महत्त्वपूर्ण।भाइरल लोडको लागि पूर्ण रूपमा स्वचालित समाधान राम्रोसँग बोड गर्दछ।
पोलियो र हेपाटाइटिस E1 को जलजनित प्रसारणको पहिलो प्रमाणको साथ, 1940 देखि जलजनित भाइरस प्रसारणलाई सार्वजनिक स्वास्थ्य खतराको रूपमा चिनिन्छ। विश्व स्वास्थ्य संगठन (WHO) ले मध्यम देखि उच्च स्वास्थ्य महत्वका धेरै पानीजन्य भाइरल रोगजनकहरूलाई वर्गीकृत गरेको छ। पत्ता लगाउने विधिहरू सुन-मानक qPCR-आधारित प्रविधिहरूमा निर्भर हुन्छन्, जुन अत्यधिक संवेदनशील र विशिष्ट छन्, तर महँगो उपकरणहरू प्रयोग गरेर प्रयोगशालामा परीक्षण गर्न दक्ष कर्मचारीहरू चाहिन्छ। यद्यपि, सीमित स्रोतहरू भएका न्यून र मध्यम आय भएका देशहरूमा (LMICs) मानव नमूना परीक्षणले वातावरणीय पानीको नमूना अनुगमनलाई प्राथमिकता दिने सम्भावना छ। त्यसैले, कम र मध्यम आय भएका देशहरूमा पानी र फोहोर पानीको नमूनाहरूको दिगो, वास्तविक-समय अनुगमनको लागि वैकल्पिक कम लागत विधिहरू उदाउँदो रोगको प्रकोपको प्रारम्भिक चेतावनीको रूपमा आवश्यक छ। यसरी तिनीहरूलाई भाइरस महामारीको गम्भीर सामाजिक आर्थिक प्रभावहरूबाट जोगाउँछ। न्यूक्लिक एसिडका लागि कम लागतको इलेक्ट्रोकेमिकल बायोसेन्सरहरूले यो अपरिहार्य आवश्यकताको लागि आशाजनक सम्भावित समाधान प्रदान गर्न सक्छ। यी धेरै DNA बायोसेन्सरहरू इलेक्ट्रोडमा पूरक DNA स्ट्र्यान्डहरू स्थिर छन् भन्ने तथ्यद्वारा काम गर्छन्। सतह र हाइब्रिडाइज गर्नुहोस् जब एक मिल्दो अनुक्रम नमूनामा अवस्थित हुन्छ। यसलाई त्यसपछि विभिन्न इलेक्ट्रोकेमिकल प्रविधिहरू द्वारा पोटासियम आइरन/फेरोसायनाइड जस्ता रेडक्स मध्यस्थहरू प्रयोग गरेर संकेतमा रूपान्तरण गर्न सकिन्छ। मेथिलिन ब्लू (एमबी) एउटा यस्तो रेडक्स-सक्रिय अणु हो। डबल-स्ट्र्यान्डेड DNA (dsDNA) मा एकल-स्ट्र्यान्डेड DNA5,6 मा यसको थप गैर-विशिष्ट बन्धनका साथै इन्टरकलेट भएको रिपोर्ट गरिएको छ। MB-DNA कम्प्लेक्सहरू बनाउन MBs को अन्तर्क्रियात्मक प्रकृतिले तिनीहरूलाई धेरै इलेक्ट्रोकेमिकल DNA मा रेडक्स मध्यस्थकर्ताहरूको रूपमा लोकप्रिय छनोट बनाउँछ। सेन्सर कन्फिगरेसन ५,६,७,८,९।यद्यपि डीएनएमा एमबीको अन्तरविशिष्टता अविशिष्ट छ, र यस इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सरको विशिष्टता धेरै हदसम्म पीसीआर वा आइसोथर्मल एम्प्लीफिकेशनका लागि प्रयोग गरिने प्राइमरहरूको शुद्धतामा निर्भर गर्दछ, यो वास्तविक कार्यान्वयनको लागि राम्रोसँग उपयुक्त छ। -समय इलेक्ट्रोकेमिकल-आधारित qPCR वा फ्लोरोसेन्स आइसोथर्मल एम्प्लीफिकेशन DNA एकाग्रता मापनको विकल्पको रूपमा 9। यस्तो कार्यान्वयनमा, वोन एट अल। सुन इलेक्ट्रोडहरूको सतह वास्तविक-समयको लागि 6-mercapto-1-hexanol (MCH) सँग परिमार्जन गरिएको थियो। डिफरेंशियल पल्स भोल्टामेट्री (DPV) प्रयोग गरेर MB सँग PCR एम्प्लिकनहरूको मापन प्रतिक्रियाहरूमा इलेक्ट्रोकेमिकली रूपमा एम्प्लिकनहरू पत्ता लगाउन डिजाइन गरिएको माइक्रोफ्लुइडिक PCR प्लेटफर्ममा सिटु इलेक्ट्रोडहरू जस्तै प्रयोग गरिन्छ 8। यी सबै अध्ययनहरूलाई इलेक्ट्रोडको सतह परिमार्जन आवश्यक पर्दछ, यी कार्यात्मक इलेक्ट्रोडहरूको स्थिरताका लागि विशेष भण्डारण आवश्यकताहरूको कारणले उत्पादन र सञ्चालन लागतहरू बढ्छ।
तालको पानीको नमूनाहरूमा केन्द्रित भाइरल कणहरूबाट प्राप्त एम्प्लिकनहरूको इलेक्ट्रोकेमिकल पत्ता लगाउनको लागि कार्यप्रवाहको योजनाबद्ध।
हामीले भर्खरै SARS-CoV-2 amplicons को इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सिङ प्रदर्शन गर्‍यौं जसमा कम लागतको मुद्रित सर्किट बोर्ड (PCB) इलेक्ट्रोडहरू DPV र साइक्लिक भोल्टामेट्री (CV) मा आधारित MB-DNA कम्प्लेक्सहरूको शोषणद्वारा प्रेरित इलेक्ट्रोडको शिखरमा परिवर्तनहरू छन्। हालको ११।हामी रिपोर्ट गर्छौं कि लामो DNA टुक्राहरू (N1-N2, \({943}\, \hbox) CDC-सिफारिस गरिएको N1 अगाडि र N2 रिभर्स प्राइमरहरू प्रयोग गरेर बनाइएका छोटो टुक्राहरू {bp}\)) ले सेन्सर प्रतिक्रियामा राम्रो रेखीयता देखायो। ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) N1 अगाडि र N1 रिभर्स प्राइमर सेटहरू प्रयोग गरेर गठन गरियो। यी अध्ययनहरू न्यूक्लिज-मुक्त पानीमा तयार पारिएको DNA dilutions प्रयोग गरेर रिपोर्ट गरिएको छ। प्लेटफर्म पनि SARS-CoV पत्ता लगाउन प्रयोग गरिएको थियो। सिमुलेटेड फोहोर पानीको नमूनाहरूमा -2 एम्प्लिकनहरू (SARS-CoV-2 RNA सँग कुल आरएनए नमूनाहरू स्पाइक गरेर प्राप्त गरिएको)। RNA अलगाव र डाउनस्ट्रीम प्रशोधनका क्रममा कतर्नको लागि संवेदनशील भएकोले, 12,13 यो विषम नमूनाको साथ लामो टुक्राहरू विस्तार गर्न गाह्रो छ। तसर्थ, फोहोर पानीमा SARS-CoV-2 amplicon को इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सिङको प्रदर्शन छोटो \(72\,\hbox {bp}\) N1 टुक्रामा सीमित छ।
