Mauruuru koe mo te toro ki Nature.com.He iti te tautoko a te putanga tirotiro e whakamahia ana e koe mo CSS. Mo te wheako pai, ka tūtohu kia whakamahia e koe he kaitirotiro kua whakahoutia (whakawetohia ranei te aratau hototahi ki Internet Explorer).I tenei wa, ki te whakarite tautoko tonu, ka whakaatuhia e matou te waahi kaore he momo me te JavaScript.
Ko te hiranga o te aro turuki i nga tauira taiao kua tino maioha mai i te timatanga o te mate mate COVID-19, a kei te mahia etahi mahi tirotiro ma te whakamahi i te paerewa koura, ahakoa he utu nui nga tikanga a-qPCR. he otinga mo te aro turuki i nga tauira wai taiao i nga whenua iti-me waenga-moni. I roto i tenei mahi, ka whakaatuhia e matou te kitenga matū hiko o nga amplicons i puta mai i te Phi6 phage i wehea mai i nga tauira wai o roto o te roto (he whakakapi rongonui mo SARS-CoV-2), ma te whakamahi i te ENIG ki te whakaoti i nga hiko PCB kaore he whakarereketanga mata.sex.I tino tohuhia te whakautu hiko hiko mo nga wahanga DNA e rua rereke te roa (\({117}\,\hbox {bp}\) me \({503}\,\hbox {bp}\)), me te pānga o te tai i roto i te PCR matua hanumi i runga i te methylene puru (MB) -DNA taunekeneke.Ko o maatau hua e whakaatu ana ko te roa o nga kongakonga DNA e tino whakatau ana i te tairongo hiko me te whakaatu i roto i tenei mahi ko te kaha ki te kite i nga amplicons roa me te kore e purea te reera o nga hua PCR. He mea nui mo te ine i roto i nga waahi o nga tauira wai.He otinga tino aunoa mo te uta viral he tohu pai.
Ko te tuku huaketo na roto i te wai kua mohiotia he morearea hauora mo te iwi mai i nga tau 1940, me nga taunakitanga tuatahi mo te tuku i te wai o te mate polio me te mate hepatitis E1. Kua whakarōpūhia e te Whakahaere Hauora o te Ao (WHO) etahi momo tukumate viral e kawe ana i roto i te wai o te ahua hauora ki te teitei te hiranga2. Ko nga tikanga rapunga e whakawhirinaki ana ki nga tikanga qPCR-koura, he tino tairongo me te motuhake, engari e hiahia ana nga kaimahi mohio ki te whakamatautau i roto i te taiwhanga ma te whakamahi i nga taputapu utu nui.Heoi, i nga whenua iti me waenganui-moni (LMICs) he iti rawa nga rauemi, tangata Ko te whakamatautau tauira ka nui ake i runga i te tirotiro i te tauira wai taiao.Na reira, ko etahi atu tikanga utu iti e hiahiatia ana mo te pumau tonu, te tirotiro i nga waa o te wai me nga tauira wai para i roto i nga whenua iti-me waenga-moni hei whakatupato wawe mo nga pakarutanga mate ka puta ake. ma reira ka tiaki i a raatau i nga paanga ohaoha nui o te mate urutaa huaketo.Ka taea e nga kaikoiora hiko iti te utu mo nga waikawa karihi he otinga tino pai mo tenei matea kore e tutuki. Ko te nuinga o enei kaikoiora DNA e mahi ana na te mea ka kore e nekehia nga whenu DNA taapiri i runga i te hiko. te mata me te ranu i te mea he raupapa taurite kei roto i te tauira. Ka taea tenei te huri hei tohu ma nga momo tikanga hiko ma te whakamahi i nga takawaenga redox penei i te rino konupora/ferrocyanide. Ko te kikorangi puru (MB) tetahi o taua ngota ngota redox-active. kua korerotia ki te intercalate ki te DNA whenu-rua (dsDNA) i tua atu i tona herenga kore-motuhake ki te DNA5,6.Ko te ahua intercaling o MBs ki te hanga i te MB-DNA complexes he mea rongonui hei takawaenga redox i roto i te maha o nga DNA hiko. whirihoranga pūoko5,6,7,8,9.Ahakoa ko te whakawhitinga o te MB ki te DNA he mea kore motuhake, a ko te motuhake o tenei pukoro matū hiko e whakawhirinaki nui ana ki te ma o nga mea tuatahi e whakamahia ana mo te PCR, te whakakaha hauwaariki ranei, he pai mo te whakatinanatanga pono. -Waa-waa-hikohiko-ko te qPCR, ko te fluorescence isothermal amplification hei rereke ki te inenga kukū DNA 9 .I roto i tetahi o enei whakatinanatanga, ko Won et al.I whakarerekēhia te mata o nga hiko koura ki te 6-mercapto-1-hexanol (MCH) mo te wa-tūturu. te inenga o nga amplicons PCR me te MB ma te whakamahi i te rereketanga o te hiko hiko (DPV)9.I etahi atu keehi, Ramirez et al.Te kitenga o te SARS-CoV-2 i roto i te wai para ma te RT-LAMP tauhohenga ma te whakamahi i te MB me nga irahiko kua taia-mata.Kua hoki nga electrodes Platinum whakamahia rite in situ electrodes i roto i te microfluidic PCR tüäpapa hangaia ki te electrochemically kitea amplicons i roto i tauhohenga 8 .Ko enei rangahau katoa e hiahia ana ki te whakarereke i te mata o nga hiko, e tohu ana i te piki haere o te hanga me nga utu whakahaere na nga whakaritenga rokiroki motuhake mo te pumau o enei electrodes mahi.
