クライオバイアル液体窒素を満たしたデュワー瓶に細胞株やその他の重要な生物学的材料を極低温で保存するためによく使用されます。

液体窒素中で細胞を保存するには、いくつかの段階があります。基本原理は緩やかな凍結ですが、具体的な方法は細胞の種類と使用する凍結保護剤によって異なります。このような低温で細胞を保存する際には、安全上の考慮事項とベストプラクティスがいくつかあります。

この投稿の目的は、クライオバイアルが液体窒素中でどのように保存されるかについて概要を説明することです。

クライオバイアルとは

クライオバイアルは、液体サンプルを極低温で保存するために設計された、キャップ付きの小型バイアルです。凍結保護剤で保存された細胞が液体窒素と直接接触しないようにすることで、細胞破壊のリスクを最小限に抑えながら、液体窒素の強力な冷却効果を享受できます。

バイアルは通常、様々な容量とデザインで提供されており、内ネジまたは外ネジ、平底または丸底があります。滅菌済みと非滅菌済みのものもご用意しています。

誰が使うのかシロバイアル液体窒素で細胞を保存する

さまざまなNHSおよび民間研究所、ならびに臍帯血バンキング、上皮細胞生物学、免疫学、幹細胞生物学を専門とする研究機関では、クライオバイアルを使用して細胞を凍結保存しています。

この方法で保存される細胞には、B 細胞と T 細胞、CHO 細胞、造血幹細胞と造血前駆細胞、ハイブリドーマ、腸細胞、マクロファージ、間葉系幹細胞と造血前駆細胞、単球、骨髄腫、NK 細胞、多能性幹細胞などがあります。

液体窒素中でクライオバイアルを保管する方法の概要

凍結保存とは、細胞やその他の生物学的構造物を極低温に冷却することで保存するプロセスです。細胞は液体窒素中で何年も保存することができ、細胞生存能は損なわれません。以下は、凍結保存の手順の概要です。

細胞の準備

サンプル調製の具体的な方法は細胞の種類によって異なりますが、一般的には細胞を採取し、遠心分離して細胞を多く含むペレットを形成します。このペレットを、凍結保護剤または凍結保存液と混合した上清液に再懸濁します。

凍結保存培地

この培地は、細胞がさらされる低温環境において、細胞内外の結晶形成を抑制し、ひいては細胞死を阻害することで、細胞を保存するために使用されます。その役割は、凍結、保存、解凍のプロセスにおいて、細胞と組織に安全で保護された環境を提供することです。

新鮮凍結血漿（FFP）、ヘパリン化プラズマライト溶液、血清や動物成分を含まない溶液などの培地を、ジメチルスルホキシド（DMSO）やグリセロールなどの凍結保護剤と混合します。

再液化されたサンプルペレットは、ポリプロピレン製のクライオバイアルに小分けされ、蘇州エースバイオメディカル社 低温保存バイアル.

クライオバイアルに詰め込みすぎると、割れるリスクが高まり、内容物が漏れ出す可能性があるため、クライオバイアルに詰め込みすぎないことが重要です (1)。

制御された凍結速度

一般的に、細胞の凍結保存を成功させるには、ゆっくりとした制御された凍結速度が採用されます。

サンプルをクライオジェニックバイアルに分注した後、湿潤氷上または4℃の冷蔵庫に置き、5分以内に凍結プロセスを開始します。一般的な目安として、細胞は1分あたり-1～-3℃の速度で冷却されます(2)。これは、プログラム可能な冷却装置を使用するか、バイアルを-70℃～-90℃の速度制御フリーザーに設置した断熱ボックスに収納することで実現できます。

液体窒素への移行

凍結した極低温バイアルは、-135℃未満の温度が維持される限り、無期限に液体窒素タンクに移されます。

これらの超低温は、液体または気相の窒素に浸すことによって得られます。

液体か気体か?

液相窒素での保管は、絶対的な一貫性を持って低温を維持することが知られていますが、次の理由から推奨されないことがよくあります。

• 液体窒素を大量に（深く）使用する必要があり、潜在的な危険性があります。これにより火傷や窒息の危険性が高まります。
• アスペルギルス、B型肝炎などの感染性病原体による交差汚染や、液体窒素培地を介したウイルス拡散の事例が記録されている（2,3）。
• 液体窒素が浸漬中にバイアル内に漏れる可能性。保管場所から取り出して室温に戻すと、窒素は急速に膨張します。その結果、液体窒素保管場所からバイアルを取り出す際に破損する可能性があり、飛散物と内容物への曝露の両方による危険が生じます（1, 4）。

これらの理由から、超低温保存は気相窒素で最も一般的に行われます。サンプルを液相で保存する必要がある場合は、専用のクライオフレックスチューブを使用する必要があります。

気相の欠点は、垂直方向の温度勾配が発生し、-135℃から-190℃の間で温度変動が生じる可能性があることです。そのため、液体窒素の液面と温度変化を注意深く監視する必要があります(5)。

多くのメーカーは、クライオバイアルは -135℃ までの保管、または気相での使用のみに適していると推奨しています。

凍結保存した細胞の解凍

凍結培養物にとって、解凍手順は大きな負担となるため、細胞の最適な生存率、回収率、機能性を確保するには適切な取り扱いと技術が必要です。具体的な解凍プロトコルは細胞の種類によって異なりますが、以下の場合には迅速な解凍が標準とされています。