यस कार्यमा, हामीले फेज Phi6 केन्द्रित र तालको पानीको नमूनाहरू (चित्र 1) बाट अलग गरिएको ENIG PCB-आधारित इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सिङको सम्भाव्यताको अनुसन्धान गर्‍यौं। Phi6 फेजहरू आकारमा (80-100 nm) SARS-CoV-2 र लिपिड झिल्ली र स्पाइक प्रोटीन पनि हुन्छ। यी कारणहरूका लागि, ब्याक्टेरियोफेज Phi6 SARS-CoV-2 र अन्य खाममा परेका रोगजनक RNA भाइरसहरू 14,15 को लागि एक लोकप्रिय सरोगेट हो। फेज कणहरूबाट पृथक RNA cDNA संश्लेषणको लागि टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। PCR लम्बाइमा 117 र 503 आधार जोडीका दुई DNA टुक्राहरू प्राप्त गर्न। हाम्रो अघिल्लो काममा \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 टुक्राहरूलाई प्रवर्द्धन गर्ने चुनौतीलाई दिँदै, हामी मध्यवर्ती लम्बाइका टुक्राहरूलाई लक्षित गर्छौं (\(117) \,\hbox {bp}\) र \(503 \,\hbox {bp}\)), उपलब्ध प्राइमरहरूमा आधारित। इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सर प्रतिक्रिया व्यवस्थित रूपमा विस्तृत एकाग्रता दायरा (\({10}\,{) मा अध्ययन गरिएको थियो। \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) to \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) मा दुवै टुक्राहरूको लागि MB को उपस्थिति, सेन्सर प्रतिक्रिया मा नुन को प्रभाव वर्णित गरिएको छ र स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक मापन द्वारा क्रस-प्रमाणीकरण गरिएको छ। यस कार्य को मुख्य योगदान निम्नानुसार छन्:
डीएनए टुक्राको लम्बाइ र नमूनामा नुनको उपस्थितिले संवेदनशीलतालाई कडा असर गर्छ।हाम्रा परिणामहरूले देखाउँछन् कि इलेक्ट्रोकेमिकल गतिविधि MB, DNA, र भोल्टमेट्रिक प्रतिक्रियामा सेन्सरको अन्तरक्रियाको विभिन्न संयन्त्रहरूमा निर्भर गर्दछ, DNA एकाग्रता र लम्बाइमा निर्भर गर्दछ, लामो टुक्राहरूसँग उच्च संवेदनशीलता देखाउँदछ, यद्यपि नुनले इलेक्ट्रोस्टेटिक अन्तरक्रियाहरूमा नकारात्मक प्रभाव पार्छ। एमबी र डीएनए।
DNA एकाग्रताले अपरिवर्तित इलेक्ट्रोडहरूमा MB-DNA अन्तरक्रियाको मेकानिजम निर्धारण गर्छ हामीले देखाउँछौं कि MB-DNA अन्तरक्रियाका विभिन्न संयन्त्रहरू DNA एकाग्रतामा निर्भर हुन्छन्। DNA सांद्रतामा थोरै मात्रामा \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox) {l}}}\), हामीले देख्यौं कि इलेक्ट्रोकेमिकल वर्तमान प्रतिक्रिया मुख्यतया इलेक्ट्रोडमा MB-DNA को अवशोषणद्वारा निर्धारण गरिएको थियो, जबकि कम सांद्रतामा उच्च DNA सांद्रतामा, इलेक्ट्रोकेमिकल वर्तमान प्रतिक्रिया रेडक्सको स्टेरिक अवरोध द्वारा निर्धारण गरिएको थियो। DNA आधार जोडीहरू बीच MB सम्मिलनको कारण गतिविधि।
ENIG PCB-आधारित इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सिङ अफ भाइरल न्यूक्लिक एसिडहरू तालको पानी नमूनाहरू अवलोकनहरू Phi6-added \(503\,\hbox {bp}\) DNA टुक्राहरू पवई ताल, IIT मुम्बई क्याम्पसबाट पानीको नमूनाहरूबाट प्राप्त इलेक्ट्रोकेमिकल पत्ता लगाएर प्रमाणित गरियो। परिणाम फेज।
कार्यान्वयनको कम लागत र पूर्ण स्वचालित निगरानी प्रणाली, ओलिगोन्यूक्लियोटाइड वा एप्टेमरहरूमा लामो शेल्फ जीवनको साथ इलेक्ट्रोडहरूमा एकीकरणको लागि सम्भावना।
Phage Phi6 Cytoviridae परिवारको एक आच्छादित dsRNA भाइरस हो जसले स्यूडोमोनास syringae लाई संक्रमित गर्दछ। Phi6 फेजको जीनोम 3 टुक्राहरूको रूपमा अवस्थित छ: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) र L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17। Phi6 फेजले गैर-प्याथोजेनिक BSL-1 स्यूडोमोनास स्ट्रेनलाई संक्रमित गरेको हुनाले, यो प्रयोग गर्न सुरक्षित छ। र प्रयोगशालामा सजिलै हुर्काउन सकिन्छ। Phage Phi6 र यसको होस्ट Pseudomonas syringae फेलिक्स d'Herelle सन्दर्भ केन्द्र फर ब्याक्टेरियल भाइरस, लावल विश्वविद्यालय, क्यानडाबाट खरिद गरिएको थियो (सन्दर्भ केन्द्र सूची नम्बरहरू क्रमशः HER-102 र HER-1102 हुन्)। .Phi6 फेज र यसको होस्टलाई सन्दर्भ केन्द्र द्वारा निर्देशित रूपमा पुनर्जीवित गरिएको थियो। Phage Phi6 लाई प्लेट लाइसिस र एल्युसनद्वारा शुद्ध गरिएको थियो \(\ लगभग 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox} सँग अन्तिम टाइटरहरू प्राप्त गर्न। ml}}\) (प्लेक बनाउने इकाइहरू/ मिलिलिटरहरू)। निर्माताको निर्देशन अनुसार GenElute™ युनिभर्सल टोटल आरएनए प्युरिफिकेशन किट (सिग्मा-एल्ड्रिच) प्रयोग गरेर RNA शुद्ध फेज कणहरूबाट अलग गरिएको थियो। छोटकरीमा, एक शुद्ध फेज Phi6 निलम्बन\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) लाई लाइज गरिएको थियो र RNA लाई राल स्तम्भमा बाँध्न अनुमति दिन स्पिन स्तम्भमा lysate लोड गरिएको थियो। RNA त्यसपछि इल्युसन समाधानमा इल्युट हुन्छ \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) किटद्वारा प्रदान गरिएको। \(260\,\hbox {nm}\) मा अवशोषणद्वारा RNA को एकाग्रता अनुमान गर्नुहोस्। RNA को aliquots मा भण्डार गरिएको थियो। ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) अर्को प्रयोग नभएसम्म।\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) iScript cDNA संश्लेषण किट (बायो -राड प्रयोगशालाहरू) निर्माताको निर्देशनहरू पछ्याएर cDNA संश्लेषणको लागि टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। छोटकरीमा, cDNA संश्लेषण प्रतिक्रियामा 3 चरणहरू हुन्छन्: \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ मा प्राइमिंग। )\({5}\,{\hbox {min} }\) , \({20}\,{\hbox {min}}\) को उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), र रिभर्स रेकर्डर \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) \({1}\,{\hbox {मिनट) मा छ }}\) 1% agarose जेलमा चलाउँदा, cDNA ले अपेक्षित तीनवटा RNA टुक्राहरूसँग मिल्दोजुल्दो तीनवटा ब्यान्डहरू देखायो (डेटा देखाइएको छैन)। निम्न प्राइमरहरू 117 र 503 bp लम्बाइका दुई DNA टुक्राहरूलाई विस्तार गर्न प्रयोग गरियो, miniPCR® mini8 थर्मल साइकलमा PCR को लागि टेम्प्लेटको रूपमा cDNA प्रयोग गर्दै:
\(117\,\hbox {bp}\) र \(503\,\hbox {bp}\) का प्राइमरहरू M खण्डको 1476-1575 न्यूक्लियोटाइडहरू र L खण्डको 458-943 न्यूक्लियोटाइडहरू, क्रमशः एसिडसँग मेल खान्छ। सबै एम्प्लीफाइड PCR उत्पादनहरू 1% agarose gels मा इलेक्ट्रोफोरेस गरिएको थियो, र एम्प्लीफाइड लक्ष्य DNA GeneJET जेल एक्स्ट्र्याक्शन किट (थर्मो फिशर वैज्ञानिक) को प्रयोग गरेर शुद्ध गरियो।
आईआईटी मुम्बई क्याम्पसमा एउटा ताल (पवई ताल, पवई, मुम्बई) फेज कणहरू थप्न प्रयोग गरिएको थियो। तालको पानी हटाउनको लागि \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) झिल्ली मार्फत फिल्टर गरिएको थियो। निलम्बित कणहरू, र त्यसपछि Phi6 फेज थपियो। \({1}\,{\hbox {ml}}\) \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} थप्नुहोस्। \) \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) फिल्टर गरिएको तालको पानी, \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\) मा। एउटा सानो एलीकोट थियो। प्लाक परख द्वारा भाइरल लोड मापनको लागि आरक्षित। हामीले स्पिक्ड Phi6 भाइरस कणहरू केन्द्रित गर्न दुई फरक तरिकाहरू परीक्षण गर्‍यौं: (1) एल्युमिनियम हाइड्रोक्साइड शोषण-वर्षा विधि, 19 जुन वातावरणीय नमूनाहरूबाट धेरै खाममा राखिएका आरएनए भाइरसहरूको एकाग्रताको लागि मान्य गरिएको छ, र (२)) पोलिथिलीन ग्लाइकोल (पीईजी) मा आधारित भाइरस एकाग्रता विधि फ्लड एट अलबाट अनुकूलित गरिएको थियो।20. PEG-आधारित विधिको रिकभरी दक्षता एल्युमिनियम हाइड्रोक्साइड विधिको भन्दा राम्रो फेला परेको हुनाले, PEG-आधारित विधि तालको पानीको नमूनाहरूबाट Phi6 कणहरू केन्द्रित गर्न प्रयोग गरिएको थियो।
प्रयोग गरिएको PEG विधि निम्नानुसार थियो: PEG 8000 र \(\hbox {NaCl}\) 8% PEG 8000 र \(0.2\,\hbox {M} \) प्राप्त गर्न Phi6-स्पाइक तालको पानी नमूनाहरूमा थपियो। \ hbox {NaCl}\। नमूनाहरू शेकरमा इन्क्युबेटेड थिए\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), त्यसपछि \(4700 \,\hbox {g}\) मा सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको \({45}\,{\hbox {min}}\) हुन्छ। सुपरनाटेन्ट खारेज गर्नुहोस् र गोलीलाई \({1}\,) मा पुन: सस्पेन्ड गर्नुहोस्। {\hbox {ml}}\) एउटै सुपरनाटन्टमा। सबै स्पाइकिङ र भाइरस एकाग्रता प्रयोगहरू ट्रिपलिकेटमा प्रदर्शन गरिएको थियो। एकाग्रता पछि, प्लाक परख द्वारा रिकभरी दक्षताको मापनको लागि एउटा सानो एलीकोट आरक्षित गरिएको थियो। आरएनएलाई पहिले वर्णन गरिए अनुसार अलग गरिएको थियो। किट-आपूर्ति गरिएको इल्युसन बफर\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\) मा। RNA एकाग्रता नमूनादेखि नमूनामा भिन्न हुने हुनाले, \({2}\,{\upmu \ RNA को hbox {l}}\) नमूनाहरूको cDNA संश्लेषणको एकाग्रतालाई ध्यान नदिई सबै तीनका लागि प्रयोग गरिन्छ। cDNA संश्लेषण पहिले वर्णन गरिए अनुसार गरिएको थियो।\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) \(117\,\hbox {bp}\) र \(503\,\hbox { को विस्तार गर्न ३५ चक्रहरूको लागि PCR को टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। bp}\) टुक्राहरू। यी नमूनाहरूलाई "1:1″ को रूपमा प्रतिनिधित्व गरिन्छ, अर्थात् कमजोरी बिना। एक नो-टेम्प्लेट नियन्त्रण (NTC) नकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा सेटअप गरिएको थियो, जबकि शुद्ध फेजबाट अलग गरिएको RNA प्रयोग गरेर संश्लेषित गरिएको cDNA सेटअप गरिएको थियो। सकारात्मक नियन्त्रण (PC) को लागि टेम्प्लेटको रूपमा। Quantitative PCR (qPCR) Briliant III अल्ट्रा-फास्ट SYBR ग्रीन QPCR मास्टर मिक्स (Agilent टेक्नोलोजीहरू) को प्रयोग गरेर Stratagene Mx3000P RT-PCR उपकरणमा प्रदर्शन गरिएको थियो। प्रतिक्रियाहरू पहिले जस्तै ट्रिपलिकेटमा सेट अप गरिएको थियो। वर्णन गरिएको। चक्र थ्रेसहोल्ड (Ct) सबै नमूनाहरूको लागि रेकर्ड गरिएको थियो। साथै, पातलो नमूनाहरू \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) फिल्टर गरिएको तालको पानीमा 1:100 पातलो cDNA प्रयोग गरी \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) 35 चक्रहरूको लागि PCR। यी नमूनाहरूलाई "1:100″ को रूपमा प्रतिनिधित्व गरिन्छ।
