კრიოვიალებიხშირად გამოიყენება უჯრედული ხაზების და სხვა კრიტიკული ბიოლოგიური მასალების კრიოგენული შესანახად, თხევადი აზოტით სავსე დიუარის კონტეინერებში.

უჯრედების თხევად აზოტში წარმატებით შენახვას რამდენიმე ეტაპი აქვს. მიუხედავად იმისა, რომ ძირითადი პრინციპი ნელი გაყინვაა, გამოყენებული ზუსტი ტექნიკა დამოკიდებულია უჯრედის ტიპსა და გამოყენებულ კრიოპროტექტორზე. უჯრედების ასეთ დაბალ ტემპერატურაზე შენახვისას გასათვალისწინებელია რამდენიმე უსაფრთხოების საკითხი და საუკეთესო პრაქტიკა.

ამ პოსტის მიზანია მიმოიხილოს, თუ როგორ ინახება კრიოვიალები თხევად აზოტში.

რა არის კრიოვიალები

კრიოვიალები არის პატარა, თავსახურიანი ფლაკონები, რომლებიც შექმნილია თხევადი ნიმუშების უკიდურესად დაბალ ტემპერატურაზე შესანახად. ისინი უზრუნველყოფენ, რომ კრიოპროტექტორში შენახული უჯრედები პირდაპირ კონტაქტში არ შევიდეს თხევად აზოტთან, რაც ამცირებს უჯრედების დაზიანების რისკს და ამავდროულად სარგებლობს თხევადი აზოტის უკიდურესი გაგრილების ეფექტით.

ფლაკონები, როგორც წესი, სხვადასხვა მოცულობითა და დიზაინით არის ხელმისაწვდომი - მათ შეიძლება ჰქონდეთ შიგნიდან ან გარედან ხრახნიანი ბრტყელი ან მომრგვალებული ფსკერი. ასევე ხელმისაწვდომია სტერილური და არასტერილური ფორმატები.

ვინ იყენებსციროვიალებიუჯრედების შენახვა თხევად აზოტში

უჯრედების კრიოკონსერვაციისთვის კრიოვიალებს იყენებენ NHS-ის და კერძო ლაბორატორიების ფართო სპექტრი, ასევე კვლევითი ინსტიტუტები, რომლებიც სპეციალიზირებულნი არიან ჭიპლარის სისხლის ბანკში შენახვაში, ეპითელური უჯრედების ბიოლოგიაში, იმუნოლოგიასა და ღეროვანი უჯრედების ბიოლოგიაში.

ამ გზით შენახულ უჯრედებს შორისაა B და T უჯრედები, CHO უჯრედები, ჰემატოპოეტური ღეროვანი და წინამორბედი უჯრედები, ჰიბრიდომები, ნაწლავის უჯრედები, მაკროფაგები, მეზენქიმური ღეროვანი და წინამორბედი უჯრედები, მონოციტები, მიელომა, NK უჯრედები და პლურიპოტენტური ღეროვანი უჯრედები.

კრიოვიალების თხევად აზოტში შენახვის მიმოხილვა

კრიოკონსერვაცია არის პროცესი, რომელიც ინარჩუნებს უჯრედებს და სხვა ბიოლოგიურ კონსტრუქტებს მათი ძალიან დაბალ ტემპერატურაზე გაგრილების გზით. უჯრედების შენახვა თხევად აზოტში შესაძლებელია წლების განმავლობაში, უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობის დაკარგვის გარეშე. ეს არის გამოყენებული პროცედურების მოკლე აღწერა.

უჯრედების მომზადება

ნიმუშების მომზადების ზუსტი მეთოდი უჯრედის ტიპის მიხედვით განსხვავდება, მაგრამ ზოგადად, უჯრედები გროვდება და ცენტრიფუგირდება უჯრედებით მდიდარი ნალექის მისაღებად. შემდეგ ეს ნალექი ხელახლა სუსპენზირდება კრიოპროტექტორთან ან კრიოკონსერვაციის გარემოსთან შერეულ ზედაპირულ სითხეში.

კრიოკონსერვაციის საშუალება

ეს საშუალება გამოიყენება უჯრედების შესანარჩუნებლად დაბალტემპერატურულ გარემოში, რომელშიც ისინი მოხვდებიან, უჯრედშიდა და უჯრედგარე კრისტალების წარმოქმნის და შესაბამისად, უჯრედების სიკვდილის ინჰიბირებით. მათი როლი უჯრედებისა და ქსოვილებისთვის უსაფრთხო, დამცავი გარემოს უზრუნველყოფაა გაყინვის, შენახვისა და გალღობის პროცესების დროს.

