Cryotubessont couramment utilisés pour le stockage cryogénique de lignées cellulaires et d'autres matériaux biologiques critiques, dans des Dewars remplis d'azote liquide.

La conservation réussie des cellules dans l'azote liquide implique plusieurs étapes. Bien que le principe de base soit une congélation lente, la technique exacte employée dépend du type de cellule et du cryoprotecteur utilisé. Plusieurs considérations de sécurité et bonnes pratiques sont à prendre en compte lors du stockage de cellules à des températures aussi basses.

Cet article vise à donner un aperçu de la manière dont les cryotubes sont stockés dans l'azote liquide.

Que sont les cryotubes

Les cryotubes sont de petits flacons fermés conçus pour conserver des échantillons liquides à des températures extrêmement basses. Ils empêchent les cellules conservées dans le cryoprotecteur d'entrer en contact direct avec l'azote liquide, minimisant ainsi le risque de fractures cellulaires tout en bénéficiant de l'effet rafraîchissant extrême de l'azote liquide.

Les flacons sont généralement disponibles dans une gamme de volumes et de modèles : ils peuvent être filetés intérieurement ou extérieurement, avec un fond plat ou arrondi. Des formats stériles et non stériles sont également disponibles.

Qui utiliseCyroviauxpour stocker les cellules dans l'azote liquide

Une gamme de laboratoires du NHS et privés, ainsi que des instituts de recherche spécialisés dans la banque de sang de cordon, la biologie des cellules épithéliales, l'immunologie et la biologie des cellules souches utilisent des cryotubes pour cryoconserver les cellules.

Les cellules conservées de cette manière comprennent les cellules B et T, les cellules CHO, les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques, les hybridomes, les cellules intestinales, les macrophages, les cellules souches et progénitrices mésenchymateuses, les monocytes, le myélome, les cellules NK et les cellules souches pluripotentes.

Aperçu du stockage des cryotubes dans l'azote liquide

La cryoconservation est un procédé qui préserve les cellules et autres structures biologiques en les refroidissant à très basse température. Les cellules peuvent être conservées dans l'azote liquide pendant des années sans perte de viabilité. Voici un aperçu des procédures employées.

Préparation des cellules

La méthode exacte de préparation des échantillons varie selon le type cellulaire, mais en général, les cellules sont collectées et centrifugées pour former un culot riche en cellules. Ce culot est ensuite remis en suspension dans le surnageant mélangé à un cryoprotecteur ou à un milieu de cryoconservation.

Milieu de cryoconservation

Ce milieu est utilisé pour préserver les cellules dans les environnements à basse température auxquels elles seront soumises en inhibant la formation de cristaux intra et extracellulaires, et donc la mort cellulaire. Son rôle est de fournir un environnement sûr et protecteur aux cellules et aux tissus pendant les processus de congélation, de stockage et de décongélation.

Un milieu tel que du plasma frais congelé (PFC), une solution de plasmalyte hépariné ou des solutions sans sérum et sans composants animaux est mélangé à des cryoprotecteurs tels que le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou le glycérol.

Le culot d'échantillon reliquéfié est réparti en aliquotes dans des cryotubes en polypropylène tels queFlacons de stockage cryogéniques de la société Suzhou Ace Biomedical.

Il est important de ne pas trop remplir les cryotubes car cela augmenterait le risque de fissuration et la libération possible du contenu (1).

Taux de congélation contrôlé

En général, une vitesse de congélation lente et contrôlée est utilisée pour la cryoconservation réussie des cellules.

Une fois les échantillons aliquotés dans des flacons cryogéniques, ils sont placés sur de la glace humide ou dans un réfrigérateur à 4 °C et la congélation démarre dans les 5 minutes. En règle générale, le refroidissement des cellules se fait à une vitesse de -1 à -3 par minute (2). Ce refroidissement est réalisé à l'aide d'un refroidisseur programmable ou en plaçant les flacons dans une boîte isotherme placée dans un congélateur à température contrôlée de -70 °C à -90 °C.

