کرایوویالهامعمولاً برای ذخیره سازی کرایوژنیک ردههای سلولی و سایر مواد بیولوژیکی حیاتی، در محفظههای پر از نیتروژن مایع استفاده میشوند.
چندین مرحله در حفظ موفقیتآمیز سلولها در نیتروژن مایع دخیل است. در حالی که اصل اساسی انجماد آهسته است، تکنیک دقیق مورد استفاده به نوع سلول و ماده محافظ انجمادی مورد استفاده بستگی دارد. هنگام ذخیره سلولها در چنین دماهای پایینی، ملاحظات ایمنی و بهترین شیوهها باید در نظر گرفته شوند.
هدف این پست ارائه مروری بر نحوه نگهداری کرایوویالها در نیتروژن مایع است.
کرایوویال چیست؟
کرایوویالها ویالهای کوچک و دربستهای هستند که برای ذخیره نمونههای مایع در دماهای بسیار پایین طراحی شدهاند. آنها تضمین میکنند که سلولهای نگهداریشده در ماده محافظ انجماد در تماس مستقیم با نیتروژن مایع قرار نگیرند و خطر شکستگی سلولی را به حداقل برسانند، در حالی که همچنان از اثر خنککنندگی شدید نیتروژن مایع بهرهمند میشوند.
ویالها معمولاً در طیف وسیعی از حجمها و طرحها موجود هستند - میتوانند از داخل یا خارج با ته صاف یا گرد رزوه داشته باشند. قالبهای استریل و غیراستریل نیز موجود است.
چه کسی استفاده میکند؟سیروویالهابرای ذخیره سلولها در نیتروژن مایع
طیف وسیعی از آزمایشگاههای NHS و خصوصی و همچنین مؤسسات تحقیقاتی متخصص در بانکداری خون بند ناف، زیستشناسی سلولهای اپیتلیال، ایمونولوژی و زیستشناسی سلولهای بنیادی از کرایوویالها برای ذخیره سازی سلولها در شرایط انجماد استفاده میکنند.
سلولهایی که به این روش نگهداری میشوند شامل سلولهای B و T، سلولهای CHO، سلولهای بنیادی و پیشساز خونساز، هیبریدوماها، سلولهای رودهای، ماکروفاژها، سلولهای بنیادی و پیشساز مزانشیمی، مونوسیتها، میلوما، سلولهای NK و سلولهای بنیادی پرتوان هستند.
مروری بر نحوه نگهداری کرایوویالها در نیتروژن مایع
انجماد فرآیندی است که سلولها و سایر ساختارهای بیولوژیکی را با سرد کردن آنها تا دماهای بسیار پایین حفظ میکند. سلولها را میتوان سالها در نیتروژن مایع بدون از دست دادن زیستایی سلول ذخیره کرد. این خلاصهای از رویههای به کار رفته است.
آمادهسازی سلول
روش دقیق آمادهسازی نمونهها بسته به نوع سلول متفاوت خواهد بود، اما به طور کلی، سلولها جمعآوری و سانتریفیوژ میشوند تا یک پلت غنی از سلول ایجاد شود. سپس این پلت در مایع رویی مخلوط با محافظ انجماد یا یک محیط انجمادی دوباره به حالت تعلیق در میآید.
محیط کشت کرایوپرزرواسیون
این محیط کشت برای حفظ سلولها در محیطهای با دمای پایین که در معرض آن قرار میگیرند، با مهار تشکیل کریستالهای درون و برون سلولی و در نتیجه مرگ سلولی، به کار میرود. نقش آنها فراهم کردن یک محیط ایمن و محافظ برای سلولها و بافتها در طول فرآیندهای انجماد، ذخیرهسازی و ذوب است.
محیطی مانند پلاسمای تازه منجمد (FFP)، محلول پلاسمالیت هپارینه یا محلولهای بدون سرم و بدون اجزای حیوانی با مواد محافظ سرما مانند دی متیل سولفوکسید (DMSO) یا گلیسرول مخلوط میشود.
