크리오바이알액체 질소로 채워진 듀어에 세포주와 기타 중요한 생물학적 물질을 극저온으로 보관하는 데 일반적으로 사용됩니다.

액체 질소에서 세포를 성공적으로 보존하는 데는 여러 단계가 필요합니다. 기본 원리는 완속 동결이지만, 정확한 기술은 세포 유형과 사용하는 동결 보호제에 따라 달라집니다. 이처럼 낮은 온도에서 세포를 보관할 때는 몇 가지 안전 고려 사항과 모범 사례를 고려해야 합니다.

이 글은 액체 질소에 크라이오바이알을 보관하는 방법에 대한 개요를 제공하는 것을 목표로 합니다.

크라이오바이알이란 무엇인가

크라이오바이알은 액체 샘플을 극저온에서 보관하도록 설계된 작고 뚜껑이 있는 바이알입니다. 동결보호제에 보관된 세포가 액체 질소와 직접 접촉하지 않도록 하여 세포 파괴 위험을 최소화하는 동시에 액체 질소의 극한 냉각 효과를 누릴 수 있습니다.

바이알은 일반적으로 다양한 용량과 디자인으로 제공되며, 내부 또는 외부 나사산이 있고 바닥은 평평하거나 둥글게 마감되어 있습니다. 멸균 및 비멸균 형태도 제공됩니다.

누가 사용합니까?키로비알액체 질소에 세포를 저장하는 방법

NHS와 민간 연구소, 그리고 탯줄혈액 은행, 상피세포생물학, 면역학, 줄기세포생물학을 전문으로 하는 연구기관에서는 세포를 냉동보관하기 위해 크라이오바이알을 사용합니다.

이런 방식으로 보존된 세포로는 B세포와 T세포, CHO 세포, 조혈줄기세포와 전구세포, 하이브리도마, 장세포, 대식세포, 중간엽줄기세포와 전구세포, 단핵구, 골수종, NK세포, 다능성줄기세포 등이 있습니다.

액체 질소에 극저온 바이알을 보관하는 방법 개요

냉동보존은 세포와 기타 생물학적 구조물을 매우 낮은 온도로 냉각하여 보존하는 과정입니다. 세포는 액체 질소에 수년간 보관하더라도 생존력을 잃지 않습니다. 다음은 냉동보존에 사용되는 절차의 개요입니다.

세포 준비

정확한 시료 준비 방법은 세포 유형에 따라 다르지만, 일반적으로 세포를 채취하여 원심분리하여 세포가 풍부한 펠릿을 만듭니다. 이 펠릿을 동결보호제 또는 동결보존 배지를 섞은 상층액에 재현탁합니다.

냉동보존 매체

이 배지는 세포 내외부 결정 형성을 억제하여 세포 사멸을 억제함으로써 세포를 저온 환경에서 보존하는 데 사용됩니다. 동결, 보관, 해동 과정 동안 세포와 조직에 안전하고 보호적인 환경을 제공하는 것이 이 배지의 역할입니다.

신선 동결 혈장(FFP), 헤파린 처리된 혈장용액 또는 혈청 및 동물성 성분이 없는 용액과 같은 매체는 디메틸 설폭사이드(DMSO) 또는 글리세롤과 같은 냉동 보호제와 혼합됩니다.

재액화된 샘플 펠릿은 다음과 같은 폴리프로필렌 크리오바이알에 분주됩니다.수저우 에이스 바이오메디컬 회사 극저온 보관 바이알.

크라이오바이알을 너무 많이 채우지 않는 것이 중요합니다. 너무 많이 채우면 균열 위험이 높아지고 내용물이 방출될 가능성이 있습니다(1).

제어된 동결 속도

일반적으로 세포의 성공적인 냉동보존을 위해서는 느리게 조절된 동결 속도가 사용됩니다.

샘플을 극저온 바이알에 분주한 후, 젖은 얼음이나 4°C 냉장고에 넣고 5분 이내에 동결 절차를 시작합니다. 일반적으로 세포는 분당 -1°C에서 -3°C의 속도로 냉각됩니다(2). 이는 프로그래밍 가능한 냉각기를 사용하거나 -70°C에서 -90°C의 속도 조절 냉동고에 있는 단열 상자에 바이알을 넣어 냉각합니다.