Te whakatakotoranga o te rerengamahi mo te rapunga hiko o nga amplicons i puta mai i nga matūriki viral kukū i roto i nga tauira wai roto.
I whakaatu tata nei matou i nga tohu hiko o nga amplicons SARS-CoV-2 me nga hiko o te papa taiawhio (PCB) iti te utu e pa ana ki te DPV me te voltammetry patakataka (CV) i whakaawehia e te whakaurunga o te MB-DNA complexes ki runga i te mata o nga electrodes kaore i whakarereketia) nga huringa i te tihi. o naianei11.E kii ana matou ko nga waahanga DNA roa ake (N1-N2, \({943}\, \hbox) i hangaia ma te whakamahi i nga tohu tuatahi o mua me te N2 whakamuri e taunakihia ana e te CDC i whakaritea ki nga waahanga poto ake {bp}\)) i whakaatu pai ake te raupapatanga i roto i te whakautu puoro. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) i hangaia ma te whakamahi i nga huinga tuatahi N1 whakamua me te N1 whakamuri. Ka whakaatuhia enei rangahau ma te whakamahi i nga waimeha DNA kua rite ki te wai kore karihi. -2 amplicons i roto i nga tauira wai para kua whakatairitehia (i riro ma te spiking tapeke tauira RNA ki te SARS-CoV-2 RNA). I te mea he ngawari te RNA ki te kutikuti i te wa e wehea ana me te tukatuka whakararo, 12,13 he uaua ki te whakanui i nga maramara roa me tenei tauira rereke. No reira, ko te whakaaturanga o te maataki hiko o te amplicon SARS-CoV-2 i roto i te wai para, he iti noa iho ki te kongakonga \(72\,\hbox {bp}\) N1 poto ake.
I roto i tenei mahi, i tirotirohia e matou te whaihuatanga o te ENIG PCB-a-te-a-roto i te hiko hiko o te phage Phi6 kua kukū me te wehe mai i nga tauira wai roto (Fig. 1). He rite te rahi o nga Phi6 (80-100 nm) ki te SARS-CoV-2 me he membrane lipid me te pūmua koikoi.Mo enei take, ko te bacteriophage Phi6 he whakakapi rongonui mo te SARS-CoV-2 me etahi atu huaketo RNA pathogenic kua kopaki14,15. Ko te RNA kua wehea mai i nga matūriki phage i whakamahia hei tauira mo te whakahiato cDNA whai muri mai. PCR ki te whiwhi i nga wahanga DNA e rua o te 117 me te 503 takirua turanga takirua te roa. I runga i te wero ki te whakakaha \(943\,\hbox {bp}\) nga kongakonga N1-N2 i roto i ta maatau mahi o mua, ka arohia e matou nga waahanga roa waenga (\(117 \,\hbox {bp}\) me \(503 \,\hbox {bp}\)), i runga i nga waahanga tuatahi e waatea ana. Ko te urupare hiko hiko i ako nahanaha i runga i te whanui whanui (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) ki \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Mo nga wahanga e rua i roto Ko te aroaro o MB, ko te paanga o te tote ki runga i te urupare o te puoro kua tohuhia, kua whakamanahia e nga inenga spectrophotometric.Ko nga takoha matua o tenei mahi e whai ake nei:
Ko te roa o te mahanga DNA me te noho o te tote i roto i te tauira ka tino pa ki te tairongo.Ko o maatau hua e whakaatu ana ko te mahi hiko i runga i nga tikanga rereke o te taunekeneke o te MB, te DNA, me te puoro i roto i te whakautu voltammetric, i runga i te kukū me te roa o te DNA, me te roa atu Ko nga whatiwhati e whakaatu ana i te kaha ake o te aro, ahakoa he kino te tote ki nga taunekeneke hiko i waenga MB me te DNA.