گلوله نمونه دوباره مایع شده به کرایوویالهای پلیپروپیلن مانند زیر تقسیم میشود:ویالهای ذخیرهسازی برودتی شرکت زیستپزشکی سوژو آس.
مهم است که کرایوویالها را بیش از حد پر نکنید زیرا این کار خطر ترک خوردن و احتمال آزاد شدن محتویات را افزایش میدهد (1).
نرخ انجماد کنترلشده
به طور کلی، برای انجماد موفقیتآمیز سلولها، از یک سرعت انجماد کنترلشده و آهسته استفاده میشود.
پس از اینکه نمونهها به ویالهای کرایوژنیک تقسیم شدند، روی یخ مرطوب یا در یخچال 4 درجه سانتیگراد قرار داده میشوند و فرآیند انجماد ظرف 5 دقیقه آغاز میشود. به عنوان یک راهنمای کلی، سلولها با سرعت -1 تا -3 در دقیقه خنک میشوند (2). این کار با استفاده از یک خنککننده قابل برنامهریزی یا با قرار دادن ویالها در یک جعبه عایق قرار داده شده در فریزر با سرعت کنترل شده -70 تا -90 درجه سانتیگراد انجام میشود.
انتقال به نیتروژن مایع
ویالهای کرایوژنیک منجمد سپس به مدت نامحدود به مخزن نیتروژن مایع منتقل میشوند، مشروط بر اینکه دمای آنها کمتر از -135 درجه سانتیگراد حفظ شود.
این دماهای بسیار پایین را میتوان با غوطهوری در نیتروژن فاز مایع یا بخار به دست آورد.
فاز مایع یا بخار؟
ذخیره سازی در نیتروژن فاز مایع به حفظ دمای سرد با ثبات مطلق معروف است، اما اغلب به دلایل زیر توصیه نمیشود:
- نیاز به حجم (عمق) زیادی از نیتروژن مایع که یک خطر بالقوه است. سوختگی یا خفگی ناشی از این یک خطر واقعی است.
- موارد مستند آلودگی متقاطع توسط عوامل عفونی مانند آسپرژیلوس، هپاتیت B و شیوع ویروس از طریق محیط کشت نیتروژن مایع (2،3)
- احتمال نشت نیتروژن مایع به داخل ویالها در حین غوطهوری. هنگامی که از محل نگهداری خارج شده و تا دمای اتاق گرم میشود، نیتروژن به سرعت منبسط میشود. در نتیجه، ویال ممکن است هنگام خارج شدن از محل نگهداری نیتروژن مایع خرد شود و خطری از پرتاب ذرات و قرار گرفتن در معرض محتویات ایجاد کند (1، 4).
به همین دلایل، ذخیرهسازی در دمای بسیار پایین معمولاً در نیتروژن فاز بخار انجام میشود. هنگامی که نمونهها باید در فاز مایع ذخیره شوند، باید از لولههای مخصوص کرایوفلکس استفاده شود.
نکته منفی در مورد فاز بخار این است که ممکن است یک گرادیان دمایی عمودی رخ دهد که منجر به نوسانات دما بین -135℃ و -190℃ میشود. این امر مستلزم نظارت دقیق و موشکافانه بر سطح نیتروژن مایع و تغییرات دما است (5).
بسیاری از تولیدکنندگان توصیه میکنند که کرایوویالها برای نگهداری تا دمای ۱۳۵- درجه سانتیگراد یا فقط برای استفاده در فاز بخار مناسب هستند.