PCB इलेक्ट्रोडहरू व्यावसायिक रूपमा उपलब्ध कम लागतको इलेक्ट्रोलेस निकेल इमर्सन गोल्ड (ENIG) प्रक्रिया प्रयोग गरेर थप सुनको प्लेटिङको आवश्यकता बिना नै बनाइन्छ। ENIG PCB इलेक्ट्रोड विनिर्देशहरू हाम्रो अघिल्लो कार्यमा विस्तृत छन्। ENIG PCB इलेक्ट्रोडहरूका लागि, परम्परागत इलेक्ट्रोड सफाई विधिहरू जस्तै। पिरान्हा घोल वा सल्फ्यूरिक एसिड चक्रीय भोल्टामेट्री सिफारिस गरिदैन किनकि यसले सुनको पातलो तह (मोटाई \(\ लगभग\) \(100\,\hbox {nm }\)) को पील पार्न सक्छ र प्रवण भएको अन्तर्निहित तामाको तहलाई उजागर गर्दछ। 21, 22, 23, 24, 25. त्यसकारण, IPA ले भिजाइएको लिन्ट-फ्री कपडाले इलेक्ट्रोडहरू सफा गर्नुहोस्। परीक्षण गरिने नमूना \({50}\,{\upmu \hbox {M}) सँग इन्क्युबेटेड थियो। }\) MB मा \({4}\,{^{\circ}\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) सजिलो घुसाउनको लागि। हाम्रो अघिल्लो काममा , हामीले अवलोकन गर्यौं कि सेन्सरको संवेदनशीलता र रेखीयता MB एकाग्रता 11 बढाएर सुधार गरिएको थियो। हाम्रो पहिलेको काममा रिपोर्ट गरिएका अनुकूलनहरूमा आधारित, हामीले \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB प्रयोग गर्यौं। यस अध्ययनमा DNA सम्मिलित गर्न सांद्रता। डबल-स्ट्र्यान्डेड DNA (ds-DNA) को इलेक्ट्रोकेमिकल पत्ता लगाउने anionic वा cationic intercalators को प्रयोग गरेर प्राप्त गर्न सकिन्छ। यद्यपि anionic intercalators ले DNA लाई राम्रो चयनशीलताको साथ पत्ता लगाउँदछ, तिनीहरूलाई रातभर इन्क्युबेशन चाहिन्छ, जसले गर्दा पत्ता लगाउने समय लामो हुन्छ। अर्कोतर्फ, MB जस्ता cationic intercalators लाई ds-DNA6 को इलेक्ट्रोकेमिकल पत्ता लगाउनको लागि लगभग \({1}\,{\hbox {h}}\) छोटो इन्क्युबेशन समय चाहिन्छ। प्रत्येक मापनमा परीक्षण गर्न नमूना वितरण समावेश हुन्छ। इलेक्ट्रोड\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), त्यसपछि अर्को नमूनाको साथ अगाडि बढ्नु अघि, IPA- ओसिलो र्यागले सफा गर्दै।एउटा मापन।प्रत्येक नमूना 5 फरक इलेक्ट्रोडहरूमा परीक्षण गरिएको थियो जबसम्म अन्यथा भनिएको थिएन। DPV र CV मापनहरू PalmSens Sensit Smart potentiostat प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको थियो, र PSTrace सफ्टवेयर potentiostat कन्फिगरेसन र डेटा प्राप्तिको लागि प्रयोग गरिएको थियो, शिखर हालको गणनाहरू सहित। निम्न सेटिङहरू प्रयोग गरिन्छ। DPV र CV मापनका लागि:
DPV: सन्तुलन समय = \(8\,\hbox {s}\), भोल्टेज चरण = \(3\,\hbox {mV}\), पल्स भोल्टेज = \(25\,\hbox {mV}\) , पल्स अवधि = \(50\,\hbox {ms}\), स्क्यान दर = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: सन्तुलन समय = \(8\,\hbox {s}\), भोल्टेज चरण = \(3\,\hbox {mV}\), स्वीप दर = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
\({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ सँग जटिल DNA को भोल्टामोग्रामबाट प्राप्त शिखर धाराहरू (५०३\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV।
DPV र CV voltammograms ENIG PCB इलेक्ट्रोड \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB DNA संग जटिल (१०–\({20}\,{\ hbox {ng को सांद्रतामा) मा प्राप्त गरियो। }/{\upmu \hbox {l}}}\) अर्थात ०.१३–\({0.२६}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(११७\,\hbox {bp}\) र ०.०३ को लागि –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) \(503\,\hbox {bp}\) का लागि। प्रतिनिधि भोल्टामोग्रामहरूलाई पूरक जानकारीको चित्र S1 मा देखाइएको छ। चित्र 2 परिणामहरू देखाउँछ। जेल-प्युरिफाइड PCR उत्पादनहरू प्रयोग गरेर DPV र CV मापनहरू (चरम वर्तमान)। CV मापनहरूको तुलनामा, DPV मापनहरूले उच्च संवेदनशीलता (DNA एकाग्रताको कार्यको रूपमा वर्तमान) देखाउँदछ किनभने CV मापनहरूमा पृष्ठभूमि क्यापेसिटिव धाराहरूले फराडेइक धाराहरू लुकाउँछन् 26। डेटा बक्सप्लटमा प्रत्येक बक्सको लागि 5 इलेक्ट्रोडहरूबाट मापनहरू समावेश छन्। सबै मापनहरूले इलेक्ट्रोड-देखि-इलेक्ट्रोड भिन्नताका कारण मापन त्रुटिहरूबाट बच्न इलेक्ट्रोडहरूको एउटै सेट प्रयोग गर्दछ। हामीले DNA को कम सांद्रताका लागि DPV र CV मापन शिखर प्रवाहहरूमा बढ्दो प्रवृत्ति देख्यौं। , लामो (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\\(117) ) खण्डको तुलनामा। यो हाम्रो अघिल्लो काममा रिपोर्ट गरिएको इलेक्ट्रोड शोषणको अपेक्षित प्रवृत्तिसँग अनुरूप छ। MB-DNA कम्प्लेक्सको अवशोषणले इलेक्ट्रोडमा चार्ज स्थानान्तरणलाई सहज बनाउँछ, जसले चुचुरो प्रवाहको वृद्धिमा योगदान पुर्‍याउँछ।