Ko te kukū DNA ka whakatau i te tikanga o te tauwhitinga MB-DNA i roto i nga hikohiko kaore ano kia whakarereketia Ka whakaatuhia e matou ko nga momo rereke o te taunekeneke MB-DNA e whakawhirinaki ana ki te kukū DNA. {l}}}\), i kite matou ko te whakautu hiko hiko i te nuinga o te waa i whakatauhia e te whakaurunga o te MB-DNA i runga i te hiko, i te iti o nga kukū I nga kohinga DNA teitei, ko te whakautu hiko hiko i whakatauhia e te aukati steric o te redox. mahi na te whakauru MB i waenga i nga takirua turanga DNA.
ENIG PCB-Based Electrochemical Sensing of Viral Nucleic Acids in Lake Water Samples I whakamanahia nga tirohanga ma te kimi hiko o Phi6-added \(503\,\hbox {bp}\) nga kongakonga DNA i whiwhi mai i nga tauira wai mai i te Roto o Powai, IIT Mumbai Campus Hua phage.
He iti te utu mo te whakatinanatanga me te kaha ki te whakauru ki nga punaha aroturuki aunoa, oligonucleotides, aptamers ranei i runga i nga hiko me te roa o te ora.
Ko Phage Phi6 he huaketo dsRNA kua kapi o te whanau Cytoviridae e pangia ana te Pseudomonas syringae.Ko te momo o Phi6 phage kei te ahua o nga wahanga e 3: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07) \,\hbox {Kb}\)) me L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\)) 16,17. Na te mea ka pangia e te Phi6 phage tetahi riaka BSL-1 Pseudomonas kore-pathogenic, he pai te whakamahi. a ka taea te whakatipu ngawari i roto i te taiwhanga.I hokona mai a Phage Phi6 me tana kaihautu Pseudomonas syringae mai i te Felix d'Herelle Reference Center for Bacterial Viruses, Laval University, Canada (he HER-102 me HER-1102 nga nama o te pokapū tohutoro) .Phi6 phage me tona ope i ora ake i runga i te whakahau a te pokapū tohutoro.Phage Phi6 i purea e te pereti lysis me te elution ki te whiwhi tohu whakamutunga ki te \(\ about 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (Waeine hanga tohu/ mireira). I wehea te RNA mai i nga matūriki phage kua purea ma te whakamahi i te GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) i runga i nga tohutohu a te kaihanga. 100}\, {{\upmu \hbox {l}}}\) ka utaina te lysate ki runga i te pou miro kia taea ai te here a RNA ki te pou kapia .Katahi ka whakahekehia te RNA ki roto i te otinga elution \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) i whakaratohia e te kete.Whakatauhia te kukū o te RNA na roto i te whakaurunga i \(260\,\hbox {nm}\).I rongoatia te RNA ki nga aliquots i \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) tae noa ki te whakamahi ano.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Ko te iScript cDNA Synthesis Kit (Bio -Rad Laboratories) i whakamahia hei tauira mo te whakahiato cDNA e whai ana i nga tohutohu a te kaihanga. He poto nei, e toru nga waahanga o te tauhohenga cDNA whakahiato: priming at \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , whakamuri te tuhi o \({20}\,{\hbox {min}}\) i \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), ka whakamuri Kei te \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) mo \({1}\,{\hbox {min }}\).I te wa e whakahaerehia ana i runga i te 1% agarose gel, ka whakaatuhia e te cDNA nga roopu e toru e rite ana ki nga wahanga RNA e toru e tumanakohia ana (kaore nga raraunga i whakaatuhia). te whakamahi i te cDNA hei tauira mo te PCR i roto i te miihini waiariki miniPCR® mini8:
Ko nga tohu tuatahi mo te \(117\,\hbox {bp}\) me te \(503\,\hbox {bp}\) e hāngai ana ki te 1476-1575 nucleotides o te wahanga M me te 458-943 nucleotides o te wahanga L, ia waikawa. .Ko nga hua PCR kua whakanuia katoa he mea hiko ki runga i te 1% nga karaehe agarose, a, ka purea te DNA whaainga ma te whakamahi i te GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
I whakamahia he roto i te puni IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) ki te taapiri i nga matūriki phage. I tātarihia te wai o te roto i roto i te kiripi \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) hei tango matūriki iri, katahi ka taapirihia te Phi6 phage. Tāpirihia \({1}\,{\hbox {ml}}\) o \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) ki te \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) te wai roto kua tātarihia, i roto i te \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). kua rahuitia mo te inenga uta viral ma te whakamatautau tohu. I whakamatauria e matou nga tikanga rereke e rua ki te whakakoi i nga matūriki huaketo Phi6 kua pupuhi: (1) te tikanga konumohe hydroxide adsorption-precipitation, 19 kua whakamanahia mo te kukū o te maha o nga huaketo RNA kapi mai i nga tauira taiao, me (2) ) Ko te tikanga kukū huaketo e pa ana ki te polyethylene glycol (PEG) i urutau mai i te Flood et al.20 .I te mea i kitea he pai ake te pai o te whakaora o te tikanga PEG i te tikanga konumohe hydroxide, i whakamahia te tikanga PEG ki te aro ki nga matūriki Phi6 mai i nga tauira wai o te roto.