ისეთი საშუალება, როგორიცაა ახლად გაყინული პლაზმა (FFP), ჰეპარინიზებული პლაზმალიტის ხსნარი ან შრატისგან თავისუფალი, ცხოველური კომპონენტებისგან თავისუფალი ხსნარები, ერევა კრიოპროტექტორებთან, როგორიცაა დიმეთილსულფოქსიდი (DMSO) ან გლიცეროლი.

ხელახლა გათხევადებული ნიმუშის ნალექი ალიკვოტირებულია პოლიპროპილენის კრიოვიალებში, როგორიცაასუჯოუ ეის ბიომედიცინური კომპანია კრიოგენული შესანახი ფლაკონები.

მნიშვნელოვანია, რომ კრიოვიალები არ გადაივსოს, რადგან ეს გაზრდის ბზარების გაჩენის და შიგთავსის შესაძლო გამოყოფის რისკს (1).

კონტროლირებადი გაყინვის სიჩქარე

ზოგადად, უჯრედების წარმატებული კრიოკონსერვაციისთვის გამოიყენება ნელი, კონტროლირებადი გაყინვის სიჩქარე.

კრიოგენულ ფლაკონებში ნიმუშების ალიკვოტირების შემდეგ, ისინი თავსდება სველ ყინულზე ან 4°C ტემპერატურაზე გაყინულ მაცივარში და გაყინვის პროცედურა იწყება 5 წუთის განმავლობაში. ზოგადი მითითების სახით, უჯრედები გაცივდება წუთში -1-დან -3-მდე სიჩქარით (2). ეს მიიღწევა პროგრამირებადი გამაგრილებლის გამოყენებით ან ფლაკონების იზოლირებულ ყუთში მოთავსებით, რომლებიც მოთავსებულია -70°C-დან -90°C-მდე კონტროლირებადი სიჩქარის საყინულეში.

თხევად აზოტზე გადატანა

გაყინული კრიოგენული ფლაკონები შემდეგ განუსაზღვრელი ვადით გადადის თხევადი აზოტის ავზში, იმ პირობით, რომ ტემპერატურა -135℃-ზე ნაკლები იქნება შენარჩუნებული.

ეს ულტრადაბალი ტემპერატურები შეიძლება მიღწეული იქნას თხევადი ან ორთქლის ფაზის აზოტში ჩაძირვით.

თხევადი თუ ორთქლის ფაზა?

ცნობილია, რომ აზოტის თხევად ფაზაში შენახვა უზრუნველყოფს ცივი ტემპერატურის აბსოლუტურ თანმიმდევრულობას, თუმცა ხშირად არ არის რეკომენდებული შემდეგი მიზეზების გამო:

• თხევადი აზოტის დიდი მოცულობის (სიღრმის) საჭიროება, რაც პოტენციურ საფრთხეს წარმოადგენს. ამის გამო დამწვრობა ან ასფიქსია რეალურ რისკს წარმოადგენს.
• დოკუმენტირებულია ინფექციური აგენტებით, როგორიცაა ასპერგილოზი, B ჰეპატიტი, ჯვარედინი დაბინძურების და თხევადი აზოტის საშუალებით ვირუსის გავრცელების შემთხვევები (2,3).
• ჩაძირვის დროს თხევადი აზოტის ფლაკონებში გაჟონვის პოტენციალი. საცავიდან ამოღების და ოთახის ტემპერატურამდე გაცხელებისას, აზოტი სწრაფად ფართოვდება. შესაბამისად, თხევადი აზოტის საცავიდან ამოღებისას ფლაკონი შეიძლება დაიმსხვრეს, რაც საფრთხეს უქმნის როგორც მფრინავ ნამსხვრევებს, ასევე შიგთავსთან კონტაქტს (1, 4).

ამ მიზეზების გამო, ულტრადაბალ ტემპერატურაზე შენახვა ყველაზე ხშირად ორთქლის ფაზაში აზოტში ხდება. როდესაც ნიმუშების შენახვა თხევად ფაზაში აუცილებელია, უნდა იქნას გამოყენებული სპეციალიზებული კრიოფლექსური მილები.

ორთქლის ფაზის უარყოფითი მხარე ის არის, რომ შეიძლება წარმოიშვას ვერტიკალური ტემპერატურის გრადიენტი, რაც ტემპერატურის რყევებს -135℃-დან -190℃-მდე დიაპაზონში გამოიწვევს. ეს მოითხოვს თხევადი აზოტის დონისა და ტემპერატურის ვარიაციების ფრთხილად და გულმოდგინე მონიტორინგს (5).

ბევრი მწარმოებელი გვირჩევს, რომ კრიოვიალები შესაფერისი იყოს -135℃-მდე შენახვისთვის ან მხოლოდ ორთქლის ფაზაში გამოსაყენებლად.

