Mèsi paske w te vizite Nature.com.Vèsyon navigatè w ap itilize a gen yon sipò limite pou CSS.Pou pi bon eksperyans, nou rekòmande pou w itilize yon navigatè ki ajou (oswa fèmen mòd konpatibilite nan Internet Explorer). Antretan, pou asire w kontinye sipò, nou pral montre sit la san estil ak JavaScript.
Enpòtans siveyans echantiyon anviwònman yo te apresye anpil depi nan konmansman an nan pandemi COVID-19, ak kèk efò siveyans yo ap fèt lè l sèvi avèk estanda lò a, byenke teknik ki baze sou qPCR yo chè. solisyon pou kontwole echantiyon dlo anviwònman an nan peyi ki gen revni ba ak mwayen yo.Nan travay sa a, nou demontre deteksyon elektwochimik anplikon yo jwenn nan phage Phi6 izole nan echantiyon dlo lak ki pike (yon ranplasan popilè pou SARS-CoV-2), lè l sèvi avèk ENIG. ranpli elektwòd PCB san modifikasyon sifas yo.sèks.Repons Capteur elektwochimik la byen karakterize pou de fragman ADN ki gen longè diferan (\({117}\,\hbox {bp}\) ak \({503}\,\hbox {bp}\)]), ak efè sèl nan PCR mèt melanje sou methylene ble (MB)-ADN entèraksyon.Rezilta nou yo montre ke longè fragman ADN siyifikativman detèmine sansiblite a elektwochimik epi demontre nan travay sa a ke kapasite nan detekte anplikon long san pirifikasyon jèl nan pwodwi PCR se enpòtan pou mezi in situ nan echantiyon dlo.Yon solisyon konplètman otomatize pou chaj viral bon anons.
Transmisyon viris nan dlo yo te konnen kòm yon danje sante piblik depi ane 1940 yo, ak premye prèv nan transmisyon nan dlo nan polyo ak epatit E1. Òganizasyon Mondyal Lasante (WHO) te klase plizyè patojèn viral nan dlo ki gen yon siyifikasyon sante modere ak wo 2. Viris tradisyonèl yo. metòd deteksyon yo konte sou teknik lò ki baze sou qPCR, ki trè sansib ak espesifik, men ki mande pèsonèl kalifye pou teste nan laboratwa a lè l sèvi avèk enstriman chè. tès echantiyon gen chans rive nan pran priyorite sou siveyans echantiyon dlo anviwònman an. Se poutèt sa, metòd altènatif pri ki ba yo nesesè pou siveyans dirab, an tan reyèl nan echantiyon dlo ak dlo ize nan peyi ki ba ak mwayen revni kòm avètisman bonè nan epidemi maladi émergentes, kidonk pwoteje yo kont gwo enpak sosyoekonomik pandemi viris la.Detèktè elektwochimik ki ba pri pou asid nikleyik ta ka bay yon solisyon potansyèl pwomèt pou bezwen sa a ki pa satisfè.Anpil nan biodetèktè ADN sa yo travay pa lefèt ke seksyon ADN konplemantè yo imobilize sou elektwòd la. sifas ak hybridize lè yon sekans matche prezan nan echantiyon an. Sa a ka Lè sa a, dwe konvèti nan yon siyal pa divès kalite teknik elektwochimik lè l sèvi avèk medyatè redox tankou fè potasyòm / ferrocyanide.Methylene ble (MB) se youn sa yo molekil redox-aktif, ki gen Yo te rapòte ke yo entèkole nan ADN doub-chaj (dsDNA) anplis ki pi plis nonspecific obligatwa li yo nan ADN sèl-chaj5,6.Nati a entèrkalasyon nan MB yo fòme MB-ADN konplèks fè yo yon chwa popilè kòm medyatè redox nan plizyè ADN elektwochimik. konfigirasyon Capteur5,6,7,8,9.Malgre ke entèrkalasyon MB nan ADN pa espesifik, ak espesifik nan Capteur elektwochimik sa a depann lajman sou pite a nan primè yo itilize pou PCR oswa anplifikasyon izotèmik, li se byen adapte pou mete ann aplikasyon reyèl. -time electrochemical ki baze sou qPCR oswa fluoresans izotèmik anplifikasyon kòm yon altènativ a ADN konsantrasyon mezi 9 .Nan yon sèl aplikasyon sa yo, Won et al.The sifas elektwòd lò te modifye ak 6-mercapto-1-hexanol (MCH) pou an tan reyèl mezi anplikon PCR ak MB lè l sèvi avèk voltametri batman kè diferans (DPV)9.Nan lòt ka yo, Ramirez et al.Deteksyon SARS-CoV-2 nan dlo ize pa reyaksyon RT-LAMP lè l sèvi avèk MB ak elektwòd ekran enprime. itilize kòm elektwòd in situ nan yon platfòm PCR mikrofluidik ki fèt pou elektwokimikman detekte anplikon pandan reyaksyon 8 .Tout etid sa yo mande pou modifikasyon sifas elektwòd yo, sa ki vle di ogmante pwodiksyon ak depans fonksyònman akòz kondisyon depo espesyal pou estabilite elektwòd fonksyonalize sa yo.