Ko te tikanga PEG i whakamahia e whai ake nei: Ko te PEG 8000 me te \(\hbox {NaCl}\) i tapirihia ki nga tauira wai roto Phi6-spiked kia whiwhi 8 % PEG 8000 me \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).I whakakoromakihia nga tauira ki runga i te wiri\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), katahi ka centrifuged ki \(4700 \,\hbox {g}\) ko \({45}\,{\hbox {min}}\).Tukuhia te supernatant ka whakatārewahia te pire ki \({1}\, {\hbox {ml}}\) i roto i te tino nui.Katoa nga whakamatautau kukū me te kukū huaketo i mahia i roto i te takitoru. I muri i te kukū, ka rahuitia he aliquot iti mo te inenga o te kaha whakaora ma te tohu tohu. i roto i te ket-whakawhiwhia elution buffer\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).Na te mea ka rereke te kuhanga RNA mai i tetahi tauira ki tetahi tauira i roto i te taarua, ko te \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) o te RNA e whakamahia ana mo nga mea e toru ahakoa te kukū o te whakahiato cDNA o nga tauira.I mahia te whakahiatotanga cDNA pera i te whakaahuatanga o mua.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA i whakamahia hei tauira mo \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR mo nga huringa 35 hei whakanui i te \ (117\,\hbox {bp}\) me te \(503\,\hbox { bp}\) kongakonga. Ko enei tauira e tohuhia ana hei “1:1″, ara kaore he waimehatanga. I whakaritea he mana kore-tauira (NTC) hei mana kino, i te wa i whakaritea he cDNA i whakahiatotia ma te RNA kua wehea mai i te phage purea. hei tauira mo te mana pai (PC).I mahia te PCR ine (qPCR) i roto i te taputapu Stratagene Mx3000P RT-PCR ma te whakamahi i te Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies).I whakaritea nga tauhohenga kia toru-toru penei i mua. i whakaahuatia.Ko te paepae hurihanga (Ct) i tuhia mo nga tauira katoa.I tua atu, ko nga tauira kua diluted ko \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) ma te whakamahi cDNA diluted 1:100 i roto i te wai roto kua tātarihia hei \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR mo nga huringa 35. Ko enei tauira ka tohuhia hei "1:100″.
Ko nga hiko o te PCB ka hangaia ma te whakamahi i te utu iti e waatea ana i te maakete Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) tukanga me te kore e hiahia mo etahi atu whakakikorua koura. Ko nga korero hiko ENIG PCB kei roto i a maatau mahi o mua11.Mo nga hiko ENIG PCB, nga tikanga horoi hiko hiko penei i te Ko te wairewa piranha me te waikawa pungatara cyclic voltammetry kaore i te tūtohutia na te mea ka tihorea te paparanga koura angiangi (te matotoru \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) ka kitea nga papa parahi o raro e ngawari ana. ki te waikura 21, 22, 23, 24, 25. No reira, horoia nga hiko ki te kakahu kore-raru kua makuku ki te IPA. Ko te tauira hei whakamatautau i whakakororia ki te \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB i roto i te \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) mo te whakaurunga ngawari.I a maatau mahi o mua , i kite matou i pai ake te tairongo me te ahorangi o te pukoro na te whakanui ake i te kukū MB 11 .I runga i nga arotautanga i ripoatahia i a maatau mahi o mua, i whakamahia e matou \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB nga kukū ki te whakauru i te DNA ki roto i tenei rangahau.Ka taea te kimi hiko o te DNA paerua-rua (ds-DNA) ma te whakamahi i nga kaiwawao anionic, cationic ranei. i tetahi atu ringa, ko nga kaiwawao cationic penei i te MB me poto ake nga wa incubation, tata ki te \({1}\,{\hbox {h}}\) mo te rapunga hiko o ds-DNA6. Ko ia inenga ko te tuku i te tauira hei whakamatautau i runga i te electrode\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), katahi ka horoi ki te tawhetawhe makuku IPA, i mua i te haere ki tetahi atu tauira.kotahi inenga.I whakamatauria ia tauira i runga i nga hiko rereke e 5 ki te kore e kii.I mahia nga inenga DPV me te CV ma te whakamahi i te PalmSens Sensit Smart potentiostat, ka whakamahia te rorohiko PSTrace mo te whirihoranga potentiostat me te tango raraunga, tae atu ki nga tatauranga o naianei teitei.Ka whakamahia nga tautuhinga e whai ake nei mo nga inenga DPV me te CV:
DPV: Wā Taurite = \(8\,\hbox {s}\), Hipanga Ngaohiko = \(3\,\hbox {mV}\), Ngaohiko Pulse = \(25\,\hbox {mV}\) , te roanga o te pupuhi = \(50\,\hbox {ms}\), reiti matawai = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Wā Taurite = \(8\,\hbox {s}\), Hipanga Ngaohiko = \(3\,\hbox {mV}\), Reiti Sweep = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Ko nga au teitei i puta mai i nga voltammograms o te DNA kua matatini ki te \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
I whiwhihia te DPV me te CV voltammograms i runga i nga hiko ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB kua whakahiatotia ki te DNA (i te kuhanga o te 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) ie 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) mo \(117\,\hbox {bp}\ ) me 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) mo \(503\,\hbox {bp}\)).Ka whakaatuhia nga voltammograms mangai i te Whakaahua S1 i roto i nga korero taapiri. Ko te 2 e whakaatu ana i nga hua o nga inenga DPV me te CV (te tihi o naianei) ma te whakamahi i nga hua PCR kua purea-a-gel. Ka whakatauritea ki nga inenga CV, ko nga inenga DPV e whakaatu ana i te kaha ake o te aro (kei te waa hei mahi o te kukū DNA) na te mea ka huna e te au capacitive papamuri i roto i nga ine CV i nga awa Faradaic 26 .Ko nga raraunga mo ia pouaka kei roto i te pouaka pouaka he inenga mai i nga hiko e 5. Ko nga inenga katoa e whakamahi ana i nga huinga hiko hei karo i nga hapa ine na te rereketanga o te hiko-ki-hiko. , he roa ake (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ whakaritea ki \(117) ) fragment.He rite tenei ki te ahua e tumanakohia ana o te whakauru hiko hiko i korerotia i roto i ta maatau mahi o mua. Ko te whakaurunga o te MB-DNA matatini e whakahaere ana i te whakawhitinga utu i runga i te hiko, e whai hua ana ki te piki ake o te tihi o te waa.Ko etahi atu rangahau i whakaatu i te paanga o te rahi o te oligonucleotide me te raupapa i runga i te MB-DNA intercalation27,28,29,30.Ko te guanine -cytosine (GC) ihirangi o nga amplicons e rua (\(117\,\hbox {bp}\) me \(503\,\hbox {bp}\)) he tata ki te 50%, e tohu ana ko te tirohanga Ko te rereketanga ka tika ki te roa amplicon.Heoi, mo te teitei ake o nga kuhanga DNA (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), mo \(503\,\hbox {bp} \) me \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) mo \(117\,\hbox {bp}\)), ka kite matou i nga whakanuinga e rua Ko nga awa teitei o nga waahanga ka whakahekehia i roto i nga inenga DPV me te CV. Ko tenei na te mea ka whakakiia te MB me te whakawhiti i waenga i nga takirua turanga o te DNA, ka puta te aukati steric o te mahi redox o te roopu whakaheke i MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Ko nga tote kei roto i nga whakaranu PCR matua ka whakararu i nga tauwhitinga hiko i waenga i te MB me te DNA, na te taapiri i te \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) ki te \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB hua pure-pure hei ako i te paanga o te tote ki runga i te tauwhitinga MB-DNA. I whakaatuhia i te Whakaahua 3, i kite matou mo te teitei ake o te DNA (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) me \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) mo \(117\,\hbox {bp} \)), i roto i te DPV me te CV Ko te taapiri o te tote kaore i tino pa ki nga inenga (tirohia te Whakaahua S2 i roto i nga korero taapiri mo nga voltammograms kanohi). te iti iho o nga kohinga DNA, ko te taapiri o te tote ka tino whakaitihia te maarama, kaore he huringa nui i roto i te waa me te kukume DNA.Ko nga paanga kino kino o te tote i runga i nga taunekeneke MB-DNA me te whakawhitinga kua korerohia e etahi atu kairangahau33,34.\(\ hbox { Mg}^{2+}\) ka herea nga katote ki te tuara phosphate kino o te DNA, na reira ka arai i te pahekoheko hiko i waenga i te MB me te DNA. I te teitei ake o nga kuhanga DNA, ka hua te aukati i nga MBs redox-active ki te iti o te au o te tihi, na reira ko nga taunekeneke hiko. kaua e tino pa ki te whakautu o te puoro.Ko te kaupapa matua he pai ake tenei kaikoiora ki te kite i nga kohinga DNA teitei ake (he iti nei \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) teitei ake ranei), mo te katoa- Tukatuka aunoa o nga tauira wai taiao, i reira ka kore e taea te purenga reera o nga hua PCR.