კრიოკონსერვირებული უჯრედების გალღობა

გალღობის პროცედურა გაყინული კულტურისთვის სტრესულია და უჯრედების ოპტიმალური სიცოცხლისუნარიანობის, აღდგენისა და ფუნქციონირების უზრუნველსაყოფად საჭიროა სათანადო დამუშავება და ტექნიკა. გალღობის ზუსტი პროტოკოლები დამოკიდებული იქნება უჯრედების კონკრეტულ ტიპებზე. თუმცა, სწრაფი გალღობა სტანდარტად ითვლება:

• უჯრედების აღდგენაზე ნებისმიერი ზემოქმედების შემცირება
• ხელს უწყობს გაყინვის საშუალებაში არსებული გახსნილი ნივთიერებების ზემოქმედების დროის შემცირებას
• ყინულის რეკრისტალიზაციის გზით ნებისმიერი დაზიანების მინიმუმამდე დაყვანა

ნიმუშების გალღობისთვის ხშირად გამოიყენება წყლის აბაზანები, მძივების აბაზანები ან სპეციალიზებული ავტომატური ინსტრუმენტები.

ყველაზე ხშირად, 1-2 წუთის განმავლობაში, 37°C ტემპერატურის წყლის აბაზანაში ფრთხილად მორევით, 1-2 წუთის განმავლობაში 1 უჯრედული ხაზი ლღობა, სანამ ფლაკონში ყინულის მცირე რაოდენობა არ დარჩება, სანამ წინასწარ გახურებულ ზრდის გარემოში არ გაირეცხება.

ზოგიერთი უჯრედისთვის, მაგალითად ძუძუმწოვრების ემბრიონებისთვის, ნელი დათბობა აუცილებელია მათი გადარჩენისთვის.

უჯრედები ახლა მზადაა უჯრედული კულტივირებისთვის, უჯრედების იზოლაციისთვის ან, ჰემატოპოეტური ღეროვანი უჯრედების შემთხვევაში, სიცოცხლისუნარიანობის კვლევებისთვის, რათა უზრუნველყოფილი იყოს დონორის ღეროვანი უჯრედების მთლიანობა მიელოაბლაციურ თერაპიამდე.

ნორმალური პრაქტიკაა უჯრედების დათვლისთვის გამოყენებული წინასწარ გარეცხილი ნიმუშის მცირე ალიკვოტების აღება, რათა დადგინდეს უჯრედების კონცენტრაცია კულტურაში დათესვისთვის. შემდეგ შეგიძლიათ შეაფასოთ უჯრედების იზოლაციის პროცედურების შედეგები და განსაზღვროთ უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობა.

კრიოვიალების შენახვის საუკეთესო პრაქტიკა

კრიოვიალებში შენახული ნიმუშების წარმატებული კრიოკონსერვაცია დამოკიდებულია პროტოკოლის მრავალ ელემენტზე, მათ შორის სათანადო შენახვასა და ჩანაწერების წარმოებაზე.

• უჯრედების გაყოფა შენახვის ადგილებს შორის– თუ მოცულობა საშუალებას იძლევა, გაყავით უჯრედები ფლაკონებს შორის და შეინახეთ ისინი ცალკე ადგილებში, რათა შემცირდეს აღჭურვილობის გაუმართაობის გამო ნიმუშის დაკარგვის რისკი.
• ჯვარედინი დაბინძურების თავიდან აცილება– შემდგომი გამოყენების წინ აირჩიეთ ერთჯერადი სტერილური კრიოგენული ფლაკონები ან ავტოკლავი
• გამოიყენეთ თქვენი უჯრედებისთვის შესაბამისი ზომის ფლაკონები– ფლაკონები 1-დან 5 მლ-მდე მოცულობით იყიდება. ბზარების გაჩენის რისკის შესამცირებლად მოერიდეთ ფლაკონების გადატვირთვას.
• აირჩიეთ შიდა ან გარე ხრახნიანი კრიოგენული ფლაკონები– ზოგიერთი უნივერსიტეტი უსაფრთხოების ზომების მიზნით რეკომენდაციას უწევს შიდა ხრახნიან ფლაკონებს - მათ ასევე შეუძლიათ დაბინძურების თავიდან აცილება შევსების დროს ან თხევად აზოტში შენახვისას.
• გაჟონვის თავიდან აცილება- გაჟონვისა და დაბინძურების თავიდან ასაცილებლად გამოიყენეთ ხრახნულ თავსახურში ან ო-რგოლებში ჩამოსხმული ორმაგი ინექციის მქონე დალუქვის საშუალებები.
• გამოიყენეთ 2D შტრიხკოდები და ეტიკეტირება გაუკეთეთ ფლაკონებს– მიკვლევადობის უზრუნველსაყოფად, დიდი საწერი არეების მქონე ფლაკონები საშუალებას იძლევა, თითოეული ფლაკონი სათანადოდ იყოს ეტიკეტირებული. 2D შტრიხკოდები ხელს უწყობს შენახვის მართვას და ჩანაწერების წარმოებას. ფერადი კოდირებული თავსახურები სასარგებლოა იდენტიფიკაციის გასაადვილებლად.
• სათანადო შენახვის მოვლა- უჯრედების დაკარგვის თავიდან ასაცილებლად, შესანახ ჭურჭლებში მუდმივად უნდა კონტროლდებოდეს ტემპერატურა და თხევადი აზოტის დონე. შეცდომების შესახებ მომხმარებლებისთვის უნდა დამონტაჟდეს სიგნალიზატორები.