Chema workflow pou deteksyon elektwochimik anplikon yo jwenn nan patikil viral konsantre nan echantiyon dlo lak.
Nou fèk demontre deteksyon elektwochimik nan anplikon SARS-CoV-2 ak elektwòd tablo sikwi enprime (PCB) a pri ki ba ki baze sou DPV ak voltametri siklik (CV) pwovoke pa adsorption nan konplèks MB-ADN sou sifas elektwòd ki pa modifye) chanjman nan pik. aktyèl11.Nou rapòte ke fragman ADN ki pi long yo (N1-N2, \({943}\, \hbox) ki te fòme lè l sèvi avèk N1 pi devan CDC-rekòmande ak N2 ranvèse primè yo konpare ak fragman ki pi kout {bp}\)) te montre pi bon linearite nan repons Capteur a. (N1, \(72\,\hbox {bp}\)) te fòme lè l sèvi avèk N1 pou pi devan ak N1 ranvèse seri primè. Yo rapòte etid sa yo lè l sèvi avèk dilusyon ADN ki te prepare nan dlo san nukleaz. -2 anplikon nan echantiyon dlo ize simulation (jwenn nan spiking echantiyon RNA total ak SARS-CoV-2 RNA).Piske RNA se sansib a taye pandan izolasyon ak pwosesis en,12,13 li difisil pou anplifye fragman ki pi long ak echantiyon etewojèn sa a. Se poutèt sa, demonstrasyon an nan deteksyon elektwochimik nan anplikon SARS-CoV-2 nan dlo ize limite a pi kout \(72\,\hbox {bp}\) N1 fragman an.
Nan travay sa a, nou te envestige posibilite nan ENIG PCB ki baze sou elektwochimik deteksyon nan phage Phi6 konsantre ak izole nan echantiyon dlo lak (figi 1). Phi6 phages yo konparab nan gwosè (80-100 nm) ak SARS-CoV-2 ak gen tou yon manbràn lipid ak yon pwoteyin Spike.Pou rezon sa yo, bakteriofaj Phi6 se yon ranplasan popilè pou SARS-CoV-2 ak lòt viris RNA patojèn ki anvlòp14,15.RNA ki izole nan patikil faj yo te itilize kòm yon modèl pou sentèz cDNA ki te swiv pa PCR pou jwenn de fragman ADN ki gen 117 ak 503 pè baz nan longè. Bay defi pou anplifye \(943\,\hbox {bp}\) fragman N1-N2 nan travay anvan nou an, nou vize fragman longè entèmedyè (\(117). \,\hbox {bp}\) ak \(503 \,\hbox {bp}\)), ki baze sou primè ki disponib. Yo te etidye repons detèktè elektwochimik la sistematikman sou yon pakèt konsantrasyon (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) pou \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) Pou tou de fragman nan prezans MB, efè sèl sou repons Capteur a te karakterize ak kwa-valide pa mezi espektrofotometrik.Kontribisyon prensipal yo nan travay sa a se jan sa a:
Longè fragman ADN ak prezans sèl nan echantiyon an afekte sansiblite anpil.Rezilta nou yo montre ke aktivite elektwochimik depann sou diferan mekanis nan entèraksyon MB, ADN, ak Capteur a nan repons voltametrik la, tou depann de konsantrasyon ADN ak longè, ak pi long Fragman montre pi wo sansiblite, byenke sèl gen yon efè negatif sou entèraksyon elektwostatik ant. MB ak ADN.
Konsantrasyon ADN detèmine mekanis entèraksyon MB-ADN nan elektwòd ki pa modifye Nou demontre diferan mekanis entèraksyon MB-ADN depann de konsantrasyon ADN. Nan konsantrasyon ADN ki anba yon ti kantite \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox. {l}}}\), nou te obsève ke repons elektwochimik aktyèl la te sitou detèmine pa adsorption MB-DNA sou elektwòd la, pandan y ap nan pi ba konsantrasyon Nan konsantrasyon ADN segondè, repons elektwochimik aktyèl la te detèmine pa anpèchman esterik redox. aktivite akòz ensèsyon MB ant pè baz ADN.
