Crioprovettesono comunemente utilizzati per la conservazione criogenica di linee cellulari e altri materiali biologici critici, in contenitori Dewar riempiti di azoto liquido.

La corretta conservazione delle cellule in azoto liquido prevede diverse fasi. Sebbene il principio di base sia il congelamento lento, la tecnica esatta impiegata dipende dal tipo di cellula e dal crioprotettore utilizzato. Esistono diverse considerazioni di sicurezza e buone pratiche da tenere in considerazione quando si conservano le cellule a temperature così basse.

Questo articolo si propone di fornire una panoramica su come le crioprovette vengono conservate nell'azoto liquido.

Cosa sono le crioviali

Le criovie sono piccole fiale con tappo, progettate per conservare campioni liquidi a temperature estremamente basse. Garantiscono che le cellule conservate nel crioprotettore non entrino in contatto diretto con l'azoto liquido, riducendo al minimo il rischio di fratture cellulari e beneficiando comunque dell'effetto refrigerante estremo dell'azoto liquido.

Le fiale sono solitamente disponibili in una varietà di volumi e design: possono essere filettate internamente o esternamente, con fondo piatto o arrotondato. Sono disponibili anche in formati sterili e non sterili.

Chi usaCyrovialiper conservare le cellule in azoto liquido

Diversi laboratori del Servizio Sanitario Nazionale e privati, nonché istituti di ricerca specializzati nella conservazione del sangue del cordone ombelicale, biologia delle cellule epiteliali, immunologia e biologia delle cellule staminali utilizzano le crioprovette per crioconservare le cellule.

Le cellule conservate in questo modo includono cellule B e T, cellule CHO, cellule staminali emopoietiche e progenitrici, ibridomi, cellule intestinali, macrofagi, cellule staminali mesenchimali e progenitrici, monociti, mieloma, cellule NK e cellule staminali pluripotenti.

Panoramica su come conservare le crioprovette in azoto liquido

La crioconservazione è un processo che preserva cellule e altri costrutti biologici raffreddandoli a temperature molto basse. Le cellule possono essere conservate in azoto liquido per anni senza perdita di vitalità cellulare. Questa è una panoramica delle procedure impiegate.

Preparazione delle cellule

Il metodo esatto per la preparazione dei campioni varia a seconda del tipo di cellula, ma in generale, le cellule vengono raccolte e centrifugate per sviluppare un pellet ricco di cellule. Questo pellet viene quindi risospeso nel surnatante miscelato con un crioprotettore o un mezzo di crioconservazione.

Mezzo di crioconservazione

Questo mezzo viene utilizzato per preservare le cellule negli ambienti a bassa temperatura a cui saranno sottoposte, inibendo la formazione di cristalli intra ed extracellulari e quindi la morte cellulare. Il loro ruolo è quello di fornire un ambiente sicuro e protettivo per cellule e tessuti durante i processi di congelamento, conservazione e scongelamento.

Un terreno di coltura come il plasma fresco congelato (FFP), la soluzione di plasmalita eparinizzato o soluzioni prive di siero e componenti animali viene miscelato con crioprotettori quali dimetilsolfossido (DMSO) o glicerolo.

Il pellet campione ri-liquefatto viene suddiviso in aliquote in crioviali in polipropilene comeFiale per lo stoccaggio criogenico della società biomedica Suzhou Ace.

È importante non riempire eccessivamente le crioprovette poiché ciò aumenterà il rischio di crepe e il possibile rilascio del contenuto (1).

Velocità di congelamento controllata

In genere, per una crioconservazione efficace delle cellule si utilizza una velocità di congelamento lenta e controllata.

Dopo che i campioni sono stati suddivisi in aliquote in fiale criogeniche, queste vengono posizionate su ghiaccio umido o in un frigorifero a 4 °C e la procedura di congelamento viene avviata entro 5 minuti. In generale, le cellule vengono raffreddate a una velocità compresa tra -1 e -3 al minuto (2). Questo si ottiene utilizzando un refrigeratore programmabile o posizionando le fiale in una scatola isolante posta in un congelatore a temperatura controllata da -70 °C a -90 °C.