अन्य अध्ययनहरूले MB-DNA अन्तरक्रियामा ओलिगोन्यूक्लियोटाइड साइज र अनुक्रमको प्रभाव देखाएको छ। 27,28,29,30। दुई एम्प्लिकनहरू (\(117\,\hbox {bp}\) र \(503\,\hbox {bp}\)) को साइटोसाइन (GC) सामग्री लगभग 50% थियो, यसले देखाउँछ कि अवलोकनको कारण फरक छ। एम्प्लिकन लम्बाइमा। यद्यपि, उच्च DNA सांद्रता (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), \(503\,\hbox {bp}) को लागि \) र \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) \(117\,\hbox {bp}\) का लागि), हामी दुई प्रवर्द्धनहरू अवलोकन गर्दछौं। दुबै DPV र CV मापनहरूमा सब्सको शिखर प्रवाहहरू घटाइन्छ। यो किनभने MB ले DNA को आधार जोडीहरू बीच संतृप्त र अन्तरसम्बन्धित गर्दछ, परिणामस्वरूप MB31,32 मा घटाउन मिल्ने समूहको रेडक्स गतिविधिको स्टेरिक अवरोध हुन्छ।
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV।
PCR मास्टर मिक्समा रहेको साल्टले MB र DNA बीचको इलेक्ट्रोस्टेटिक अन्तरक्रियामा हस्तक्षेप गर्छ, त्यसैले \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) \({50} \,{\) सँग थपेर। upmu \hbox {M}}\) MB जेल-शुद्ध उत्पादन MB-DNA अन्तरक्रियामा नुनको प्रभाव अध्ययन गर्न। चित्र 3 मा देखाइए अनुसार, हामीले उच्च DNA सांद्रता (\(>{2}\,{\) को लागि अवलोकन गर्यौं। hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (५०३\,\hbox {bp }\) र \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) का लागि \(117\,\hbox {bp} \)), DPV र CV मा नुन थप्दा मापनमा खासै असर परेन (प्रतिनिधि भोल्टामोग्रामको लागि पूरक जानकारीमा चित्र S2 हेर्नुहोस्)। कम DNA सांद्रता, नुन थप्दा संवेदनशीलता धेरै कम हुन्छ, जसको परिणाम DNA एकाग्रता संग वर्तमान मा कुनै महत्वपूर्ण परिवर्तन छैन। MB-DNA अन्तरक्रिया र अन्तरक्रिया मा नुन को समान नकारात्मक प्रभावहरु पहिले अन्य शोधकर्ताहरु द्वारा रिपोर्ट गरिएको छ33,34।\(\hbox { Mg}^{2+}\) क्यासनहरू DNA को नकारात्मक फास्फेट ब्याकबोनमा बाँध्छन्, जसले गर्दा MB र DNA बीचको इलेक्ट्रोस्ट्याटिक अन्तरक्रियामा बाधा पुर्‍याउँछ। उच्च DNA सांद्रतामा, redox-active MBs को स्टेरिक अवरोधले तल्लो शिखर प्रवाहमा परिणाम दिन्छ, त्यसैले इलेक्ट्रोस्टेटिक अन्तरक्रियाहरू सेन्सर प्रतिक्रियालाई महत्त्वपूर्ण रूपमा असर गर्दैन। मुख्य कुरा यो हो कि यो बायोसेन्सर उच्च DNA सांद्रता पत्ता लगाउन राम्रोसँग उपयुक्त छ (विरलै \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) वा उच्च), पूर्ण रूपमा - वातावरणीय पानी नमूनाहरूको स्वचालित प्रशोधनको लागि, जहाँ PCR उत्पादनहरूको जेल शुद्धिकरण सम्भव नहुन सक्छ।
तरंगदैर्ध्य दायरा ६००–७०० \(\hbox {nm}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB सँग जटिल DNA को विभिन्न सांद्रताहरूको लागि अवशोषण वक्र अन्तर्गत क्षेत्र: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) नुन सहित र बिना (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) नुन सहित र बिना (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\))।\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB नमूनाहरू DNA सँग सम्बन्धित DNA सांद्रताहरू छैनन्।
माथिको नतिजाहरू थप प्रमाणित गर्न, हामीले UV/Vis स्पेक्ट्रोफोटोमिटर (थर्मो साइन्टिफिक मल्टिस्कन GO) को प्रयोग गरेर अप्टिकल मापनहरू प्रदर्शन गर्यौं, नमूनाहरू \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) प्रत्येकका लागि प्रयोग गरियो। मापन। DNA एकाग्रता बढ्दै जाँदा अवशोषण हस्ताक्षर घट्छ, तरंग दैर्ध्य दायरा \(600\,\hbox {nm}\) देखि \(700\,\hbox {) को लागि अवशोषण वक्र अन्तर्गत क्षेत्रको प्रवृत्तिबाट देख्न सकिन्छ। nm}\) , चित्र ४ मा देखाइए अनुसार (अवशोषण स्पेक्ट्रम चित्र S3 मा पूरक जानकारीमा देखाइएको छ)। \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox) भन्दा कम DNA सांद्रता भएका नमूनाहरूको लागि। {l}}}\), त्यहाँ DNA- युक्त र MB-मात्र नमूनाहरू (\(503\,\hbox {bp}\) र \(117\,\hbox {bp}\ का लागि) मा कुनै महत्त्वपूर्ण भिन्नता थिएन। ) लम्बाइका टुक्राहरू), redox-active MB को स्टेरिक अवरोधको अनुपस्थितिलाई संकेत गर्दै। उच्च DNA सांद्रतामा, हामीले अवशोषक संकेतमा क्रमिक कमी देख्यौं र नुनको उपस्थितिमा अवशोषणमा कम कमी भएको देख्यौं। यी परिणामहरू आणविकलाई श्रेय दिइएको थियो। DNA हाइब्रिडहरूमा आधार स्ट्याकिङसँग अन्तरक्रिया र स्टेरिक अवरोध। हाम्रा नतिजाहरू MB-DNA इन्टरकलेसनको स्पेक्ट्रोस्कोपिक अध्ययनहरूमा साहित्यमा रिपोर्टहरूसँग मिल्दोजुल्दो छन् जसले हाइपोक्रोमेटिकतालाई कम ऊर्जा स्तरहरूसँग सम्बद्ध गर्दछ \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) 36, 37, 38 अन्तरिकरण तहहरूको कारणले इलेक्ट्रोनिक संक्रमण।