ذوب کردن سلولهای منجمد شده
روش ذوب کردن برای یک کشت منجمد استرسزا است و برای اطمینان از زنده ماندن، بازیابی و عملکرد بهینه سلولها، به روش و مدیریت صحیح نیاز است. پروتکلهای دقیق ذوب کردن به انواع خاص سلول بستگی دارد. با این حال، ذوب کردن سریع برای موارد زیر استاندارد در نظر گرفته میشود:
- کاهش هرگونه تأثیر بر بهبودی سلولی
- به کاهش زمان قرار گرفتن در معرض املاح موجود در محیط انجماد کمک کنید
- با تبلور مجدد یخ، هرگونه آسیب را به حداقل برسانید
حمامهای آب، حمامهای مهرهای یا ابزارهای خودکار تخصصی معمولاً برای ذوب کردن نمونهها استفاده میشوند.
اغلب، یک رده سلولی به مدت ۱ تا ۲ دقیقه، با چرخاندن آرام در حمام آب ۳۷ درجه سانتیگراد، ذوب میشود تا زمانی که فقط مقدار کمی یخ در ویال باقی بماند و سپس در محیط کشت از قبل گرم شده شسته شوند.
برای برخی سلولها مانند جنین پستانداران، گرم شدن آهسته برای بقای آنها ضروری است.
اکنون سلولها برای کشت سلولی، جداسازی سلول یا در مورد سلولهای بنیادی خونساز، مطالعات زیستپذیری برای تضمین سلامت سلولهای بنیادی اهداکننده قبل از درمان میلوابلتیو آماده هستند.
معمولاً برای انجام شمارش سلولی و تعیین غلظت سلولها جهت کشت در محیط کشت، از نمونههای از پیش شسته شده، نمونههای کوچکی گرفته میشود. سپس میتوانید نتایج روشهای جداسازی سلول را ارزیابی کرده و میزان زنده ماندن سلولها را تعیین کنید.
بهترین روشها برای نگهداری کرایوویالها
نگهداری موفقیتآمیز نمونههای ذخیرهشده در کرایوویالها به عوامل زیادی در پروتکل، از جمله ذخیرهسازی مناسب و ثبت سوابق، بستگی دارد.
- تقسیم سلولها بین مکانهای ذخیرهسازی– در صورت امکان، سلولها را بین ویالها تقسیم کرده و آنها را در مکانهای جداگانه نگهداری کنید تا خطر از دست رفتن نمونه به دلیل خرابی تجهیزات کاهش یابد.
- جلوگیری از آلودگی متقابل- قبل از استفادههای بعدی، از ویالهای استریل کرایوژنیک یکبار مصرف یا اتوکلاو استفاده کنید.
- از ویالهای با اندازه مناسب برای سلولهای خود استفاده کنید– ویالها در حجمهای مختلف بین ۱ تا ۵ میلیلیتر عرضه میشوند. برای کاهش خطر ترک خوردن، از پر کردن بیش از حد ویالها خودداری کنید.
- ویالهای کرایوژنیک با رزوه داخلی یا خارجی را انتخاب کنید– برخی دانشگاهها به دلیل اقدامات ایمنی، ویالهای دارای رزوه داخلی را توصیه میکنند – همچنین میتوانند از آلودگی در حین پر کردن یا هنگام نگهداری در نیتروژن مایع جلوگیری کنند.
- جلوگیری از نشت- برای جلوگیری از نشت و آلودگی، از آببندهای دو تزریقی که درون درپوش پیچی یا حلقههای اورینگ قالبگیری شدهاند، استفاده کنید.
- از بارکدهای دوبعدی و برچسبهای ویالها استفاده کنید– برای اطمینان از قابلیت ردیابی، ویالهایی با نواحی نوشتاری بزرگ، امکان برچسبگذاری مناسب هر ویال را فراهم میکنند. بارکدهای دوبعدی میتوانند به مدیریت ذخیرهسازی و ثبت سوابق کمک کنند. درپوشهای دارای کد رنگی برای شناسایی آسانتر مفید هستند.
- نگهداری مناسب انبار- برای اطمینان از عدم از بین رفتن سلولها، مخازن ذخیرهسازی باید دائماً دما و سطح نیتروژن مایع را کنترل کنند. باید آلارمهایی برای هشدار به کاربران در صورت بروز خطا نصب شوند.