Deteksyon elektwochimik ENIG PCB ki baze sou asid nikleik viral nan echantiyon dlo Lake Obsèvasyon yo te valide pa deteksyon elektwochimik Phi6-ajoute \(503\,\hbox {bp}\) fragman ADN yo jwenn nan echantiyon dlo nan Powai Lake, IIT Mumbai Campus. Rezilta phage.
Pri ki ba nan aplikasyon ak potansyèl pou entegrasyon nan sistèm siveyans konplètman otomatize, oligonukleotid oswa aptamer sou elektwòd ki gen pi long lavi etajè.
Phi6 Phi6 se yon viris dsRNA anvlòp nan fanmi Cytoviridae ki enfekte Pseudomonas syringae.Jenom Phi6 phage egziste sou fòm 3 fragman: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07). \,\hbox {Kb}\)) ak L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\))16,17.Piske phage Phi6 la enfekte yon souch Pseudomonas BSL-1 ki pa patojèn, li an sekirite pou itilize. epi yo ka fasil pou grandi nan laboratwa a.Phage Phi6 ak Pseudomonas syringae ki lame li yo te achte nan Sant Referans Felix d'Herelle pou Viris Bakteri, Inivèsite Laval, Kanada (nimewo katalòg sant referans yo se HER-102 ak HER-1102, respektivman) .Phi6 phage ak lame li yo te reviv jan sant referans lan te dirije yo. Phi6 Phi6 te pirifye pa liz plak ak elisyon pou jwenn tit final ak \(\apeprè 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (inite ki fòme plak / mililit). Yo te izole RNA nan patikil faj ki pirifye lè l sèvi avèk GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) dapre enstriksyon manifakti a.Brèfman, yon sispansyon Phi6 phage pirifye\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) yo te lysate ak lysate la te chaje sou yon kolòn vire pou pèmèt RNA mare nan kolòn nan résine. 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) twous la bay. Estime konsantrasyon RNA pa absòbe nan \(260\,\hbox {nm}\).RNA te estoke an alikòt nan \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) jiskaske plis itilize.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Twous sentèz cDNA iScript la (Bio -Rad Laboratories) te itilize kòm yon modèl pou sentèz cDNA swiv enstriksyon manifakti a.Brèfman, yon reyaksyon sentèz cDNA konsiste de 3 etap: priming nan \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\), transkripsyon ranvèse \({20}\,{\hbox {min}}\) nan \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), ak ranvèse Anrejistre a se nan \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) pou \({1}\,{\hbox {min }}\).Lè yo kouri sou yon jèl agaroz 1%, cDNA a te montre twa gwoup ki koresponn ak twa fragman RNA espere (done yo pa montre).Primè sa yo te itilize pou anplifye de fragman ADN ki gen 117 ak 503 bp nan longè, lè l sèvi avèk cDNA kòm modèl pou PCR nan yon siklis tèmik miniPCR® mini8:
Jadendanfan yo pou \(117\,\hbox {bp}\) ak \(503\,\hbox {bp}\) koresponn ak 1476-1575 nukleotid nan segman M ak 458-943 nukleotid nan segman L, respektivman asid. .Tout pwodwi PCR anplifye yo te electrophoresed sou 1% jèl agarose, ak ADN sib anplifye yo te pirifye lè l sèvi avèk GeneJET Gel Extraction Twous (Thermo Fisher Scientific).
Yo te itilize yon lak nan kanpis IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) pou ajoute patikil faj. Dlo lak la te filtre nan yon manbràn \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) pou retire li. patikil ki sispann, epi yo te ajoute phage Phi6.Ajoute \({1}\,{\hbox {ml}}\) nan \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) nan \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) dlo lak filtre, nan \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\).Yon ti alikòt te genyen. rezève pou mezi chaj viral pa assay plak.Nou teste de metòd diferan pou konsantre patikil viris Phi6 ki gen pikèt: (1) metòd adsorption-presipitasyon idroksid aliminyòm,19 ki te valide pou konsantrasyon plizyè viris RNA anvlòp ki soti nan echantiyon anviwònman an, ak (2) ) Metòd konsantrasyon viris ki baze sou polyethylene glycol (PEG) te adapte nan Flood et al.20 .Depi yo te jwenn efikasite rekiperasyon metòd ki baze sou PEG la pi bon pase metòd idroksid aliminyòm lan, yo te itilize metòd ki baze sou PEG pou konsantre patikil Phi6 ki soti nan echantiyon dlo lak.