Te horahanga i raro i te ānau absorption mo te awhe roangaru 600–700 \(\hbox {nm}\) mo nga momo kuhanga o te ADN kua matatini ki te \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) me te tote me te kore tote (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) me te tote me te kore tote (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Nga kuhanga DNA e rite ana ki nga tauira \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB No DNA.
Hei manatoko ake i nga hua o runga ake nei, i mahia e matou inenga whatu ma te whakamahi i te UV/Vis spectrophotometer (Thermo Scientific Multiskan GO), ko nga tauira \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) i whakamahia mo ia Inenga.Ka heke te waitohu absorption me te piki ake o te kukū DNA, ka kitea mai i te ia o te waahi i raro i te anau absorption mo te awhe roangaru \(600\,\hbox {nm}\) ki te \(700\,\hbox { nm}\) , e whakaatuhia ana i te Whakaahua 4 (te tuāwhiorangi absorption e whakaatuhia ana i te Fig. S3 i roto i nga korero taapiri). {l}}}\), karekau he rereketanga nui o te tango i waenga i nga tauira kei roto i te DNA me te MB-anake (mo te \(503\,\hbox {bp}\) me te \(117\,\hbox {bp}\ ) nga whatiwhatinga roa), e tohu ana i te kore o te aukati steric o te redox-active MB.I te teitei ake o nga kuhanga DNA, i kite matou i te heke haere o te tohu whakaurunga me te kite i te iti iho o te heke o te mimiti i te aroaro o te tote. Ko enei hua i tohuhia ki te molecular nga taunekeneke me te aukati i te waahi me te paparanga turanga i roto i nga ranu DNA. Ko o maatau hua e rite ana ki nga purongo i roto i nga tuhinga mo nga rangahau spectroscopic o te MB-DNA intercalation e hono ana te hypochromaticity me te heke o nga taumata kaha i roto i te \(\pi\)-\(\pi ^*\ ) nga whakawhitinga hiko na runga i te whakawhitiwhitinga Papa 36, 37, 38.
Agarose gel electrophoresis of phage Phi6: Hua PCR o te roa \(117\,\hbox {bp}\) me \(503\,\hbox {bp}\) mai i nga tauira wai roto.M-DNA tohu;NTC-kore-tauira mana whakahaere, primers kei roto amplicons hāngai;PC mana pai;1, 2, 3-kore-kore (1:1) nga tauira wai o roto i te riipene kia toru. Ka kitea tetahi roopu i \(\ mo te 50\,\hbox {bp}\) na te korenga o nga oligonucleotides i te \(503\,\) hbox {bp}\) ara.
I arotakehia e matou te whaipainga o te pukoro ma te whakamahi i nga tauira wai o te roto o Powai me te Phi6 phage. Ko nga kuhanga RNA i wehea mai i nga tauira wai phage-spiked mai i te 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), i te mea kua wehea mai i nga whakatārewatanga phage kua purea Ko te RNA i kiia ko \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) me te kaha whakaora tata ki te 1 %.I whakamurihia te RNA ki roto i te cDNA ka whakamahia hei tauira mo te PCR me te qPCR.I whakapumautia te rahi o te hua e te electrophoresis gel agarose (Whakaahua 5) i mua i te whakamatautau me te sensor.Kaore enei tauira i te purea gel na reira kei roto nga waahanga katoa o te PCR hei Ko nga uara Ct i tuhia i roto i te qPCR (Ripanga 1) i whakaatuhia ki te hono ki te kukū o te RNA kua wehea mai i nga tauira wai titaha. nui ake i te paepae, tohu papamuri ranei. Ko nga uara Ct teitei ake e tohu ana i nga kuhanga tauira iti me te rereke. Ko nga uara Ct o nga tauira NTC he rite te teitei o te mea i whakaarohia. Ko te mana pai me te tauira whakamatautau e tohu ana ko ia tauira whakamatautau he ahua 1% te tauira i whakaritea ki te mana pai. Kua korerohia e matou i mua ko nga amplicons roa atu ka pai ake te pai ake. o te iti o te kukū huaketo me te whakahekenga o te RNA.Heoi, na ta matou whakarangatira huaketo me te kawa whakakaha PCR, i taea e matou te whakakaha pai i te kongakonga \(503\,\hbox {bp}\) mo te rongo hiko.