फेज Phi6 को Agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस: लम्बाइको PCR उत्पादनहरू \(117\,\hbox {bp}\) र \(503\,\hbox {bp}\) तालको पानीको नमूनाहरूबाट।M-DNA मार्कर;NTC-नो-टेम्प्लेट नियन्त्रण, सम्बन्धित एम्प्लिकनहरू भएको प्राइमरहरू;पीसी सकारात्मक नियन्त्रण;1, 2, 3-अनडिल्युटेड (1:1) स्पाइक लेकको पानीको नमूनाहरू ट्रिपलिकेटमा। एक ब्यान्ड \(\ लगभग 50\,\hbox {bp}\) मा अप्रयुक्त ओलिगोन्यूक्लियोटाइडहरूका कारण देखिने छ। hbox {bp}\) लेन।
हामीले सेन्सरको उपयोगिताको मूल्याङ्कन गर्‍यौं पवई तालको पानीका नमूनाहरू Phi6 फेजसँग स्पाइक गरिएको। फेज-स्पाइक गरिएको पानीका नमूनाहरूबाट पृथक गरिएको RNA सांद्रता १५.८–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), शुद्ध फेज सस्पेन्सनबाट पृथक हुँदा RNA लगभग 1 को रिकभरी दक्षताको साथ \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) अनुमान गरिएको थियो। %.RNA लाई cDNA मा उल्टो ट्रान्सक्राइब गरिएको थियो र PCR र qPCR को लागि टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। सेन्सरसँग परीक्षण गर्नु अघि उत्पादनको आकार agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (चित्र 5) द्वारा पुष्टि गरिएको थियो। यी नमूनाहरू जेल शुद्ध छैनन् र त्यसैले PCR का सबै घटकहरू समावेश छन्। साथै चासोको एम्प्लिकनहरू। qPCR (तालिका 1) को समयमा रेकर्ड गरिएको Ct मानहरू सम्बन्धित स्पिक गरिएको पानीको नमूनाहरूबाट पृथक गरिएको RNA को एकाग्रतासँग सहसंबद्ध देखाइएको थियो। Ct मानले फ्लोरोसेन्ट संकेतको लागि आवश्यक चक्रहरूको संख्या प्रकट गर्दछ। थ्रेसहोल्ड वा पृष्ठभूमि संकेत नाघ्नुहोस्। उच्च Ct मानहरूले कम टेम्प्लेट सांद्रतालाई संकेत गर्दछ र यसको विपरीत। NTC नमूनाहरूको Ct मानहरू अपेक्षा गरेजति उच्च थिए। \(\लगभग 3\) बीचको Ct मानहरूमा भिन्नता सकारात्मक नियन्त्रण र परीक्षण नमूनाले थप संकेत गर्दछ कि प्रत्येक परीक्षण नमूनामा सकारात्मक नियन्त्रणको तुलनामा लगभग 1% टेम्प्लेट छ। हामीले पहिले छलफल गरिसकेका छौं कि लामो एम्प्लिकनहरूले राम्रो संवेदनशीलता निम्त्याउँछ। विषम वातावरणीय नमूनाहरूबाट अलग गरिएको लामो टुक्राहरूको प्रवर्धन चुनौतीपूर्ण छ। कम भाइरल एकाग्रता र आरएनए गिरावट। यद्यपि, हाम्रो भाइरस संवर्धन र PCR प्रवर्द्धन प्रोटोकलको साथ, हामीले इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सिङको लागि \(503\,\hbox {bp}\) टुक्रालाई सफलतापूर्वक विस्तार गर्न सक्षम भयौं।
चित्र 6 ले \(503\,\hbox {bp}\) टुक्रा एम्प्लिकनको इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सर परिणामहरू देखाउँछ, दुबै टेम्प्लेट (1:1) को रूपमा undiluted cDNA र टेम्प्लेट (1:100) को रूपमा 100-fold diluted cDNA को PCR को रूपमा प्रयोग गरी। , NTC र PC को तुलनामा (प्रतिनिधि voltammograms को लागि पूरक जानकारी मा चित्र S4 हेर्नुहोस्)। चित्र 6 मा बक्सप्लट मा प्रत्येक बक्स मा 5 इलेक्ट्रोड मा तीन नमूनाहरु मापन समावेश गर्दछ। इलेक्ट्रोड को कारण त्रुटिहरु जोगिन सबै नमूनाहरु मापन गर्न उही इलेक्ट्रोड प्रयोग गरियो। -देखि-इलेक्ट्रोड भिन्नता।CV मापनको तुलनामा, DPV मापनहरूले परीक्षण र पीसी नमूनाहरू NTCs बाट छुट्याउनको लागि राम्रो रिजोल्युसन देखाउँदछ किनभने, पहिले उल्लेख गरिएझैं, फराडेइक धाराहरू पछिल्लामा पृष्ठभूमि क्यापेसिटिव धाराहरूको कारण लुकेका हुन्छन्। लामो एम्प्लिकनहरूको लागि, हामीले अवलोकन गर्यौं। नकारात्मक नियन्त्रण (NTC) को परिणामले सकारात्मक नियन्त्रणको तुलनामा उच्च CV र DPV शिखर करेन्टहरू प्राप्त गर्यो, जबकि सकारात्मक र undiluted परीक्षण नमूनाहरूले DPV शिखर करेन्टहरूको समान शिखर उचाइ देखायो। प्रत्येक undiluted को लागि मापन गरिएको औसत र मध्य मानहरू (1:1) ) परीक्षण नमूना र पीसी NTC नमूनाको लागि सेन्सर आउटपुटबाट स्पष्ट रूपमा समाधान गर्न सकिन्छ, जबकि 1:100 पातलो नमूनाको रिजोल्युसन कम स्पष्ट हुन्छ। cDNA को 100-गुणा कमजोरीको लागि, हामीले जेल इलेक्ट्रोफोरेसिसको समयमा कुनै पनि ब्यान्डहरू अवलोकन गरेनौं। (चित्र 5 मा देखाइएको लेनहरू छैनन्), र सम्बन्धित DPV र CV शिखर प्रवाहहरू NTC को लागि अपेक्षा गरिएको जस्तै थिए। \(117\,\hbox {bp}\) खण्डको परिणामहरू पूरक जानकारीमा देखाइएका छन्। नकारात्मक इलेक्ट्रोडमा नि:शुल्क एमबीको शोषण र सिंगल-स्ट्र्यान्डेड प्राइमर ओलिगोन्यूक्लियोटाइडसँग एमबीको अन्तरक्रियाको कारणले पीसीबी सेन्सरबाट इलेक्ट्रोकेमिकल प्रतिक्रियालाई नियन्त्रणले प्रेरित गर्‍यो। त्यसैले, प्रत्येक पटक नमूना परीक्षण गर्दा, नकारात्मक नियन्त्रण चलाउनु पर्छ र परीक्षण नमूनाको शिखर वर्तमान नकारात्मक नियन्त्रणद्वारा प्राप्त गरिएको चुचुरो वर्तमानको तुलनामा भिन्न (सापेक्ष) मापन प्राप्त गर्न 39,40 परीक्षण नमूनालाई सकारात्मक वा नकारात्मक रूपमा वर्गीकृत गर्न।