Metòd PEG yo te itilize a te jan sa a: PEG 8000 ak \(\hbox {NaCl}\) yo te ajoute nan echantiyon dlo lak Phi6-spiked pou jwenn 8% PEG 8000 ak \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\).Echantiyon yo te enkube sou yon shaker\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), Lè sa a, santrifuje nan \(4700 \,\hbox {g}\) se \({45}\,{\hbox {min}}\).Jete supernatant la epi repoze i grenn nan \({1}\, {\hbox {ml}}\) nan menm sipènatan an.Tout eksperyans konsantrasyon viris ak spiking yo te fèt an twa fwa.Apre konsantrasyon, yo te rezève yon ti alikòt pou mezire efikasite rekiperasyon pa tès plak. nan tanpon elisyon ki bay twous\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\).Piske konsantrasyon RNA a ap varye de echantiyon an nan echantiyon an twa fwa, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) nan RNA yo itilize pou tout twa kèlkeswa konsantrasyon li yo, sentèz cDNA nan echantiyon yo. te itilize kòm modèl pou \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR pou 35 sik pou anplifye \(117\,\hbox {bp}\) ak \(503\,\hbox { bp}\) fragman.Echantiyon sa yo reprezante kòm "1:1", sa vle di san dilution.Yon kontwòl san modèl (NTC) te mete kanpe kòm yon kontwòl negatif, pandan y ap yon cDNA sentèz lè l sèvi avèk RNA izole nan faj pirifye yo te mete kanpe. kòm yon modèl pou yon kontwòl pozitif (PC). PCR quantitative (qPCR) te fèt nan yon enstriman Stratagene Mx3000P RT-PCR lè l sèvi avèk Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). dekri. Yo te anrejistre papòt sik la (Ct) pou tout echantiyon yo. Anplis de sa, echantiyon dilye yo te \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) lè l sèvi avèk cDNA dilye 1:100 nan dlo lak filtre kòm \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR pou 35 sik. Echantiyon sa yo reprezante kòm "1:100".
Elektwòd PCB yo fabrike lè l sèvi avèk yon pwosesis ki disponib nan komès ki ba pri Electroless Nikèl Immersion Gold (ENIG) san yo pa bezwen plis lò plating.ENIG PCB spesifikasyon elektwòd yo detaye nan travay anvan nou an. Solisyon piranha oswa voltametri silik asid silfirik yo pa rekòmande paske yo ka lakòz dekale nan kouch lò mens la (epesè \(\approx\) \(100\,\hbox {nm }\)) epi ekspoze kouch kòb kwiv mete ki kache yo. kowozyon nan 21, 22, 23, 24, 25.Se poutèt sa, netwaye elektwòd yo ak yon twal ki pa gen pèl mouye ak IPA. Yo te enkube echantiyon an yo dwe teste ak \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB nan \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) pou ensèsyon fasil.Nan travay anvan nou an , nou te obsève ke sansiblite a ak linearite nan Capteur a te amelyore lè yo ogmante konsantrasyon MB 11 .Baze sou optimize yo te rapòte nan travay anvan nou an, nou te itilize \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB konsantrasyon pou entegre ADN nan etid sa a.Deteksyon elektwochimik ADN doub (ds-DNA) ka reyalize lè l sèvi avèk intercalators anionik oswa kationik. Malgre ke entèrkalateur anionik detekte ADN ak pi bon selektivite, yo mande pou enkubasyon lannwit lan, sa ki lakòz tan deteksyon pi long. lòt men an, entèrkalateur kasyonik tankou MB mande pou pi kout tan enkubasyon, apeprè \({1}\,{\hbox {h}}\) pou deteksyon elektwochimik nan ds-DNA6. Chak mezi enplike nan distribye echantiyon an yo dwe teste sou la. elektwòd\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), apresa netwaye ak yon ranyon ki mouye IPA, anvan ou kontinye ak yon lòt echantiyon.yon sèl mezi.Chak echantiyon yo te teste sou 5 elektwòd diferan sof si yo di otreman.Mezi DPV ak CV yo te fèt lè l sèvi avèk yon potentiostat PalmSens Sensit Smart, epi yo te itilize lojisyèl PSTrace pou konfigirasyon potensòstat ak akizisyon done, ki gen ladan kalkil aktyèl pik yo. pou mezi DPV ak CV:
DPV: Tan Ekilib = \(8\,\hbox {s}\), Etap vòltaj = \(3\,\hbox {mV}\), Voltage batman kè = \(25\,\hbox {mV}\) , dire batman = \(50\,\hbox {ms}\), to eskanè = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Tan Ekilib = \(8\,\hbox {s}\), Etap Voltage = \(3\,\hbox {mV}\), Pousantaj Bale = \({300}\,\hbox {mV/s }\)