액체 질소로 전환

냉동된 극저온 바이알은 -135℃ 이하의 온도가 유지되는 한 무기한으로 액체 질소 탱크로 옮겨집니다.

이러한 초저온은 액체 또는 기체 상태의 질소에 담그면 얻을 수 있습니다.

액체 또는 기체상?

액상 질소에 보관하면 차가운 온도를 절대적인 일관성으로 유지할 수 있는 것으로 알려져 있지만, 다음과 같은 이유로 권장되지 않는 경우가 많습니다.

• 많은 양의 액체 질소가 필요하며, 이는 잠재적 위험입니다. 이로 인한 화상이나 질식은 실제적인 위험입니다.
• 아스페르길루스, B형 간염 및 액체질소 매체를 통한 바이러스 확산과 같은 감염원에 의한 교차 오염 사례가 문서화됨(2,3)
• 액체 질소가 바이알에 담그는 동안 누출될 가능성이 있습니다. 보관 상태에서 꺼내 실온으로 가열하면 질소가 빠르게 팽창합니다. 결과적으로, 액체 질소 보관 상태에서 바이알을 꺼낼 때 깨져 파편이 날아가거나 내용물에 노출될 위험이 있습니다(1, 4).

이러한 이유로 초저온 보관은 주로 기상 질소를 사용합니다. 시료를 액상으로 보관해야 하는 경우에는 특수 크라이오플렉스 튜빙을 사용해야 합니다.

기상의 단점은 수직 온도 구배가 발생하여 -135℃에서 -190℃ 사이의 온도 변동이 발생할 수 있다는 것입니다. 따라서 액체 질소 농도와 온도 변화에 대한 신중하고 세심한 모니터링이 필요합니다(5).

많은 제조사는 크리오바이알이 -135℃까지 보관하거나 증기 상태에서만 사용하기에 적합하다고 권장합니다.

냉동보관된 세포의 해동

냉동 배양액의 해동 과정은 스트레스를 유발하며, 세포의 최적 생존력, 회복력 및 기능을 보장하기 위해서는 적절한 취급 및 기술이 필요합니다. 정확한 해동 프로토콜은 특정 세포 유형에 따라 달라집니다. 그러나 다음과 같은 경우 빠른 해동이 표준으로 간주됩니다.

• 세포 회복에 미치는 영향을 줄입니다.
• 동결 매체에 존재하는 용질에 대한 노출 시간을 줄이는 데 도움이 됩니다.
• 얼음 재결정으로 인한 손상을 최소화합니다.

수조, 비드조 또는 특수 자동화 기구가 일반적으로 샘플을 해동하는 데 사용됩니다.

가장 흔한 방법은 1개의 세포주를 37℃ 수조에서 1~2분 동안 천천히 흔들어 녹이는 것입니다. 그 후, 바이알에 약간의 얼음만 남게 한 다음, 예열된 배지에서 세척합니다.

포유류 배아와 같은 일부 세포의 경우 생존을 위해서는 천천히 가열하는 것이 필수적입니다.

이제 세포는 세포 배양, 세포 분리 또는 조혈모세포의 경우 골수파괴 치료에 앞서 기증자 줄기세포의 무결성을 보장하기 위한 생존력 연구를 수행할 준비가 되었습니다.

배양액에 도말할 세포 농도를 측정하기 위해 세포 수를 세는 데 사용되는 세척된 시료를 소량 분취하는 것이 일반적입니다. 이를 통해 세포 분리 과정의 결과를 평가하고 세포 생존율을 확인할 수 있습니다.

크리오바이알 보관을 위한 모범 사례

냉동병에 보관된 샘플의 성공적인 냉동보존은 적절한 보관 및 기록 보관을 포함한 프로토콜의 많은 요소에 달려 있습니다.