(a) DPV, र (b) तालको पानीको नमूनाहरूमा \(503\,\hbox {bp}\) टुक्राहरूको इलेक्ट्रोकेमिकल पत्ता लगाउनको लागि CV शिखर करेन्ट। परीक्षण नमूनाहरू ट्रिपलिकेटमा मापन गरियो र कुनै टेम्प्लेट नियन्त्रणहरू (NTC) र सकारात्मक नियन्त्रण (पीसी)।
हाम्रा खोजहरूले UV/Vis स्पेक्ट्रोफोटोमिटर प्रयोग गरेर अप्टिकल मापनद्वारा प्रमाणित सांद्रताहरू सहित, विभिन्न DNA हरूका लागि विभिन्न लम्बाइका एम्प्लिकनहरूका लागि इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सरहरूको कार्यसम्पादनलाई असर गर्ने विभिन्न संयन्त्रहरू चित्रण गर्दछ। हाम्रा अवलोकनहरूले अन्तरदृष्टिलाई अधोरेखित गर्दछ कि लामो DNA टुक्राहरू \(\ approx\) सम्म। \(500\,\hbox {bp}\) उच्च संवेदनशीलताको साथ पत्ता लगाउन सकिन्छ र नमूनामा नुनको उपस्थितिले संवेदनशीलता DNA एकाग्रतालाई असर गर्दैन जसले उच्च संवेदनशीलतालाई असर गर्छ (विरलै \({\hbox {ng}/{\upmu) \hbox {l}}}\) र माथि)। यसका अतिरिक्त, हामीले नुनको साथ र बिना थपिएको जेल-प्युरिफाइड एम्प्लिकनहरू, र DPV र CV मापनहरूमा तालको पानीको नमूनाहरू सहित विभिन्न प्रकारका नमूनाहरूको प्रभावको अनुसन्धान गर्यौं।हामीले अवलोकन गर्यौं कि DPV ले राम्रो रिजोल्युसन प्रदान गर्‍यो, किनकि पृष्ठभूमि क्यापेसिटिव वर्तमानले CV मापनलाई पनि असर गर्छ, यसलाई कम संवेदनशील बनाउँछ।
लामो टुक्राहरूको प्रवर्धन भाइरल जीनोमिक आरएनएको अखण्डतामा निर्भर गर्दछ। धेरै अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि वातावरणमा आरएनएको ह्रास र अलगावको समयमा विभाजित हुने सम्भावनाको कारणले लामो टुक्राहरूको प्रवर्धन सधैं प्रभावकारी हुँदैन 11,41,42,43,44 .हामीले देख्यौं कि PEG-आधारित भाइरस एकाग्रता विधि एल्युमिनियम हाइड्रोक्साइड-आधारित भाइरस एकाग्रता विधि भन्दा तालको पानीको नमूनाहरूमा फेज Phi-6 स्पाइक केन्द्रित गर्न बढी प्रभावकारी थियो। लामो DNA टुक्राहरू पत्ता लगाउने क्षमताले मल्टिप्लेक्स पीसीआरको आवश्यकतालाई पार गर्न प्रमाणित गर्‍यो। धेरै छोटो लम्बाइ टेम्प्लेटहरू विस्तार गर्न र क्रस-विशिष्टताको सम्भावना कम गर्न।
जैविक नमूनाहरू दुर्लभ छन्, त्यसैले परीक्षणको लागि न्यूनतम नमूनाहरू आवश्यक पर्ने बायोसेन्सर डिजाइन गर्न आवश्यक छ। यस अध्ययनमा प्रयोग गरिएको ENIG PCB इलेक्ट्रोडहरू मात्र आवश्यक छ \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) इलेक्ट्रोडको प्रभावकारी क्षेत्र कभर गर्न परीक्षणका लागि नमूनाहरू। थप रूपमा, अर्को नमूना वितरण गर्नु अघि उही इलेक्ट्रोड सफा गरेपछि पुन: प्रयोग गर्न सकिन्छ। एम्प्लीफाइड नमूनाहरूलाई मिथाइलिन नीलो बाहेक अन्य कुनै रसायनहरू थप्न आवश्यक पर्दैन, जुन सस्तो छ। र सामान्यतया प्रयोग हुने रसायन। प्रत्येक इलेक्ट्रोडको निर्माण गर्न लगभग $0.55 (वा INR 40) लागत भएको हुनाले, यो बायोसेन्सर अवस्थित पत्ता लगाउने प्रविधिहरूको लागत-प्रभावी विकल्प हुन सक्छ। तालिका 2 ले लामो समयसम्म साहित्यमा रिपोर्ट गरिएका अन्य सेन्सरहरूसँग यो कामको तुलना देखाउँछ। विषम नमूनाहरूमा DNA टुक्राहरू।
MB-आधारित इलेक्ट्रोकेमिकल पत्ता लगाउने प्रोटोकलहरू PCR को विशिष्टतामा भर पर्छन् भन्ने कुरालाई ध्यानमा राख्दै, यस विधिको एक प्रमुख सीमा फोहोर पानी र तालको पानी वा कम शुद्धता प्राइमरहरू प्रयोग गरी विषम नमूनाहरूमा गैर-विशिष्ट प्रवर्धनको सम्भावना हो। संवेदनशीलता सुधार गर्न। अपरिष्कृत ENIG PCB इलेक्ट्रोडहरू प्रयोग गरेर अशुद्ध PCR उत्पादनहरूको DNA पत्ता लगाउनको लागि इलेक्ट्रोकेमिकल पत्ता लगाउने विधिहरू, प्रयोग नगरिएका dNTPs र प्राइमरहरूद्वारा प्रस्तुत गरिएका त्रुटिहरूलाई अझ राम्ररी बुझ्न र प्रतिक्रिया अवस्था र परख प्रोटोकलहरू अनुकूलन गर्न आवश्यक छ। अतिरिक्त भौतिक रसायनिक मापदण्डहरू जस्तै pH, तापक्रम, र बायोलोजिकल। पानीको नमूनाको अक्सिजन माग (BOD) पनि मापनको शुद्धता सुधार गर्न मापन गर्न आवश्यक हुन सक्छ।