Transfert à l'azote liquide

Les flacons cryogéniques congelés sont ensuite transférés dans un réservoir d'azote liquide pour des durées indéterminées à condition qu'une température inférieure à -135℃ soit maintenue.

Ces températures ultra-basses peuvent être obtenues par immersion dans l’azote en phase liquide ou vapeur.

Phase liquide ou phase vapeur ?

Le stockage dans l'azote en phase liquide est connu pour maintenir la température froide avec une constance absolue, mais il n'est souvent pas recommandé pour les raisons suivantes :

• La nécessité de grands volumes (épaisseur) d'azote liquide représente un danger potentiel. Les risques de brûlures ou d'asphyxie sont réels.
• Cas documentés de contamination croisée par des agents infectieux tels que l'aspergillus, l'hépatite B et la propagation virale via le milieu d'azote liquide (2,3)
• Risque de fuite d'azote liquide dans les flacons lors de l'immersion. Une fois retiré du stockage et réchauffé à température ambiante, l'azote se dilate rapidement. Par conséquent, le flacon peut se briser lorsqu'il est retiré du stockage d'azote liquide, créant un danger dû à la projection de débris et à l'exposition au contenu (1, 4).

Pour ces raisons, le stockage à ultra-basse température se fait généralement sous azote en phase vapeur. Lorsque les échantillons doivent être stockés en phase liquide, il est conseillé d'utiliser des tubes cryoflex spécialisés.

L'inconvénient de la phase vapeur est qu'un gradient de température vertical peut se produire, entraînant des fluctuations de température comprises entre -135 °C et -190 °C. Cela nécessite une surveillance attentive et diligente des niveaux d'azote liquide et des variations de température (5).

De nombreux fabricants recommandent que les cryotubes soient adaptés au stockage jusqu'à -135℃ ou à une utilisation en phase vapeur uniquement.

Décongélation de vos cellules cryoconservées

La décongélation est une procédure stressante pour une culture congelée. Une manipulation et une technique appropriées sont nécessaires pour garantir une viabilité, une récupération et une fonctionnalité optimales des cellules. Les protocoles de décongélation exacts dépendent des types cellulaires. Cependant, une décongélation rapide est considérée comme la norme pour :

• Diminuer tout impact sur la récupération cellulaire
• Aide à réduire le temps d'exposition aux solutés présents dans le milieu de congélation
• Minimiser les dommages causés par la recristallisation de la glace

Les bains-marie, les bains à billes ou les instruments automatisés spécialisés sont couramment utilisés pour décongeler les échantillons.

Le plus souvent, une lignée cellulaire est décongelée à la fois pendant 1 à 2 minutes, en la faisant tourner doucement dans un bain-marie à 37 °C jusqu'à ce qu'il ne reste qu'un petit peu de glace dans le flacon avant de les laver dans un milieu de croissance préchauffé.

Pour certaines cellules comme les embryons de mammifères, un réchauffement lent est essentiel à leur survie.

Les cellules sont maintenant prêtes pour la culture cellulaire, l’isolement cellulaire ou, dans le cas des cellules souches hématopoïétiques, des études de viabilité pour garantir l’intégrité des cellules souches du donneur avant la thérapie myéloablative.

Il est courant de prélever de petites quantités de l'échantillon prélavé utilisé pour effectuer une numération cellulaire afin de déterminer les concentrations cellulaires nécessaires à la mise en culture. Vous pouvez ensuite évaluer les résultats des procédures d'isolement cellulaire et déterminer la viabilité cellulaire.

Meilleures pratiques pour le stockage des cryotubes

La réussite de la cryoconservation des échantillons stockés dans des cryotubes dépend de nombreux éléments du protocole, notamment d'un stockage et d'une tenue de registres appropriés.