اقدامات احتیاطی ایمنی
نیتروژن مایع در تحقیقات مدرن به روشی رایج تبدیل شده است، اما در صورت استفاده نادرست، خطر آسیب جدی را به همراه دارد.
برای به حداقل رساندن خطر سرمازدگی، سوختگی و سایر حوادث نامطلوب هنگام کار با نیتروژن مایع، باید از تجهیزات حفاظت فردی (PPE) مناسب استفاده شود.
- دستکشهای برودتی
- روپوش آزمایشگاهی
- شیلد محافظ تمام صورت مقاوم در برابر ضربه که گردن را نیز پوشش میدهد
- کفشهای جلو بسته
- پیش بند پلاستیکی ضد آب
یخچالهای نیتروژن مایع باید در مناطقی با تهویه مناسب قرار داده شوند تا خطر خفگی به حداقل برسد - نیتروژن فرار شده تبخیر شده و جایگزین اکسیژن اتمسفر میشود. فروشگاههای با حجم زیاد باید دارای سیستمهای هشدار کمبود اکسیژن باشند.
کار کردن به صورت دو نفره هنگام کار با نیتروژن مایع ایدهآل است و استفاده از آن خارج از ساعات کاری معمول باید ممنوع باشد.
کرایویالها برای پشتیبانی از گردش کار شما
شرکت زیستپزشکی سوژو آس (Suzhou Ace Biomedical) طیف گستردهای از محصولات را ارائه میدهد که نیازهای شما را برای نگهداری انجمادی انواع مختلف سلولها برآورده میکند. این مجموعه شامل طیف وسیعی از لولهها و همچنین طیف وسیعی از کرایوویالهای استریل است.
کرایوویالهای ما عبارتند از:
-
درپوش پیچی آزمایشگاهی 0.5 میلیلیتر 1.5 میلیلیتر 2.0 میلیلیتر ویالهای کرایوژنیک کرایوویال، لوله کرایوژنیک ته مخروطی با واشر
● مشخصات 0.5 میلیلیتر، 1.5 میلیلیتر، 2.0 میلیلیتر، با دامن یا بدون دامن
● طراحی مخروطی یا خودایستا، استریل یا غیر استریل هر دو در دسترس هستند
● لولههای درپوش پیچی از پلیپروپیلن گرید پزشکی ساخته شدهاند
● ویالهای کریوتیوب PP را میتوان بارها و بارها منجمد و ذوب کرد
● طراحی درپوش خارجی میتواند احتمال آلودگی را در طول پردازش نمونه کاهش دهد.
● لولههای برودتی پیچدار با رزوههای پیچی جهانی برای استفاده
● لولهها با اکثر روتورهای رایج سازگار هستند
● لولههای اورینگی برودتی مناسب برای جعبههای فریزر استاندارد ۱ و ۲ اینچی، ۴۸ چاه، ۸۱ چاه، ۹۶ چاه و ۱۰۰ چاه
● قابل اتوکلاو تا دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد و قابل انجماد تا دمای ۸۶- درجه سانتیگرادشماره قطعه
مواد
حجم
کلاهرنگ
رایانههای شخصی/کیف
کیف/جعبه
ACT05-BL-N
PP
0.5 میلی لیتر
مشکی، زرد، آبی، قرمز، بنفش، سفید
۵۰۰
10
ACT15-BL-N
PP
۱.۵ میلیلیتر
مشکی، زرد، آبی، قرمز، بنفش، سفید
۵۰۰
10
ACT15-BL-شمال غربی
PP
۱.۵ میلیلیتر
مشکی، زرد، آبی، قرمز، بنفش، سفید
۵۰۰
10
ACT20-BL-N
PP
۲.۰ میلیلیتر
مشکی، زرد، آبی، قرمز، بنفش، سفید
۵۰۰
10
زمان ارسال: ۲۷ دسامبر ۲۰۲۲