KryoflöskurEru almennt notaðar til lágkælingar á frumulínum og öðru mikilvægu líffræðilegu efni í dewar-ílátum fylltum með fljótandi köfnunarefni.

Það eru nokkur skref sem þarf að taka til að varðveita frumur með góðum árangri í fljótandi köfnunarefni. Þó að grunnreglan sé hægfrysting, þá fer nákvæm aðferðin sem notuð er eftir frumugerðinni og frostvörninni sem notuð er. Það eru nokkur öryggisatriði og bestu starfsvenjur sem þarf að hafa í huga þegar frumur eru geymdar við svo lágt hitastig.

Þessi færsla miðar að því að gefa yfirlit yfir hvernig frystingarflöskur eru geymdar í fljótandi köfnunarefni.

Hvað eru kryóflöskur

Kæliglas eru lítil, lokuð glas sem eru hönnuð til að geyma fljótandi sýni við mjög lágt hitastig. Þau tryggja að frumur sem eru geymdar í kælivörn komist ekki í beina snertingu við fljótandi köfnunarefnið, sem lágmarkar hættuna á frumusprungum en njótir samt góðs af miklum kælingaráhrifum fljótandi köfnunarefnis.

Hettuglösin eru venjulega fáanleg í ýmsum stærðum og gerðum – þau geta verið með innri eða ytri skrúfgangi og flatan eða ávöl botn. Einnig eru fáanleg bæði sótthreinsuð og ósótthreinsuð.

Hver notarCyrovialsAð geyma frumur í fljótandi köfnunarefni

Fjölmargar rannsóknarstofur innan breska heilbrigðiskerfisins (NHS) og einkareknar rannsóknarstofur, sem og rannsóknarstofnanir sem sérhæfa sig í blóðbankastarfsemi úr naflastreng, þekjufrumulíffræði, ónæmisfræði og stofnfrumulíffræði, nota frystiglas til að frysta frumur.

Frumur sem varðveittar eru á þennan hátt eru meðal annars B- og T-frumur, CHO-frumur, blóðmyndandi stofn- og forverafrumur, blendingsfrumur, þarmafrumur, átfrumur, mesenchymal stofn- og forverafrumur, einstofna frumur, mergæxli, NK-frumur og fjölhæfar stofnfrumur.

Yfirlit yfir geymslu á frystingarflöskum í fljótandi köfnunarefni

Frystun er ferli sem varðveitir frumur og aðrar líffræðilegar byggingar með því að kæla þær niður í mjög lágt hitastig. Hægt er að geyma frumur í fljótandi köfnunarefni í mörg ár án þess að þær tapi lífvænleika sínum. Þetta er yfirlit yfir þær aðferðir sem notaðar eru.

Undirbúningur frumna

Nákvæm aðferð við að undirbúa sýni er mismunandi eftir frumugerð, en almennt eru frumurnar safnaðar og skilvindaðar til að mynda frumuríka kúlu. Þessi kúla er síðan enduruppleyst í ofanvökvanum blandað með frostvörn eða frostgeymslumiðli.

Kryopreservation miðill

Þetta miðill er notaður til að varðveita frumur í lághitaumhverfinu sem þær verða fyrir með því að hindra myndun innan- og utanfrumukristalla og þar með frumudauða. Hlutverk þeirra er að veita öruggt og verndandi umhverfi fyrir frumur og vefi við frystingu, geymslu og þíðingu.

Miðill eins og ferskt frosið plasma (FFP), heparíniserað plasmalýtlausn eða sermislausar lausnir án dýraþátta er blandaður við frostvarnarefni eins og dímetýlsúlfoxíð (DMSO) eða glýseról.

Sýnishornið sem hefur verið enduruppleyst er sett í frystiglas úr pólýprópýleni, svo semGeymsluhettuglös fyrir kryógenísk fyrirtæki frá Suzhou Ace Biomedical.

Mikilvægt er að offylla ekki frystiglösin því það eykur hættuna á sprungum og hugsanlegri losun innihaldsins (1).

Stýrður frystihraði

Almennt er notaður hægur, stýrður frystihraði til að ná árangri í frystingu frumna.

Eftir að sýnin hafa verið sett í frystiglas eru þau sett á blautan ís eða í kæli við 4°C og frystingarferlið hefst innan 5 mínútna. Almennt er mælt með því að frumurnar séu kældar á hraðanum -1 til -3 á mínútu (2). Þetta er gert með forritanlegum kæli eða með því að setja glasin í einangraðan kassa sem er settur í frysti með hraðastýringu frá -70°C til -90°C.