• Diviser les cellules entre les emplacements de stockage– Si les volumes le permettent, répartissez les cellules entre les flacons et stockez-les dans des endroits séparés pour réduire le risque de perte d’échantillon en raison de pannes d’équipement.
• Prévenir la contamination croisée– Optez pour des flacons cryogéniques stériles à usage unique ou autoclavez avant utilisation ultérieure
• Utilisez des flacons de taille appropriée pour vos cellules– Les flacons sont disponibles dans une gamme de volumes allant de 1 à 5 ml. Évitez de trop remplir les flacons pour réduire le risque de fissures.
• Sélectionnez des flacons cryogéniques à filetage interne ou externe– Les flacons à filetage interne sont recommandés par certaines universités pour des raisons de sécurité – ils peuvent également empêcher la contamination lors du remplissage ou lors du stockage dans l’azote liquide.
• Prévenir les fuites- Utilisez des joints bi-injectés moulés dans le bouchon à vis ou des joints toriques pour éviter les fuites et la contamination.
• Utilisez des codes-barres 2D et étiquetez les flacons– Pour assurer la traçabilité, les flacons dotés de larges zones d'écriture permettent un étiquetage adéquat de chaque flacon. Les codes-barres 2D facilitent la gestion du stockage et la tenue des registres. Les bouchons à code couleur facilitent l'identification.
• Entretien adéquat du stockagePour éviter toute perte de cellules, les cuves de stockage doivent surveiller en permanence la température et les niveaux d'azote liquide. Des alarmes doivent être installées pour alerter les utilisateurs en cas d'erreur.

Précautions de sécurité

L’azote liquide est devenu une pratique courante dans la recherche moderne, mais comporte un risque de blessures graves en cas d’utilisation incorrecte.

Un équipement de protection individuelle (EPI) approprié doit être porté afin de minimiser les risques de gelures, de brûlures et d'autres incidents indésirables lors de la manipulation de l'azote liquide.

• Gants cryogéniques
• blouse de laboratoire
• Écran facial complet résistant aux chocs qui couvre également le cou
• Chaussures fermées
• Tablier en plastique résistant aux éclaboussures

Les réfrigérateurs à azote liquide doivent être placés dans des zones bien ventilées afin de minimiser le risque d'asphyxie : l'azote s'échappant se vaporise et remplace l'oxygène atmosphérique. Les entrepôts à grand volume doivent être équipés de systèmes d'alarme en cas de manque d'oxygène.

Travailler en binôme lors de la manipulation de l'azote liquide est idéal et son utilisation en dehors des heures normales de travail doit être interdite.

Cryotubes pour soutenir votre flux de travail

L'entreprise Suzhou Ace Biomedical propose une large gamme de produits répondant à vos besoins de cryoconservation pour différents types de cellules. Notre gamme comprend une gamme de tubes et de cryotubes stériles.

Nos cryotubes sont :

• Flacons cryogéniques à fond conique avec bouchon à vis de laboratoire de 0,5 ml, 1,5 ml et 2 ml, cryotubes avec joint

  ● Spécifications 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, avec jupe ou sans jupe
  ● Conception conique ou autoportante, stérile ou non stérile, toutes deux disponibles
  ● Les tubes à bouchon à vis sont fabriqués en polypropylène de qualité médicale
  ● Les flacons cryotubes en PP peuvent être congelés et décongelés à plusieurs reprises
  ●La conception du capuchon externe peut réduire la probabilité de contamination pendant le traitement des échantillons.
  ● Tubes cryogéniques à bouchon à vis Filetage universel pour une utilisation
  ● Les tubes s'adaptent à la plupart des rotors courants
  ● Les tubes à joint torique pour tubes cryogéniques s'adaptent aux boîtes de congélation standard de 1 pouce et 2 pouces, 48 ​​puits, 81 puits, 96 puits et 100 puits
  ● Autoclavable à 121°C et congelable à -86°C

  PIÈCE N°	MATÉRIEL	VOLUME	CAPUCHONCOULEUR	PCS/SAC	SACS/ÉTUIS
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Noir, jaune, bleu, rouge, violet, blanc	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Noir, jaune, bleu, rouge, violet, blanc	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Noir, jaune, bleu, rouge, violet, blanc	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Noir, jaune, bleu, rouge, violet, blanc	500	10