Trasferimento in azoto liquido

Le fiale criogeniche congelate vengono poi trasferite in un serbatoio di azoto liquido per periodi di tempo indefiniti, purché venga mantenuta una temperatura inferiore a -135°C.

Queste temperature ultra basse possono essere ottenute mediante immersione in azoto in fase liquida o vapore.

Fase liquida o vapore?

È noto che la conservazione in azoto in fase liquida mantiene la temperatura fredda con assoluta costanza, ma spesso non è consigliata per i seguenti motivi:

• La necessità di grandi volumi (profondità) di azoto liquido rappresenta un potenziale pericolo. Ustioni o asfissia dovute a questo rappresentano un rischio reale.
• Casi documentati di contaminazione incrociata da agenti infettivi come aspergillus, epatite B e diffusione virale tramite il mezzo di coltura con azoto liquido (2,3)
• La possibilità che l'azoto liquido fuoriesca dalle fiale durante l'immersione. Una volta rimosso dal contenitore e riscaldato a temperatura ambiente, l'azoto si espande rapidamente. Di conseguenza, la fiala potrebbe rompersi quando viene rimossa dal contenitore di azoto liquido, creando un rischio sia per la proiezione di detriti che per l'esposizione al contenuto (1, 4).

Per questi motivi, lo stoccaggio a bassissima temperatura avviene più comunemente in azoto in fase vapore. Quando i campioni devono essere conservati in fase liquida, è necessario utilizzare tubi crioflex specifici.

Lo svantaggio della fase vapore è che può verificarsi un gradiente di temperatura verticale, con conseguenti fluttuazioni di temperatura tra -135 °C e -190 °C. Ciò richiede un monitoraggio attento e diligente dei livelli di azoto liquido e delle variazioni di temperatura (5).

Molti produttori consigliano che le crioprovette siano adatte alla conservazione fino a -135°C o all'uso esclusivamente in fase di vapore.

Scongelamento delle cellule crioconservate

La procedura di scongelamento è stressante per una coltura congelata e richiede una manipolazione e una tecnica adeguate per garantire vitalità, recupero e funzionalità ottimali delle cellule. I protocolli di scongelamento esatti dipenderanno dai tipi cellulari specifici. Tuttavia, lo scongelamento rapido è considerato standard per:

• Ridurre qualsiasi impatto sul recupero cellulare
• Aiuta a ridurre il tempo di esposizione ai soluti presenti nel mezzo di congelamento
• Ridurre al minimo i danni causati dalla ricristallizzazione del ghiaccio

Per scongelare i campioni si utilizzano comunemente bagni d'acqua, bagni a microsfere o strumenti automatizzati specializzati.

Nella maggior parte dei casi, si scongela una linea cellulare alla volta per 1-2 minuti, agitandola delicatamente in un bagno d'acqua a 37°C finché non rimane nemmeno un po' di ghiaccio nella fiala, prima di lavarla in un terreno di coltura preriscaldato.

Per alcune cellule, come gli embrioni dei mammiferi, il riscaldamento lento è essenziale per la loro sopravvivenza.

Le cellule sono ora pronte per la coltura cellulare, l'isolamento cellulare o, nel caso delle cellule staminali emopoietiche, per studi di vitalità per garantire l'integrità delle cellule staminali del donatore prima della terapia mieloablativa.

È prassi comune prelevare piccole aliquote del campione prelavato utilizzato per eseguire la conta cellulare e determinarne la concentrazione per la semina in coltura. È quindi possibile valutare i risultati delle procedure di isolamento cellulare e determinarne la vitalità.

Migliori pratiche per la conservazione delle crioprovette

Il successo della crioconservazione dei campioni conservati in crioprovette dipende da molti elementi del protocollo, tra cui la corretta conservazione e la tenuta dei registri.