Flutningur yfir í fljótandi köfnunarefni

Frosnu kryógenísku hettuglösin eru síðan flutt í fljótandi köfnunarefnistank í óákveðinn tíma, að því tilskildu að hitastigið sé undir -135°C.

Þessum afar lágu hitastigi er hægt að ná með því að dýfa þeim í fljótandi eða gufukenndan köfnunarefni.

Vökva- eða gufufasi?

Geymsla í fljótandi köfnunarefni er þekkt fyrir að viðhalda köldu hitastigi með fullkomnu samræmi, en er oft ekki ráðlögð af eftirfarandi ástæðum:

• Þörfin fyrir mikið magn (dýpt) af fljótandi köfnunarefni sem er hugsanleg hætta. Brunasár eða köfnun vegna þessa er raunveruleg hætta.
• Skjalfest tilfelli af krossmengun með sýklum eins og Aspergillus, Hep B og veirusmiti í gegnum fljótandi köfnunarefni (2,3)
• Möguleiki á að fljótandi köfnunarefni leki inn í hettuglösin við niðurdýfingu í þau. Þegar hettuglösin eru tekin úr geymslu og hituð upp í stofuhita þenst þau hratt út. Þar af leiðandi getur það brotnað þegar það er tekið úr geymslunni fyrir fljótandi köfnunarefni, sem skapar hættu bæði vegna fljúgandi rusls og snertingar við innihaldið (1, 4).

Af þessum ástæðum er geymsla við mjög lágan hita oftast í gufufasa köfnunarefnis. Þegar geyma þarf sýni í fljótandi fasa ætti að nota sérhæfð cryoflex slöngu.

Ókosturinn við gufufasa er að lóðrétt hitastigshalla getur myndast sem leiðir til hitasveiflna á milli -135°C og -190°C. Þetta krefst nákvæmrar og nákvæmrar eftirlits með fljótandi köfnunarefnismagni og hitasveiflum (5).

Margir framleiðendur mæla með að frystiglös henti til geymslu niður í -135°C eða eingöngu til notkunar í gufufasa.

Að þíða frystar frumur

Þíðingarferlið er stressandi fyrir frosna ræktun og rétt meðhöndlun og tækni er nauðsynleg til að tryggja hámarks lífvænleika, endurheimt og virkni frumnanna. Nákvæmar þíðingaraðferðir eru háðar tilteknum frumugerðum. Hins vegar er hraðþíðing talin staðlað til að:

• Minnkaðu öll áhrif á endurheimt frumna
• Hjálpa til við að draga úr útsetningartíma fyrir uppleystum efnum sem eru til staðar í frystimiðlinum
• Lágmarka skaða með endurkristöllun íss

Vatnsböð, perluböð eða sérhæfð sjálfvirk tæki eru almennt notuð til að þíða sýni.

Oftast er ein frumulína þiðin í einu í 1-2 mínútur, með því að hvirfla þeim varlega í 37°C vatnsbaði þar til örlítill ís er eftir í hettuglasinu áður en þær eru þvegnar í forhituðum vaxtarmiðli.

Fyrir sumar frumur, eins og spendýrafósturvísa, er hæg hlýnun nauðsynleg til að þær lifi af.

Frumurnar eru nú tilbúnar til frumuræktunar, frumueinangrunar eða, ef um blóðmyndandi stofnfrumur er að ræða, lífvænleikarannsókna til að tryggja heilleika stofnfrumna gjafa fyrir mergfrumueyðandi meðferð.

Það er venja að taka litla skammta af forþvegnu sýni sem notað er til að framkvæma frumutalningu til að ákvarða frumuþéttni fyrir ræktun. Þá er hægt að meta niðurstöður frumueinangrunarferlanna og ákvarða lífvænleika frumna.

Bestu starfsvenjur við geymslu á frystiflöskum

Árangursrík frystingargeymsla sýna sem geymd eru í frystiglösum er háð mörgum þáttum í aðferðarlýsingunni, þar á meðal réttri geymslu og skráningu.