Kouran pik yo jwenn nan voltamogram ADN konplèks ak \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Voltamogram DPV ak CV yo te jwenn sou elektwòd ENIG PCB \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB konplèks ak ADN (nan konsantrasyon 10–\({20}\,{\ hbox {ng). }/{\upmu \hbox {l}}}\) sa vle di 0.13–\({0.26}\,{\upmu \hbox {M}}\) pou \(117\,\hbox {bp}\ ) ak 0.03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) pou \(503\,\hbox {bp}\)).Volamogram reprezantan yo montre nan Figi S1 nan Enfòmasyon Siplemantè.Figi 2 montre rezilta yo. nan DPV ak mezi CV (aktyèl pik) lè l sèvi avèk jèl-pirifye pwodwi PCR.Konpare ak mezi CV, mezi DPV montre pi wo sansiblite (aktyèl kòm yon fonksyon nan konsantrasyon ADN) paske kouran yo kapasitif background nan mezi CV kache kouran Faradaic 26 .Done yo pou chak bwat nan bwat la gen mezi ki soti nan 5 elektwòd. Tout mezi yo sèvi ak menm seri elektwòd pou fè pou evite erè mezi akòz varyasyon elektwòd-a-elektwòd.Nou obsève yon tandans ogmante nan DPV ak CV mezire kouran pik pou pi ba konsantrasyon nan ADN. , pi long (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ konpare ak \(117) ) fragman. adsorption nan MB-ADN konplèks la fasilite transfè chaj la sou elektwòd la, ki kontribye nan ogmantasyon nan aktyèl la pik. Lòt etid yo te montre efè a nan gwosè oligonukleotid ak sekans sou entèkalasyon MB-ADN27,28,29,30.Ganin la. -sitozin (GC) kontni de anplikon yo (\(117\,\hbox {bp}\) ak \(503\,\hbox {bp}\)) te apeprè 50%, ki endike ke obsèvasyon an diferans lan se akòz nan longè anplikon.Sepandan, pou pi gwo konsantrasyon ADN (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), pou \(503\,\hbox {bp} \) ak \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) pou \(117\,\hbox {bp}\)), nou obsève de anplifikasyon. kouran pik nan subs yo redwi nan tou de mezi DPV ak CV. Sa a se paske MB satire ak intercalates ant pè baz nan ADN, sa ki lakòz anpèchman esterik nan aktivite redox nan gwoup la rediksyon nan MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV。
Sèl ki prezan nan melanj PCR mèt entèfere ak entèraksyon elektwostatik ant MB ak ADN, kidonk lè w ajoute \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) ak \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB jèl-pirifye pwodwi pou etidye efè sèl sou entèraksyon MB-ADN. Jan yo montre nan Figi 3, nou te obsève ke pou pi gwo konsantrasyon ADN (\(>{2}\,{\). hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) ak \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) pou \(117\,\hbox {bp} \)), nan DPV ak CV Adisyon sèl la pa t afekte mezi yo anpil (gade Figi S2 nan Enfòmasyon siplemantè pou voltamogram reprezantan). pi ba konsantrasyon ADN, adisyon a nan sèl anpil diminye sansiblite, sa ki lakòz pa gen okenn chanjman enpòtan nan aktyèl ak konsantrasyon ADN. Menm jan efè negatif nan sèl sou entèraksyon MB-ADN ak entèrkalasyon yo te deja rapòte pa lòt chèchè33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) kasyon yo mare nan zo rèl do fosfat negatif nan ADN, kidonk anpeche entèraksyon elektwostatik ant MB ak ADN. Nan pi wo konsantrasyon ADN, anpèchman esterik nan MBs redox-aktif rezilta nan pi ba kouran pik, kidonk entèraksyon elektwostatik. pa siyifikativman afekte repons Capteur a. Pwen kle se ke biosensor sa a pi byen adapte pou detekte pi gwo konsantrasyon ADN (raman \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) oswa pi wo), pou konplètman- Otomatik pwosesis nan echantiyon dlo anviwònman an, kote pirifikasyon jèl nan pwodwi PCR ka pa posib.
Zòn anba koub absòpsyon pou ranje longèdonn 600–700 \(\hbox {nm}\) pou divès konsantrasyon ADN konplekse ak \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) ak ak san sèl (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) ak ak san sèl (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Konsantrasyon ADN ki koresponn ak echantiyon \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB Pa gen ADN.