• Dividi le celle tra le posizioni di archiviazione– Se i volumi lo consentono, suddividere le cellule tra le fiale e conservarle in luoghi separati per ridurre il rischio di perdita del campione dovuta a guasti dell’apparecchiatura.
• Prevenire la contaminazione incrociata– Optare per fiale criogeniche sterili monouso o autoclavare prima dell’uso successivo
• Utilizzare fiale di dimensioni appropriate per le vostre cellule– le fiale sono disponibili in volumi compresi tra 1 e 5 ml. Evitare di riempire eccessivamente le fiale per ridurre il rischio di rotture.
• Selezionare fiale criogeniche con filettatura interna o esterna– Alcune università raccomandano l’uso di fiale con filettatura interna come misura di sicurezza: possono anche prevenire la contaminazione durante il riempimento o durante la conservazione nell’azoto liquido.
• Prevenire le perdite- Utilizzare guarnizioni bi-iniettate stampate nel tappo a vite o negli O-ring per evitare perdite e contaminazione.
• Utilizzare codici a barre 2D ed etichettare le fiale– per garantire la tracciabilità, le fiale con ampie aree di scrittura consentono di etichettare adeguatamente ciascuna fiala. I codici a barre 2D possono facilitare la gestione dello stoccaggio e la tenuta dei registri. I tappi colorati sono utili per una più facile identificazione.
• Manutenzione adeguata dello stoccaggio- Per garantire che le cellule non vengano perse, i contenitori di stoccaggio devono monitorare costantemente la temperatura e i livelli di azoto liquido. Devono essere installati allarmi per avvisare gli utenti di eventuali errori.

Precauzioni di sicurezza

L'azoto liquido è diventato una pratica comune nella ricerca moderna, ma se utilizzato in modo improprio, comporta il rischio di gravi lesioni.

È necessario indossare adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) per ridurre al minimo il rischio di congelamento, ustioni e altri incidenti avversi durante la manipolazione di azoto liquido. Indossare

• Guanti criogenici
• Camice da laboratorio
• Visiera integrale resistente agli urti che copre anche il collo
• Scarpe chiuse
• grembiule di plastica anti-spruzzi

I frigoriferi ad azoto liquido devono essere collocati in aree ben ventilate per ridurre al minimo il rischio di asfissia: l'azoto fuoriuscito vaporizza e sostituisce l'ossigeno atmosferico. I magazzini di grandi dimensioni dovrebbero essere dotati di sistemi di allarme per bassi livelli di ossigeno.

Quando si maneggia azoto liquido, è ideale lavorare in coppia e il suo utilizzo al di fuori del normale orario di lavoro dovrebbe essere vietato.

Cryovials per supportare il tuo flusso di lavoro

L'azienda Suzhou Ace Biomedical offre un'ampia selezione di prodotti che soddisfano le vostre esigenze di crioconservazione per diversi tipi di cellule. Il portfolio comprende una gamma di provette e una gamma di criovial sterili.

Le nostre crioprovette sono:

• Fiale criogeniche Cryovial con tappo a vite da laboratorio da 0,5 ml, 1,5 ml e 2,0 ml, con fondo conico e guarnizione

  ● Specifiche da 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, con gonna o senza gonna
  ● Sono disponibili design conici o autoportanti, sterili o non sterili
  ● I tubi con tappo a vite sono realizzati in polipropilene di grado medico
  ● Le fiale PP Cryotube possono essere congelate e scongelate ripetutamente
  ●Il design del tappo esterno può ridurre la probabilità di contaminazione durante il trattamento del campione.
  ● Provette criogeniche con tappo a vite Filettature universali per l'uso
  ● I tubi si adattano alla maggior parte dei rotori comuni
  ● I tubi con o-ring per tubi criogenici si adattano a scatole per congelatori standard da 1 pollice e 2 pollici, 48 pozzetti, 81 pozzetti, 96 pozzetti e 100 pozzetti
  ● Autoclavabile fino a 121°C e congelabile fino a -86°C

  CODICE ARTICOLO	MATERIALE	VOLUME	CAPCOLORE	PCS/BORSA	BORSE/VALIGIE
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Nero, Giallo, Blu, Rosso, Viola, Bianco	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Nero, Giallo, Blu, Rosso, Viola, Bianco	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Nero, Giallo, Blu, Rosso, Viola, Bianco	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Nero, Giallo, Blu, Rosso, Viola, Bianco	500	10