• 細胞の回復への影響を軽減
• 凍結媒体中に存在する溶質への露出時間を短縮するのに役立ちます
• 氷の再結晶化による損傷を最小限に抑える

サンプルの解凍には、通常、ウォーターバス、ビーズバス、または専用の自動化機器が使用されます。

最も頻繁に行われるのは、1 つの細胞株を 1 ～ 2 分間ずつ 37℃ のウォーターバスで優しくかき混ぜて解凍し、バイアル内に氷がほんの少し残る程度にしてから、温めておいた増殖培地で洗浄することです。

哺乳類の胚などの一部の細胞にとっては、ゆっくりとした温まりが生存に不可欠です。

これで、細胞は細胞培養、細胞分離、あるいは造血幹細胞の場合には骨髄破壊療法の前にドナー幹細胞の完全性を保証するための生存能試験の準備が整いました。

細胞計数に使用する洗浄済みサンプルを少量ずつ採取し、培養時の細胞濃度を決定するのが一般的です。その後、細胞分離手順の結果を評価し、細胞生存率を判定することができます。

クライオバイアルの保管に関するベストプラクティス

クライオバイアルに保存されたサンプルの凍結保存が成功するかどうかは、適切な保管と記録の保持など、プロトコルの多くの要素に依存します。

• 保存場所間でセルを分割する– 容量が許せば、細胞をバイアルに分けて別々の場所に保管し、機器の故障によるサンプル損失のリスクを軽減します。
• 交差汚染を防ぐ– 使い捨ての滅菌済みクライオジェニックバイアルを選択するか、次回使用する前にオートクレーブ処理してください。
• 細胞に適したサイズのバイアルを使用してください– バイアルの容量は1～5mlです。破損のリスクを減らすため、バイアルに詰め込みすぎないようにしてください。
• 内ネジまたは外ネジのクライオジェニックバイアルを選択– 安全対策として、一部の大学では内ネジ付きバイアルを推奨しています。充填中や液体窒素での保管中に汚染を防ぐこともできます。
• 漏れを防ぐ- 漏れや汚染を防ぐために、スクリューキャップまたは O リングに成形された二重注入シールを使用します。
• 2Dバーコードを使用してバイアルにラベルを付ける– トレーサビリティを確保するため、大きな書き込みエリアを備えたバイアルを使用することで、各バイアルに適切なラベルを貼ることができます。2Dバーコードは保管管理と記録保管に役立ちます。色分けされたキャップは識別を容易にするのに役立ちます。
• 適切な保管管理- 細胞の損失を防ぐため、保存容器の温度と液体窒素のレベルを常に監視する必要があります。エラーが発生した場合は、ユーザーに警告するアラームを設置する必要があります。

安全上の注意

液体窒素は現代の研究では一般的に使用されていますが、誤って使用すると重傷を負うリスクがあります。

液体窒素を取り扱う際は、凍傷、火傷、その他の有害事象のリスクを最小限に抑えるため、適切な個人用保護具（PPE）を着用する必要があります。着用

• 極低温手袋
• 実験着
• 首まで覆う耐衝撃フルフェイスシールド
• つま先が覆われた靴
• 防滴プラスチックエプロン

液体窒素冷蔵庫は、窒息のリスクを最小限に抑えるため、換気の良い場所に設置する必要があります。漏れた窒素は気化し、大気中の酸素と置き換わるためです。大量貯蔵庫には、酸素濃度低下警報システムを設置する必要があります。

液体窒素を扱うときは2人1組で作業するのが理想的であり、通常の作業時間外での使用は禁止する必要があります。

ワークフローをサポートするクライオバイアル

蘇州エース・バイオメディカル社は、様々な種類の細胞の凍結保存ニーズに応える幅広い製品ラインナップを提供しています。製品ラインナップには、各種チューブと滅菌クライオバイアルが含まれます。

当社のクライオバイアルは以下のとおりです。

• ラボ用スクリューキャップ 0.5mL 1.5mL 2.0mL クライオバイアル クライオジェニックバイアル 円錐底クライオチューブ ガスケット付き

  ● 0.5ml、1.5ml、2.0ml仕様、スカート付きまたはスカートなし
  ● 円錐型または自立型デザイン、滅菌済みまたは非滅菌済みの両方をご用意しています
  ● スクリューキャップチューブは医療グレードのポリプロピレン製です
  ● PPクライオチューブバイアルは繰り返し凍結・解凍が可能です
  ●外部キャップ設計により、サンプル処理中の汚染の可能性を低減できます。
  ● スクリューキャップ極低温チューブユニバーサルねじ山
  ● チューブは最も一般的なローターに適合します
  ● 極低温チューブOリングチューブは、標準の1インチおよび2インチ、48ウェル、81ウェル、96ウェル、100ウェルのフリーザーボックスに適合します。
  ● 121℃までオートクレーブ可能、-86℃まで冷凍可能

  部品番号	材料	音量	キャップ色	PCS/バッグ	バッグ/ケース
  ACT05-BL-N	PP	0.5ML	黒、黄、青、赤、紫、白	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5ML	黒、黄、青、赤、紫、白	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5ML	黒、黄、青、赤、紫、白	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0ML	黒、黄、青、赤、紫、白	500	10