Criofrascosúsanse habitualmente para o almacenamento crioxénico de liñas celulares e outros materiais biolóxicos críticos, en recipientes Dewar cheos de nitróxeno líquido.

Hai varias etapas implicadas na conservación exitosa das células en nitróxeno líquido. Aínda que o principio básico é a conxelación lenta, a técnica exacta empregada depende do tipo de célula e do crioprotector utilizado. Hai varias consideracións de seguridade e mellores prácticas a ter en conta ao almacenar células a temperaturas tan baixas.

Esta publicación ten como obxectivo dar unha visión xeral de como se almacenan os criofrascos en nitróxeno líquido.

Que son os criofrascos?

Os crioviales son pequenos frascos con tapa deseñados para almacenar mostras líquidas a temperaturas extremadamente baixas. Garanten que as células conservadas en crioprotector non entren en contacto directo co nitróxeno líquido, minimizando o risco de fracturas celulares e beneficiándose ao mesmo tempo do efecto de arrefriamento extremo do nitróxeno líquido.

Os frascos adoitan estar dispoñibles nunha variedade de volumes e deseños: poden ter rosca interna ou externa e fondos planos ou redondeados. Tamén hai dispoñibles formatos estériles e non estériles.

Quen usaCyrovialspara almacenar células en nitróxeno líquido

Unha serie de laboratorios do NHS e privados, así como institucións de investigación especializadas en bancos de sangue do cordón umbilical, bioloxía de células epiteliais, inmunoloxía e bioloxía de células nai, usan criofrascos para criopreservar células.

As células conservadas deste xeito inclúen células B e T, células CHO, células nai e proxenitoras hematopoéticas, hibridomas, células intestinais, macrófagos, células nai e proxenitoras mesenquimais, monocitos, mieloma, células NK e células nai pluripotentes.

Visión xeral de como almacenar criofrascos en nitróxeno líquido

A criopreservación é un proceso que preserva células e outras construcións biolóxicas arrefriándoas a temperaturas moi baixas. As células poden almacenarse en nitróxeno líquido durante anos sen perda de viabilidade celular. Este é un resumo dos procedementos empregados.

Preparación celular

O método exacto para preparar as mostras variará dependendo do tipo de célula, pero en xeral, as células recóllense e centrifuganse para desenvolver un precipitado rico en células. Este precipitado resuspéndese entón no sobrenadante mesturado con crioprotector ou un medio de criopreservación.

Medio de criopreservación

Este medio emprégase para preservar as células nos ambientes de baixa temperatura aos que estarán sometidas, inhibindo a formación de cristais intra e extracelulares e, polo tanto, a morte celular. A súa función é proporcionar un ambiente seguro e protector para as células e os tecidos durante os procesos de conxelación, almacenamento e desconxelación.

Un medio como plasma fresco conxelado (FFP), unha solución de plasmalítos heparinizada ou solucións sen soro nin compoñentes animais mestúrase con crioprotectores como dimetilsulfóxido (DMSO) ou glicerol.

O gránulo de mostra relicuado alícuotase en criofrascos de polipropileno comoFrascos de almacenamento crioxénico da empresa Suzhou Ace Biomedical.

É importante non encher demasiado os criofrascos, xa que isto aumentará o risco de rachaduras e a posible liberación do contido (1).

Velocidade de conxelación controlada

En xeral, emprégase unha velocidade de conxelación lenta e controlada para a criopreservación celular con éxito.

Despois de alícuotar as mostras en frascos crioxénicos, estas colócanse sobre xeo húmido ou nun frigorífico a 4 ℃ e o procedemento de conxelación comeza en 5 minutos. Como guía xeral, as células arrefríanse a unha velocidade de -1 a -3 por minuto (2). Isto conséguese usando un refrixerador programable ou colocando os frascos nunha caixa illada colocada nun conxelador de velocidade controlada de –70 °C a –90 °C.