• 저장 위치 간에 셀 분할– 용량이 허락한다면, 셀을 여러 바이알로 나누어 별도의 장소에 보관하면 장비 고장으로 인한 샘플 손실 위험을 줄일 수 있습니다.
• 교차 오염을 방지하세요– 후속 사용 전에 일회용 멸균 극저온 바이알 또는 오토클레이브를 선택하십시오.
• 세포에 적합한 크기의 바이알을 사용하세요– 바이알은 1~5ml 용량으로 판매됩니다. 바이알이 깨질 위험을 줄이려면 바이알에 너무 많이 채우지 마세요.
• 내부 또는 외부 나사산 극저온 바이알을 선택하세요– 일부 대학에서는 안전 조치를 위해 내부 나사산이 있는 바이알을 권장합니다. 이는 액체 질소에 채우거나 보관할 때 오염을 방지할 수도 있습니다.
• 누출 방지- 누출과 오염을 방지하기 위해 나사 캡이나 O-링에 이중 사출 씰을 사용합니다.
• 2D 바코드를 사용하고 바이알에 라벨을 붙이세요– 추적성을 보장하기 위해, 넓은 필기 영역이 있는 바이알을 사용하면 각 바이알에 적절한 라벨을 부착할 수 있습니다. 2D 바코드는 보관 관리 및 기록 보관에 도움이 될 수 있습니다. 색상으로 구분된 뚜껑은 식별을 용이하게 합니다.
• 적절한 보관 유지 관리- 세포가 손실되지 않도록 저장 용기는 온도와 액체 질소 농도를 지속적으로 모니터링해야 합니다. 사용자에게 오류를 알리기 위한 경보 장치를 설치해야 합니다.

안전 예방 조치

액체질소는 현대 연구에서 흔히 사용되는 방법이지만, 잘못 사용하면 심각한 부상을 입을 위험이 있습니다.

액체질소 취급 시 동상, 화상 및 기타 사고 위험을 최소화하기 위해 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다. 착용

• 극저온 장갑
• 실험실 코트
• 목까지 덮는 충격 방지 풀페이스 실드
• 닫힌 앞코 신발
• 방수 플라스틱 앞치마

액체질소 냉장고는 질식 위험을 최소화하기 위해 환기가 잘 되는 곳에 설치해야 합니다. 누출된 질소는 기화되어 대기 중 산소를 대체하기 때문입니다. 대량 보관 시에는 산소 부족 경보 시스템을 설치해야 합니다.

액체질소를 다룰 때는 2인 1조로 작업하는 것이 가장 좋으며, 정상 근무 시간 외에는 사용하는 것을 금지해야 합니다.

워크플로우를 지원하는 크라이오바이알

쑤저우 에이스 바이오메디컬(Suzhou Ace Biomedical)은 다양한 유형의 세포에 대한 동결보존 요구를 충족하는 광범위한 제품을 제공합니다. 다양한 튜브와 멸균 냉동바이알도 포트폴리오에 포함됩니다.

당사의 냉동바이알은 다음과 같습니다.

• 실험실용 나사형 캡 0.5mL 1.5mL 2.0mL 극저온 바이알 원뿔형 바닥 극저온 튜브(개스킷 포함)

  ● 0.5ml, 1.5ml, 2.0ml 규격, 스커트 포함 또는 미포함
  ● 원뿔형 또는 자립형 디자인, 멸균형 또는 비멸균형 모두 가능
  ● 나사 캡 튜브는 의료용 폴리프로필렌으로 제작되었습니다.
  ● PP 크라이오튜브 바이알은 반복적인 냉동 및 해동이 가능합니다.
  ●외부 캡 디자인으로 샘플 처리 중 오염 가능성을 줄일 수 있습니다.
  ● 스크류 캡 극저온 튜브 사용에 적합한 범용 나사산
  ● 튜브는 대부분의 일반 로터에 맞습니다.
  ● 극저온 튜브 O-링 튜브는 표준 1인치 및 2인치, 48웰, 81웰, 96웰 및 100웰 냉동고 상자에 맞습니다.
  ● 121°C까지 고압멸균이 가능하고 -86°C까지 냉동이 가능합니다.

  부품 번호	재료	용량	캡색상	PCS/가방	가방/케이스
  ACT05-BL-N	PP	0.5ml	검정, 노랑, 파랑, 빨강, 보라, 흰색	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5ml	검정, 노랑, 파랑, 빨강, 보라, 흰색	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5ml	검정, 노랑, 파랑, 빨강, 보라, 흰색	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0ml	검정, 노랑, 파랑, 빨강, 보라, 흰색	500	10