Ko te Whakaahua 6 e whakaatu ana i nga hua o te puoko hiko o te mahanga amplicon \(503\,\hbox {bp}\), e whakamahi ana i te cDNA kore-kore hei tauira (1:1) me te 100-fold diluted cDNA hei tauira (1:100 ) i mahia PCR , ka whakaritea ki te NTC me te PC (tirohia te Whakaahua S4 i roto i nga korero taapiri mo nga voltammograms kanohi). Kei ia pouaka kei te pouaka pouaka i te Whakaahua 6 kei roto i nga inenga mai i nga tauira e toru i nga hikohiko 5. I whakamahia nga hikohiko rite ki te ine i nga tauira katoa hei karo i nga hapa na te hikohiko. -to-electrode variation.I whakaritea ki nga inenga CV, he pai ake te whakatau i nga inenga DPV ki te wehewehe i nga tauira whakamatautau me nga PC mai i nga NTC na te mea, pera i te korero i mua ake nei, kei te hunahia nga awa Faradaic na te mea kei te papamuri nga ohanga capacitive o muri. ko te mana toraro (NTC) i hua ake ai te teitei ake o te CV me te DPV peak au e pa ana ki te mana pai, engari ko nga tauira whakamatautau pai me te koretake i whakaatu i nga teitei teitei o te DPV peak au. ) Ko te tauira whakamatautau me te PC ka taea te whakatau marama mai i te whakaputanga puoro mo te tauira NTC, i te mea ko te whakatau mo te tauira 1:100 kua whakahekehia he iti ake te whakahua. (kaore nga huarahi e whakaatuhia ana i te Whakaahua 5), a ko nga waahanga DPV me te CV teitei e rite ana ki nga mea e tumanakohia ana mo NTC. Ko nga hua mo te waahanga \(117\,\hbox {bp}\) e whakaatuhia ana i roto i nga korero taapiri. na te mana whakahaere he urupare hiko mai i te pukoro PCB na te whakaurunga o te MB kore utu i runga i te hiko me te taunekeneke o te MB me te oligonucleotide oligonucleotide. te ia teitei o te tauira whakamatautau ka whakatauritea ki te teitei o te ia i riro mai i te mana toraro ki te whakatutuki i te inenga rereke (whangai)39,40 ki te whakarōpū i te tauira whakamatautau he pai, he kino ranei.
(a) DPV, me te (b) CV teitei o naianei mo te kimi hiko hiko o nga kongakonga \(503\,\hbox {bp}\) i roto i nga tauira wai roto. I inehia nga tauira whakamatautau ki te takitoru me te whakataurite ki te kore mana tauira (NTC) me nga mana pai (PC).
Ko o maatau kitenga e whakaatu ana i nga tikanga rereke e pa ana ki te mahi o nga puoro hiko mo nga amplicons o nga roa rereke mo nga DNA rereke, me nga kuhanga i whakamanahia e nga ine whatu ma te whakamahi i te spectrophotometer UV/Vis. Ko o matou kitenga e whakaatu ana i te maarama he roa ake nga waahanga DNA ki te \(\approx\) \(500\,\hbox {bp}\) ka taea te kite me te kaha ake o te tairongo, a ko te noho o te tote i roto i te tauira karekau i te sensitivity te kukū DNA e pa ana ki te tairongo teitei ake (he uaua \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) me runga ake).I tua atu, i tirotirohia e matou te paanga o nga momo tauira rereke, tae atu ki nga amplicons kua purea te ra me te kore tote taapiri, me te taapiri i nga tauira wai roto i roto i nga inenga DPV me te CV.I kite matou he pai ake te whakatau a DPV, na te mea ka pa ano te naianei capacitive papamuri ki te inenga CV, ka iti ake te tairongo.
Ko te whakakaha o nga kongakonga roa e whakawhirinaki ana ki te tika o te RNA genomic viral.He maha nga rangahau i whakaatu ko te whakakaha o nga kongakonga roa kaore i te pai i nga wa katoa na te kino o te RNA i roto i te taiao me te kaha mo te hono i te wa o te wehe11,41,42,43,44 .I kite matou he pai ake te tikanga kukū huaketo i runga i te PEG ki te whakakorikori i te phage Phi-6 i roto i nga tauira wai o roto i te tikanga kukū huaketo konumohe hydroxide-based.Ko te kaha ki te kite i nga kongakonga DNA roa i whakamatauhia ki te wikitoria i te whakaritenga mo te PCR maha. ki te whakanui i te maha o nga tauira roa poto me te whakaiti i te tupono o te whakawhiti-motuhake.
He iti noa nga tauira koiora, na reira me hoahoa he kaikoiora me iti nga tauira mo te whakamatautau. ) nga tauira mo te whakamatautau ki te kapi i te waahi whai hua o nga hiko. I tua atu, ka taea te whakamahi ano i te hiko kotahi i muri i te horoi i mua i te tuku i te tauira e whai ake nei. Ko nga tauira kua whakanuia kaore e hiahiatia te taapiri i etahi atu matū i tua atu i te puru methylene, he utu iti. me te matū e whakamahia nuitia ana.Na te mea he $0.55 (ranei INR 40) te utu mo ia hiko ki te hanga, ka taea e tenei kaikoiora he rereke te utu ki nga hangarau rapunga o naianei. Ko te Ripanga 2 e whakaatu ana i te whakataurite o tenei mahi me etahi atu pukoro kua korerotia i roto i nga tuhinga mo te roa. Ko nga wahanga DNA i roto i nga tauira rereke.