• Skipta reitum á milli geymslustaða– Ef rúmmál leyfir skal skipta frumunum á milli hettuglasa og geyma þær á aðskildum stöðum til að draga úr hættu á sýnistapi vegna bilana í búnaði.
• Koma í veg fyrir krossmengun– Veljið einnota dauðhreinsuð kryógenísk hettuglös eða sjálfstýringu fyrir síðari notkun
• Notið hettuglös af viðeigandi stærð fyrir frumurnar ykkar– hettuglösin eru fáanleg í rúmmáli á bilinu 1 til 5 ml. Forðist að offylla hettuglösin til að draga úr hættu á sprungum.
• Veldu kryógenísk hettuglös með innri eða ytri skrúfu– Sumir háskólar mæla með hettuglösum með innri skrúfum til öryggis – þau geta einnig komið í veg fyrir mengun við fyllingu eða þegar þau eru geymd í fljótandi köfnunarefni.
• Koma í veg fyrir leka- Notið tvísprautaðar þéttingar sem eru mótaðar í skrúftappann eða O-hringi til að koma í veg fyrir leka og mengun.
• Notið tvívíddar strikamerki og merkið hettuglös– til að tryggja rekjanleika gera hettuglös með stórum skriffleti kleift að merkja hvert hettuglös á viðeigandi hátt. Tvívíddar strikamerki geta hjálpað við geymslustjórnun og skráningu. Litakóðaðir lok eru gagnlegir til að auðvelda auðkenningu.
• Nægilegt viðhald geymslu- Til að tryggja að frumur tapist ekki ættu geymsluílát stöðugt að fylgjast með hitastigi og magni fljótandi köfnunarefnis. Viðvörunarkerfi ættu að vera sett upp til að vara notendur við villum.

Öryggisráðstafanir

Fljótandi köfnunarefni er orðið algengt í nútíma rannsóknum en það hefur í för með sér hættu á alvarlegum meiðslum ef það er notað á rangan hátt.

Nota skal viðeigandi persónuhlífar (PPE) til að lágmarka hættu á frostbitum, brunasárum og öðrum skaðlegum atvikum við meðhöndlun fljótandi köfnunarefnis.

• Kryógenískir hanskar
• Rannsóknarstofufrakki
• Höggþolin andlitshlíf sem hylur einnig hálsinn
• Lokaðir skór
• Skvettuheld plastsvunta

Ísskápar með fljótandi köfnunarefni ættu að vera staðsettir á vel loftræstum stöðum til að lágmarka köfnunarhættu – köfnunarefni gufar upp og ryður frá sér súrefni í andrúmsloftinu. Stórir geymslur ættu að vera með viðvörunarkerfi fyrir súrefnisskort.

Tilvalið er að vinna saman tvö og tvö þegar fljótandi köfnunarefni er meðhöndlað og notkun þess utan venjulegs vinnutíma ætti að vera bönnuð.

Kryoflöskur til að styðja við vinnuflæði þitt

Fyrirtækið Suzhou Ace Biomedical býður upp á fjölbreytt úrval af vörum sem uppfylla þarfir þínar varðandi frystingu mismunandi gerðir frumna. Vörulínan inniheldur úrval af rörum sem og úrval af dauðhreinsuðum frystingarglasum.

Kryoflöskurnar okkar eru:

• Skrúftappi fyrir rannsóknarstofu 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml Kryógenísk hettuglös með keilulaga botni og þéttingu

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml forskrift, með eða án pils
  ● Keilulaga eða sjálfstæð hönnun, bæði sæfð og ósæfð
  ● Skrúftappar eru úr læknisfræðilega gæðum pólýprópýleni
  ● Hægt er að frysta og þíða PP Cryotube hettuglös ítrekað
  ● Hönnun ytri loksins getur dregið úr líkum á mengun við meðhöndlun sýna.
  ● Skrúflok fyrir kryógenísk rör Alhliða skrúfgangar til notkunar
  ● Rör passa við flestar algengar snúningshlutir
  ● O-hringir fyrir frystikistur passa í venjulegar 1 tommu og 2 tommu, 48 holur, 81 holur, 96 holur og 100 holur frystikistur
  ● Sjálfsofnanlegt við 121°C og frystihæft við -86°C

  HLUTI NR.	EFNI	RÚMMÁL	CAPLITUR	Stk/POKI	TÖSKUR/HÚS
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Svartur, gulur, blár, rauður, fjólublár, hvítur	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Svartur, gulur, blár, rauður, fjólublár, hvítur	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Svartur, gulur, blár, rauður, fjólublár, hvítur	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Svartur, gulur, blár, rauður, fjólublár, hvítur	500	10