Transferencia a nitróxeno líquido

Os frascos crioxénicos conxelados transfírense entón a un tanque de nitróxeno líquido durante períodos indefinidos, sempre que se manteña unha temperatura inferior a -135 ℃.

Estas temperaturas ultrabaixas pódense obter por inmersión en nitróxeno en fase líquida ou de vapor.

Fase líquida ou de vapor?

Sábese que o almacenamento en nitróxeno en fase líquida mantén a temperatura fría cunha consistencia absoluta, pero a miúdo non se recomenda polas seguintes razóns:

• A necesidade de grandes volumes (profundidade) de nitróxeno líquido, o que supón un perigo potencial. As queimaduras ou asfixia debido a isto supoñen un risco real.
• Casos documentados de contaminación cruzada por axentes infecciosos como aspergilos, hepatite B e propagación viral a través do medio de nitróxeno líquido (2,3)
• A posibilidade de que o nitróxeno líquido se filtre nos frascos durante a inmersión. Cando se retiran do almacenamento e se quentan á temperatura ambiente, o nitróxeno expándese rapidamente. En consecuencia, o frasco pode romperse ao retiralo do almacenamento de nitróxeno líquido, o que crea un perigo tanto polos residuos voadores como pola exposición ao contido (1, 4).

Por estas razóns, o almacenamento a temperaturas ultrabaixas adoita facerse en nitróxeno en fase vapor. Cando as mostras deban almacenarse en fase líquida, débese usar tubos crioflex especializados.

A desvantaxe da fase de vapor é que pode producirse un gradiente de temperatura vertical que provoca flutuacións de temperatura entre -135 ℃ e -190 ℃. Isto require unha monitorización coidadosa e dilixente dos niveis de nitróxeno líquido e das variacións de temperatura (5).

Moitos fabricantes recomendan que os criofrascos sexan axeitados para o almacenamento a temperaturas de ata -135 ℃ ou para o seu uso só en fase de vapor.

Desconxelación das células criopreservadas

O procedemento de desconxelación é estresante para un cultivo conxelado e requírese unha manipulación e unha técnica axeitadas para garantir unha viabilidade, recuperación e funcionalidade óptimas das células. Os protocolos exactos de desconxelación dependerán dos tipos de células específicos. Non obstante, a desconxelación rápida considérase estándar para:

• Reducir calquera impacto na recuperación celular
• Axuda a reducir o tempo de exposición aos solutos presentes no medio de conxelación
• Minimizar calquera dano por recristalización do xeo

Os baños de auga, os baños de esferas ou instrumentos automatizados especializados úsanse habitualmente para desconxelar mostras.

O máis frecuente é que se desconxele unha liña celular cada vez durante 1 ou 2 minutos, axitándoa suavemente nun baño de auga a 37 ℃ ata que só quede un pouco de xeo no vial antes de lavalas nun medio de crecemento prequentado.

Para algunhas células como os embrións de mamíferos, un quecemento lento é esencial para a súa supervivencia.

As células xa están listas para o cultivo celular, o illamento celular ou, no caso das células nai hematopoéticas, para estudos de viabilidade para garantir a integridade das células nai doantes antes da terapia mieloablativa.

É práctica normal tomar pequenas alícuotas da mostra prelavada utilizada para realizar unha contaxe celular para determinar as concentracións celulares para o cultivo en silos. Despois, pódense avaliar os resultados dos procedementos de illamento celular e determinar a viabilidade celular.

Boas prácticas para o almacenamento de criofrascos

O éxito da criopreservación de mostras almacenadas en criofrascos depende de moitos elementos do protocolo, incluíndo o almacenamento e o mantemento de rexistros axeitados.