უსაფრთხოების ზომები

თხევადი აზოტი თანამედროვე კვლევებში გავრცელებულ პრაქტიკად იქცა, თუმცა არასწორი გამოყენების შემთხვევაში სერიოზული დაზიანების რისკს შეიცავს.

თხევადი აზოტის გამოყენებისას მოყინვის, დამწვრობის და სხვა არასასურველი შემთხვევების რისკის შესამცირებლად, აუცილებელია შესაბამისი პირადი დამცავი აღჭურვილობის (PPE) ტარება.

• კრიოგენული ხელთათმანები
• ლაბორატორიული ხალათი
• დარტყმაგამძლე სრული სახის დამცავი ფარი, რომელიც ასევე ფარავს კისერს
• დახურული ცხვირიანი ფეხსაცმელი
• წყალგაუმტარი პლასტმასის წინსაფარი

თხევადი აზოტის შემცველი მაცივრები კარგად ვენტილირებად ადგილებში უნდა განთავსდეს, რათა მინიმუმამდე იქნას დაყვანილი ასფიქსიის რისკი - გამოყოფილი აზოტი ორთქლდება და ატმოსფერულ ჟანგბადს ჩაანაცვლებს. დიდი მოცულობის საწყობებს უნდა ჰქონდეთ ჟანგბადის დაბალი დონის სიგნალიზაციის სისტემები.

თხევადი აზოტის გამოყენებისას იდეალურია წყვილებში მუშაობა და მისი გამოყენება სამუშაო საათების მიღმა უნდა აიკრძალოს.

კრიოვიალები თქვენი სამუშაო პროცესის მხარდასაჭერად

კომპანია „სუჯოუ ეის ბიომედიცინი“ გთავაზობთ პროდუქციის ფართო არჩევანს, რომელიც აკმაყოფილებს თქვენს კრიოკონსერვაციის საჭიროებებს სხვადასხვა ტიპის უჯრედებისთვის. პორტფოლიო მოიცავს მილების ფართო არჩევანს, ასევე სტერილური კრიოვიალების ფართო არჩევანს.

ჩვენი კრიოვიალებია:

• ლაბორატორიული ხრახნიანი თავსახური 0.5 მლ 1.5 მლ 2.0 მლ კრიოვიალური კრიოგენული ფლაკონები კონუსური ფსკერის კრიოტუმბი შუასადებით

  ● 0.5 მლ, 1.5 მლ, 2.0 მლ სპეციფიკაცია, ქვედაბოლოთი ან ქვედაბოლოს გარეშე
  ● ხელმისაწვდომია როგორც კონუსური, ასევე თვითმდგომი დიზაინი, სტერილური და არასტერილური
  ● ხრახნიანი თავსახურიანი მილები დამზადებულია სამედიცინო დანიშნულების პოლიპროპილენისგან
  ● PP კრიოტუბის ფლაკონები შეიძლება განმეორებით გაიყინოს და გალღობოს
  ●გარე თავსახურის დიზაინს შეუძლია შეამციროს დაბინძურების ალბათობა ნიმუშის დამუშავების დროს.
  ● ხრახნიანი თავსახურიანი კრიოგენული მილები უნივერსალური ხრახნიანი ხრახნები გამოსაყენებლად
  ● მილები ერგება ყველაზე გავრცელებულ როტორებს
  ● კრიოგენული მილისებრი რგოლისებრი მილები ერგება სტანდარტულ 1 და 2 დიუმიან, 48, 81, 96 და 100 ღრმულიან საყინულე ყუთებს
  ● ავტოკლავირებადი 121°C-მდე და გაყინვადი -86°C-მდე

  ნაწილის ნომერი	მასალა	ხმა	კაპიტალიზაციაფერი	PCS/ჩანთა	ჩანთები/ქეისი
  ACT05-BL-N	PP	0.5 მლ	შავი, ყვითელი, ლურჯი, წითელი, იისფერი, თეთრი	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5 მლ	შავი, ყვითელი, ლურჯი, წითელი, იისფერი, თეთრი	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5 მლ	შავი, ყვითელი, ლურჯი, წითელი, იისფერი, თეთრი	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0 მლ	შავი, ყვითელი, ლურჯი, წითელი, იისფერი, თეთრი	500	10