Pou plis verifye rezilta ki anwo yo, nou te fè mezi optik lè l sèvi avèk yon espektrofotomèt UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), echantiyon yo te itilize pou chak. Mezi.Siyati absòpsyon an diminye ak ogmante konsantrasyon ADN, jan yo ka wè nan tandans nan zòn ki anba koub absòpsyon pou ranje longèdonn \(600\,\hbox {nm}\) rive nan \(700\,\hbox { nm}\), jan yo montre nan Fig. 4 (spectre absòpsyon yo montre nan Fig. S3 nan Enfòmasyon Siplemantè).Pou echantiyon ak konsantrasyon ADN mwens pase \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), pa te gen okenn diferans enpòtan nan absòpsyon ant echantiyon ki gen ADN ak echantiyon MB sèlman (pou \(503\,\hbox {bp}\) ak \(117\,\hbox {bp}\). ) fragman longè), ki endike absans anpèchman esterik nan redox-aktif MB.Nan pi wo konsantrasyon ADN, nou te obsève yon diminisyon gradyèl nan siyal absòbe a epi nou te note yon diminisyon pi piti nan absorpsyon nan prezans sèl.Rezilta sa yo te atribiye nan molekilè. entèraksyon ak anpèchman esterik ak anpile baz nan ibrid ADN. Rezilta nou yo konsistan avèk rapò ki nan literati sou syans spektroskopik entèkalasyon MB-ADN ki asosye ipokromatisite ak nivo enèji redwi nan \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) tranzisyon elektwonik akòz entèkalasyon Kouch 36, 37, 38.
Elektwoforèz jèl agaroz nan phage Phi6: pwodwi PCR nan longè \(117\,\hbox {bp}\) ak \(503\,\hbox {bp}\) soti nan echantiyon dlo lak.M-DNA makè;NTC-pa gen okenn modèl kontwòl, primè ki gen anplikon korespondan;PC kontwòl pozitif;1, 2, 3-ki pa dilue (1:1) echantiyon dlo lak ki pike an twa fwa.Yon gwoup vizib nan \(\apeprè 50\,\hbox {bp}\) akòz oligonukleotid ki pa itilize nan \(503\,\). hbox {bp}\) liy.
Nou te evalye itilite detèktè a lè l sèvi avèk echantiyon dlo Powai Lake ki te ajoute ak Phi6 phage. Konsantrasyon RNA yo izole nan echantiyon dlo phage-spiked te varye ant 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), pandan ke sa yo ki izole nan sispansyon faj pirifye yo te estime RNA a se \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) ak yon efikasite rekiperasyon apeprè 1. %.RNA te ranvèse transkri nan cDNA epi yo itilize kòm modèl pou PCR ak qPCR. Gwosè pwodwi yo te konfime pa elektwoforèz jèl agarose (Figi 5) anvan tès la ak Capteur a. byen ke anplikon yo nan enterè yo. Yo montre valè Ct yo anrejistre pandan qPCR (Tablo 1) yo korelasyon ak konsantrasyon RNA ki izole nan echantiyon dlo ki koresponn yo. Valè Ct revele kantite sik ki nesesè pou siyal fliyoresan an. depase papòt la oswa siyal background.Pi wo valè Ct endike pi ba konsantrasyon modèl ak vis vèrsa.Valè Ct echantiyon NTC yo te osi wo jan yo espere. Diferans nan \(\apeprè 3\) valè Ct ant kontwòl pozitif la ak echantiyon tès la plis endike ke chak echantiyon tès gen apeprè 1% modèl konpare ak kontwòl pozitif la.Nou te deja diskite ke anplikon ki pi long mennen nan pi bon sansiblite.Anplifikasyon nan fragman ki pi long izole nan echantiyon anviwònman eterojèn se defi bay dezavantaj yo. nan ba konsantrasyon viral ak degradasyon RNA.Sepandan, ak anrichisman viris nou an ak pwotokòl anplifikasyon PCR, nou te kapab anplifye avèk siksè fragman \(503\,\hbox {bp}\) pou deteksyon elektwochimik.