• Dividir celas entre localizacións de almacenamento– Se os volumes o permiten, dividir as células entre os frascos e almacenalas en lugares separados para reducir o risco de perda de mostras debido a fallos do equipo.
• Evitar a contaminación cruzada– Optar por frascos crioxénicos estériles de uso único ou autoclave antes do seu uso posterior
• Usa frascos de tamaño axeitado para as túas células– os frascos veñen nun rango de volumes de entre 1 e 5 ml. Evite encher demasiado os frascos para reducir o risco de rachaduras.
• Seleccionar frascos crioxénicos con rosca interna ou externa– Algunhas universidades recomendan o uso de frascos con rosca interna por medidas de seguridade; tamén poden evitar a contaminación durante o recheo ou cando se almacenan en nitróxeno líquido.
• Evitar fugas- Empregar selos biinxectados moldeados na tapa de rosca ou nas xuntas tóricas para evitar fugas e contaminación.
• Usar códigos de barras 2D e etiquetar frascos– para garantir a rastrexabilidade, os frascos con amplas áreas de escritura permiten etiquetar axeitadamente cada frasco. Os códigos de barras 2D poden axudar na xestión do almacenamento e no mantemento de rexistros. As tapas con códigos de cores son útiles para facilitar a identificación.
• Mantemento axeitado do almacenamento- Para garantir que non se perdan células, os recipientes de almacenamento deben monitorizar constantemente a temperatura e os niveis de nitróxeno líquido. Deberían instalarse alarmas para alertar os usuarios dos erros.

Precaucións de seguridade

O nitróxeno líquido converteuse en práctica común na investigación moderna, pero conleva o risco de lesións graves se se usa incorrectamente.

Débese usar o equipo de protección individual (EPI) axeitado para minimizar o risco de conxelacións, queimaduras e outros incidentes adversos ao manipular nitróxeno líquido. Usar

• Luvas crioxénicas
• Bata de laboratorio
• Pantalla facial completa resistente aos impactos que tamén cobre o pescozo
• Zapatos pechados
• Mandil de plástico resistente ás salpicaduras

Os refrixeradores de nitróxeno líquido deben colocarse en zonas ben ventiladas para minimizar o risco de asfixia: o nitróxeno que se escapa vaporízase e despraza o osíxeno atmosférico. Os grandes almacéns deben ter sistemas de alarma por baixo contido de osíxeno.

O ideal é traballar en parellas cando se manipula nitróxeno líquido e debería prohibirse o seu uso fóra do horario laboral normal.

Crioviales para axudar no seu fluxo de traballo

A empresa Suzhou Ace Biomedical ofrece unha ampla selección de produtos que satisfán as súas necesidades de criopreservación para diferentes tipos de células. A súa carteira inclúe unha gama de tubos, así como unha gama de criofrascos estériles.

Os nosos criofrascos son:

• Tapón de rosca de laboratorio 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, frascos crioxénicos, criotubo de fondo cónico con xunta

  ● Especificación de 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, con ou sen faldón
  ● Deseño cónico ou autoportante, estéril ou non estéril dispoñible
  ● Os tubos con tapa de rosca están feitos de polipropileno de grao médico
  ● Os frascos de criotubos de PP pódense conxelar e desconxelar repetidamente
  ● O deseño da tapa externa pode reducir a probabilidade de contaminación durante o tratamento da mostra.
  ● Tubos crioxénicos con tapa de rosca Roscas universais para o seu uso
  ● Os tubos axústanse á maioría dos rotores comúns
  ● Os tubos crioxénicos con xunta tórica serven para caixas conxeladoras estándar de 1 polgada e 2 polgadas, 48 ​​pozos, 81 pozos, 96 pozos e 100 pozos
  ● Autoclavable a 121 °C e conxelable a -86 °C

  Nº DE PEZA	MATERIAL	VOLUME	CAPCOR	PCS/BOLSA	BOLSAS/ESTOXAS
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Negro, amarelo, azul, vermello, morado, branco	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Negro, amarelo, azul, vermello, morado, branco	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Negro, amarelo, azul, vermello, morado, branco	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Negro, amarelo, azul, vermello, morado, branco	500	10