अन्तमा, हामी वातावरणीय (तालको पानी) नमूनाहरूमा भाइरस पत्ता लगाउन कम लागतको इलेक्ट्रोकेमिकल ENIG PCB सेन्सर प्रस्ताव गर्छौं। DNA सेन्सिङका लागि स्थिर ओलिगोन्यूक्लियोटाइड इलेक्ट्रोड वा अनुकूलन सब्सट्रेटहरू जस्तो नभई संवेदनशीलता कायम राख्न क्रायोजेनिक भण्डारण आवश्यक हुन्छ, 53,54 हाम्रो प्रविधिले अपरिवर्तित PCB प्रयोग गर्दछ। लामो शेल्फ लाइफ भएका इलेक्ट्रोडहरू र कुनै विशेष भण्डारण आवश्यकताहरू छैनन् र त्यसैले LMICs मा तैनाथ गरिएको स्वचालित नमूना प्रशोधनसँग मापन समाधानहरूको विकासको लागि उपयुक्त। बायोसेन्सरले लक्ष्य एम्प्लिकनहरूको द्रुत पत्ता लगाउन सस्तो DNA-इन्टरकेलेटिंग रेडक्स डाईज (MB) प्रयोग गर्दछ। गैर-विशिष्ट प्रवर्धन। वातावरणीय नमूनाहरूमा सामान्यले MBs को एकल र डबल-स्ट्र्यान्डेड ओलिगोन्युक्लियोटाइडहरूमा गैर-विशिष्ट बन्धनको कारणले यस सेन्सिङ विधिको विशिष्टतालाई कम गर्छ। त्यसैले, यस परीक्षणको विशिष्टता प्राइमरहरू र PCR प्रतिक्रिया अवस्थाहरूको अनुकूलनमा निर्भर गर्दछ। साथै, CV र परीक्षण गरिएका नमूनाहरूबाट प्राप्त DPV शिखर धाराहरूलाई प्रत्येक परीक्षणको लागि नकारात्मक नियन्त्रण (NTC) बाट प्राप्त प्रतिक्रियाहरूको सापेक्ष व्याख्या गरिनु पर्छ। यस कार्यमा प्रस्तुत इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सर डिजाइन र विधिहरू पूर्ण रूपमा स्वचालित र कम विकास गर्न अटोसम्पलरहरूसँग एकीकृत गर्न सकिन्छ। - लागत समाधान जसले नमूनाहरू सङ्कलन र विश्लेषण गर्न सक्छ र वायरलेस रूपमा परिणामहरू प्रयोगशालामा पठाउन सक्छ।
Cashdollar, J. & Wymer, L. पानीको नमूनाहरूबाट भाइरसहरूको प्रारम्भिक एकाग्रताका लागि विधिहरू: हालैका अध्ययनहरूको समीक्षा र मेटा-विश्लेषण।Application.microorganism.115, pp. 1-11 (2013)।
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL वाटरबोर्न भाइरसहरू: सुरक्षित पिउने पानीमा अवरोधहरू। PLoS रोगजनक।11, E1004867 (2015)।
श्रेष्ठ, S. et al. कम र मध्यम आय भएका देशहरूमा COVID-19 को लागत-प्रभावी ठूला स्तरको निगरानीका लागि फोहोर पानी महामारी विज्ञान: चुनौती र अवसरहरू। वाटर 13, 2897 (2021)।
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic एसिड इलेक्ट्रोकेमिस्ट्री.Chemical.Rev.११२, ३४२७–३४८१ (२०१२)।
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene नीलो सुनको सब्सट्रेटहरूमा स्थिर एकल- र डबल-स्ट्र्यान्डेड ओलिगोन्यूक्लियोटाइडहरूको इलेक्ट्रोकेमिकल भेदभावको रूपमा। विश्लेषक 126, 1756-1759 (2001)।
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion Intercalators for Electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long-range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004)।
Wong, EL र Gooding, JJ चार्ज ट्रान्सफर DNA मार्फत: एक चयनात्मक इलेक्ट्रोकेमिकल DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138-2144 (2006)।
Fang, TH et al. समवर्ती इलेक्ट्रोकेमिकल पत्ता लगाउने संग वास्तविक समय PCR माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण। जैविक सेन्सर। Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009)।
Win, BY et al. DNA सँग मिथाइलिन नीलोको अन्तरक्रियामा आधारित इलेक्ट्रोकेमिकल रियल-टाइम PCR प्रणालीको सिग्नलिङ मेकानिज्म अध्ययन र प्रदर्शन प्रमाणीकरण। विश्लेषक 136, 1573–1579 (2011)।
Ramirez-Chavria, RG et al. लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल एम्प्लीफिकेशन-आधारित इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सर फोहोर पानीको नमूनाहरूमा sars-cov-2 पत्ता लगाउनका लागि।Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022)।
कुमार, M. et al. PCB इलेक्ट्रोडको साथ SARS-CoV-2 amplicons को इलेक्ट्रोकेमिकल सेन्सिङ। सेन्सर सक्रिय छ।B Chemistry.343, 130169 (2021)।
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. फोहोर पानीको ठोस अंशमा SARS-CoV-2 RNA को कुशल पहिचान।763, 144587 (2021)।
Alygizakis, N. et al. फोहोर पानीमा SARS-CoV-2 पत्ता लगाउनका लागि विश्लेषणात्मक विधिहरू: प्रोटोकल र भविष्य परिप्रेक्ष्यहरू।TraC ट्रेन्डिङ anal.Chemical.134, 116125 (2020)।
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. सर्भाइभल अफ द एन्भलप्ड ब्याक्टेरियोफेज Phi6 (SARS-CoV-2 को लागि एक सरोगेट) काँचको सतहहरूमा जम्मा गरिएका वाष्पीकरण गरिएको लारका थोपाहरूमा।science.Rep।१०, १–१० (२०२०)।
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Environmental Persistence of a SARS-CoV-2 surrogate (Phi6) in free-living amoeba.J.पानी स्वास्थ्य २०, ८३ (२०२१)।
Mindich, L. डबल-स्ट्र्यान्ड RNA ब्याक्टेरियोफेजको तीन जीनोमिक टुक्राहरूको सटीक प्याकेजिङ\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev।६३, १४९–१६० (१९९९)।
Pirttimaa, MJ & Bamford, DH RNA फेज\(\varphi\)6 प्याकेजिङ क्षेत्रको माध्यमिक संरचना।RNA 6, 880–889 (2000)।
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - ब्याक्टेरियोफेजको प्रयोगशाला स्टकहरू तयार गर्नको लागि द्रुत र प्रभावकारी प्रोटोकल।PeerJ 4, e2261 (2016)।