Figi 6 montre rezilta detèktè elektwochimik \(503\,\hbox {bp}\) anplikon fragman an, tou de lè l sèvi avèk cDNA san dilye kòm modèl (1:1) ak 100-pliye cDNA dilye kòm modèl (1:100) fè PCR. , konpare ak NTC ak PC (gade Figi S4 nan Enfòmasyon Siplemantè pou voltammogram reprezantan).Chak bwat nan tablo bwat la nan Figi 6 gen mezi ki soti nan twa echantiyon nan 5 elektwòd. Yo te itilize menm elektwòd yo pou mezire tout echantiyon yo pou evite erè akòz elektwòd. -a-elektwòd varyasyon.Konpare ak mezi CV, mezi DPV montre pi bon rezolisyon yo fè distenksyon ant echantiyon tès ak PC soti nan NTCs paske, kòm mansyone deja, kouran Faradaic yo kache akòz kouran kapasitif background nan latter.Pou pi long anplikon, nou obsève ke Kontwòl negatif (NTC) te lakòz pi wo CV ak DPV pik kouran parapò ak kontwòl pozitif la, tandiske echantiyon tès pozitif ak san dilye te montre menm wotè pik DPV kouran yo. ) echantiyon tès ak PC ka klèman rezoud soti nan pwodiksyon an Capteur pou echantiyon NTC a, pandan y ap rezolisyon an pou echantiyon an dilye 1:100 se mwens pwononse.Pou yon dilution 100-pliye nan cDNA, nou pa t 'obsève nenpòt gwoup pandan elektwoforèz jèl (liy yo pa montre nan Figi 5), ak DPV ki koresponn ak kouran pik CV yo te sanble ak sa yo te espere pou NTC. Rezilta yo pou fragman \(117\,\hbox {bp}\) yo montre nan Enfòmasyon siplemantè. kontwòl pwovoke yon repons elektwochimik nan Capteur PCB la akòz adsorption MB gratis sou elektwòd la ak entèraksyon MB ak oligonucleotide jadendanfan sèl-bloke. Se poutèt sa, chak fwa yo teste yon echantiyon, yo dwe kouri yon kontwòl negatif ak pik aktyèl echantiyon tès la konpare ak pik aktyèl la jwenn pa kontwòl negatif la pou reyalize yon mezi diferans (relatif)39,40 pou klasifye echantiyon tès la kòm pozitif oswa negatif.
(a) DPV, ak (b) aktyèl pik CV pou deteksyon elektwochimik nan fragman \(503\,\hbox {bp}\) nan echantiyon dlo lak yo. Yo te mezire echantiyon tès yo an twa kopi epi yo te konpare ak pa gen okenn kontwòl modèl (NTC) ak kontwòl pozitif (PC).
Konklizyon nou yo montre diferan mekanis ki afekte pèfòmans detèktè elektwochimik pou anplikon ki gen longè diferan pou diferan ADN, ak konsantrasyon yo verifye pa mezi optik lè l sèvi avèk yon espektrofotomèt UV/Vis. \(500\,\hbox {bp}\) ka detekte ak pi gwo sansiblite e ke prezans sèl nan echantiyon an pa sansiblite konsantrasyon ADN ki afekte pi wo sansiblite (raman \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ak pi wo a).Anplis de sa, nou te envestige efè diferan kalite echantiyon, ki gen ladan anplikon jèl-pirifye ak ak san ajoute sèl, ak adisyon nan echantiyon dlo lak nan DPV ak mezi CV.Nou te obsève ke DPV bay pi bon rezolisyon, depi aktyèl la kapasitif background tou afekte mezi CV la, fè li mwens sansib.
Anplifikasyon nan fragman ki pi long depann de entegrite nan RNA jenomik viral la. Plizyè etid yo te montre ke anplifikasyon nan fragman ki pi long yo pa toujou efikas akòz degradasyon nan RNA nan anviwònman an ak potansyèl la pou splicing pandan izòlman11,41,42,43,44. .Nou te obsève ke metòd la konsantrasyon viris ki baze sou PEG te pi efikas nan konsantre phage Phi-6 spiked nan echantiyon dlo lak pase metòd la konsantrasyon viris idroksid aliminyòm ki baze sou. Kapasite nan detekte fragman ADN long pwouve simonte egzijans pou PCR multiplex. pou anplifye plizyè modèl longè ki pi kout epi redwi posiblite pou kwa-espesifik.
Echantiyon byolojik yo ra, kidonk gen yon nesesite pou konsepsyon yon byodetèktè ki mande pou echantiyon minimòm pou tès yo. Elektwòd PCB ENIG yo itilize nan etid sa a sèlman egzije \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) echantiyon pou fè tès yo kouvri zòn ki efikas nan elektwòd yo. Anplis de sa, menm elektwòd la ka reyitilize apre w fin netwaye anvan ou distribye echantiyon pwochen an. ak pwodui chimik yo itilize souvan.Depi chak elektwòd koute apeprè $0.55 (oswa INR 40) pou fabrike, biocapteur sa a kapab yon altènatif pri-efikas nan teknoloji deteksyon ki egziste deja.Table 2 montre yon konparezon nan travay sa a ak lòt detèktè rapòte nan literati a pou lontan. Fragman ADN nan echantiyon etewojèn.