I te mea ko nga kawa rapu hiko i runga i te MB e whakawhirinaki ana ki te motuhake o te PCR, ko te herenga nui o tenei tikanga ko te kaha mo te whakakaha kore-motuhake i roto i nga tauira rereke penei i te wai para me te wai roto, te whakamahi ranei i nga mea parakore iti. tikanga kimi hiko mo te kimi DNA o nga hua PCR kaore i purea ma te whakamahi i nga hiko ENIG PCB kaore i whakarereketia, he mea tika kia pai ake te maarama ki nga hapa i whakauruhia mai e nga dNTP me nga primera kaore i whakamahia, me te arotau i nga tikanga tauhohenga me nga kawa whakamatautau.Tautuhinga matū ahupūngao penei i te pH, te pāmahana, me te koiora. Ko te tono hāora (BOD) o te tauira wai me ine ano kia pai ake ai te tika o te ine.
Hei mutunga, ka whakaarohia e matou he puoko hiko ENIG PCB iti-utu mo te kimi huaketo i roto i nga tauira taiao (wai roto). electrodes me te roa o te ora o te papa me te kore he whakaritenga rokiroki motuhake, na reira e tika ana mo te whakawhanaketanga o nga otinga ine me te tukatuka tauira aunoa kua tukuna ki roto i nga LMICs.Ka whakamahia e te biosensor nga tae redox DNA-intercalating inexpensive (MB) mo te kitenga tere o nga amplicons whaainga. he mea noa i roto i nga tauira taiao ka whakaiti i te motuhake o tenei tikanga mohio na te kore o te herenga o nga MBs ki te oligonucleotides kotahi me te taurua. me te DPV tihi teitei i puta mai i nga tauira kua whakamatauhia me whakamaori ki nga whakautu i puta mai i te mana kino (NTC) mo ia whakamatautau. -te otinga utu ka taea te kohikohi me te tātari tauira me te tuku ahokore nga hua ki te taiwhanga.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Tikanga mo te kukū tuatahi o nga wheori mai i nga tauira wai: he arotake me te tātari-meta o nga rangahau tata nei.J.Application.microorganism.115, wh.1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Nga wheori kawe i te wai: He aukati ki te wai inu haumaru.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Wastewater epidemiology mo te tirotiro nui-nui te utu mo te COVID-19 i roto i nga whenua iti me waenga-moni: nga wero me nga waahi.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene kahurangi hei kaiwhakawhanake hiko o nga oligonucleotides wea kotahi me te wea-rua kua kore e nekehia i runga i nga taputapu koura.Kaitaritari 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Whakatauritenga o te Cation me te Anion Intercalators mo te Whakawhitinga Hiko o te DNA Hybridization na te Whakawhiti Irahiko Roa-Range.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Te whakawhiti utu ma roto i te DNA: he DNA matū hiko whiriwhiri biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Te taputapu microfluidic PCR wa-tūturu me te kitenga hiko hiko.biological sensor.Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al.Te ako mo te mahi tohu me te manatoko mahi o te punaha PCR hiko hiko i runga i te pahekoheko o te puru methylene me te DNA.Atatari 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Korohanga-whakawaenga i te whakahiato-a-te-a-te-a-te-a-te-a-roto i te hiko hiko mo te kimi i te sars-cov-2 i roto i nga tauira wai para.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Te hihiko hiko o nga amplicons SARS-CoV-2 me nga hikohiko PCB.Ka whakahohehia te puoro.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Te kitenga pai o te SARS-CoV-2 RNA i roto i te hautanga totoka o te wai para.science.taiao whanui.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Nga Tikanga Analytical for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Te oranga o te bacteriophage Phi6 kua kopaki (he whakakapi mo SARS-CoV-2) i roto i nga topata huware kua whakaeto ka waiho ki runga i nga mata karaihe.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Te tohenga taiao o te whakakapinga SARS-CoV-2 (Phi6) i roto i te amoeba noho kore utu.J.Wai Hauora 20, 83 (2021).
Mindich, L. He takai tika o nga kongakonga ira e toru o te RNA bacteriophage taurua\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Hanganga tuarua o te DH RNA phage\(\varphi\)6 rohe kohinga.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – He kawa tere me te pai mo te whakarite rakau taiwhanga o bacteriophages.PeerJ 4, e2261 (2016).
Te wa tuku: Mei-27-2022