Etandone ke pwotokòl deteksyon elektwochimik ki baze sou MB depann sou espesifik PCR, yon gwo limit nan metòd sa a se potansyèl pou anplifikasyon ki pa espesifik nan echantiyon etewojèn tankou dlo ize ak dlo lak oswa lè l sèvi avèk primè ki ba-pite. Pou amelyore sansiblite nan metòd deteksyon elektwochimik pou deteksyon ADN nan pwodwi PCR ki pa pirifye lè l sèvi avèk elektwòd ENIG PCB ki pa modifye, li nesesè pou w konprann pi byen erè dNTP ak primè ki pa itilize yo te entwodwi, epi pou optimize kondisyon reyaksyon ak pwotokòl tès yo. demann oksijèn (BOD) nan echantiyon dlo a ka bezwen tou mezire yo nan lòd yo amelyore presizyon nan mezi a.
An konklizyon, nou pwopoze yon pri ki ba elektwochimik ENIG PCB Capteur pou deteksyon viris nan echantiyon anviwònman an (dlo lak). Kontrèman ak elektwòd oligonukleotid immobilize oswa substrats koutim pou deteksyon ADN ki mande pou depo kriyojenik kenbe sansiblite,53,54 teknik nou an sèvi ak PCB ki pa modifye. elektwòd ki gen yon lavi etajè ki pi long ak pa gen okenn kondisyon depo espesifik ak Se poutèt sa apwopriye pou devlopman nan solisyon mezi ak pwosesis echantiyon otomatik ki deplwaye nan LMICs.The biosensor itilize pa chè DNA-intercalating koloran redox (MB) pou deteksyon rapid nan anplicon sib. Anplifikasyon ki pa espesifik. komen nan echantiyon anviwònman an diminye espesifik nan metòd sa a deteksyon akòz obligatwa a nonspecific nan MBs nan oligonukleotid sèl-ak doub-bloke.Se poutèt sa, espesifik nan tès sa a depann sou optimize a nan primè ak kondisyon reyaksyon PCR. ak kouran pik DPV yo jwenn nan echantiyon yo teste yo ta dwe entèprete parapò ak repons yo jwenn nan kontwòl negatif (NTC) pou chak tès.Desen yo ak metòd detèktè elektwochimik yo prezante nan travay sa a ka entegre ak autosamplers yo devlope yon totalman otomatize ak ba. -pri solisyon ki ka kolekte epi analize echantiyon ak san fil transmèt rezilta yo tounen nan laboratwa a.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Methods for initial concentration of virus from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.J.Application.microorganism.115, pp 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne viruses: Barriers to safe drinking water.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al.Wastewater epidemyology pou pri-efikas gwo echèl siveyans nan COVID-19 nan peyi ki ba ak mwayen revni: defi ak opòtinite.Water 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Nucleic acid electrochemistry.Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Methylene ble kòm yon diskriminatè elektwochimik nan oligonukleotid sèl ak doub-bloke imobilize sou substrats lò.Analyst 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Konparezon nan kation ak aniyon entèrkalateur pou transdiksyon elektwochimik nan ibridasyon ADN pa Long-Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Transfè chaj atravè ADN: yon ADN elektwochimik selektif biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al.Real-time PCR mikrofluidik aparèy ak deteksyon electrochemical.biological sensor.Bioelectronics.24, 2131-2136 (2009).
Win, BY et al.Siyal etid mekanis ak verifikasyon pèfòmans nan yon sistèm PCR an tan reyèl elektwochimik ki baze sou entèraksyon an nan methylene ble ak ADN.Analyst 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al.Loop-medyatè izotèmik anplifikasyon ki baze sou Capteur elektwochimik pou deteksyon nan sars-cov-2 nan echantiyon dlo ize.J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Deteksyon elektwochimik nan anplikon SARS-CoV-2 ak elektwòd PCB. Capteur a aktive.B Chimi.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Deteksyon efikas nan SARS-CoV-2 RNA nan fraksyon solid nan wastewater.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytical Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Siviv nan anvlòp bakteriofaj Phi6 (yon ranplasan pou SARS-CoV-2) nan ti gout saliv evapore depoze sou sifas vè.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Persistans anviwònman yon ranplasan SARS-CoV-2 (Phi6) nan amoeba k ap viv gratis.J.Water Health 20, 83 (2021).
Mindich, L. Anbalaj egzak twa fragman jenomik bakteryofaj RNA doub-chachen\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149–160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Segondè estrikti DH RNA phage\(\varphi\)6 anbalaj rejyon an.RNA 6, 880–889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap - Yon pwotokòl rapid ak efikas pou prepare stock laboratwa nan bakteriofaj.PeerJ 4, e2261 (2016).
Tan poste: Me-27-2022