KriobiolakZelula-lerroak eta beste material biologiko kritiko batzuk kriogenikoki biltegiratzeko erabiltzen dira, nitrogeno likidoz betetako dewar-etan.

Zelulak nitrogeno likidoan arrakastaz kontserbatzeko hainbat etapa daude. Oinarrizko printzipioa izozte motela den arren, erabilitako teknika zehatza zelula motaren eta erabilitako kriobabeslearen araberakoa da. Hainbat segurtasun-kontu eta jardunbide egoki hartu behar dira kontuan zelulak tenperatura hain baxuetan gordetzerakoan.

Mezu honen helburua kriobiolak nitrogeno likidoan nola gordetzen diren azaltzea da.

Zer dira kriobiolak?

Kriobiolak tenperatura oso baxuetan lagin likidoak gordetzeko diseinatutako tapoidun ontzi txikiak dira. Ziurtatzen dute kriobabeslean kontserbatutako zelulak nitrogeno likidoarekin kontaktu zuzenean ez jartzea, zelulen haustura arriskua minimizatuz, nitrogeno likidoaren hozte-efektu muturrekoaz baliatuz.

Botilak normalean bolumen eta diseinu askotan daude eskuragarri: barne edo kanpo hariztadura izan dezakete, hondo lauak edo biribilduak izanik. Formatu esterilak eta ez-esterilak ere eskuragarri daude.

Nork erabiltzen duZirobialakZelulak nitrogeno likidoan gordetzeko

NHSko eta laborategi pribatu ugarik, baita zilbor-hesteetako odolaren bankuan, zelula epitelialen biologian, immunologian eta zelula amen biologian espezializatutako ikerketa-erakundeek ere, kriobiolak erabiltzen dituzte zelulak kriokontserbatzeko.

Modu honetan kontserbatutako zelulen artean daude B eta T zelulak, CHO zelulak, zelula ama eta progenitore hematopoietikoak, hibridomak, hesteetako zelulak, makrofagoak, zelula ama eta progenitore mesenkimalak, monozitoak, mieloma, NK zelulak eta zelula ama pluripotenteak.

Kriobiolak nitrogeno likidoan nola gorde behar diren ikuspegi orokorra

Kriokontserbazioa zelulak eta bestelako egitura biologikoak tenperatura oso baxuetan hoztuz kontserbatzen dituen prozesu bat da. Zelulak nitrogeno likidoan gorde daitezke urteetan zehar, zelulen bideragarritasuna galdu gabe. Hau da erabilitako prozeduren laburpena.

Zelulen prestaketa

Laginak prestatzeko metodo zehatza zelula motaren araberakoa izango da, baina, oro har, zelulak bildu eta zentrifugatu egiten dira zelulaz aberatsa den pellet bat sortzeko. Ondoren, pellet hau kriobabesle edo kriokontserbazio-ingurune batekin nahastutako gainnadantean berriro esekitzen da.

Kriokontserbazio-euskarria

Ingurune hau zelulak tenperatura baxuko inguruneetan kontserbatzeko erabiltzen da, zelula barruko eta kanpoko kristalen eraketa eta, beraz, zelulen heriotza inhibituz. Haien eginkizuna zelula eta ehunentzat ingurune seguru eta babesgarria eskaintzea da izozte, biltegiratze eta desizozte prozesuetan.

Plasma fresko izoztua (FFP), heparinizatutako plasmalitoen disoluzioa edo serumik gabeko eta animalia-osagairik gabeko disoluzioak bezalako ingurune bat dimetil sulfoxidoa (DMSO) edo glizerina bezalako kriobabesleekin nahasten da.

Berriz likidotutako lagin-pelleta polipropilenozko kriobioletan banatzen da, hala nolaSuzhou Ace Biomedical enpresaren biltegiratze kriogenikoko botilak.

Garrantzitsua da kriobiolak gehiegi ez betetzea, horrek pitzadurak eta edukia askatzeko arriskua handituko bailuke (1).

Kontrolatutako izozte-tasa

Oro har, zelulen kriokontserbazio arrakastatsua lortzeko, izozte-abiadura motela eta kontrolatua erabiltzen da.

Laginak fial kriogenikoetan zatitu ondoren, izotz hezearen gainean edo 4 ℃-ko hozkailu batean jartzen dira eta izozteko prozedura 5 minututan hasten da. Oro har, zelulak minutuko -1etik -3ra bitarteko abiaduran hozten dira (2). Horretarako, hozkailu programagarri bat erabiltzen da edo fialak –70 °C-tik –90 °C-ra bitarteko abiadura kontrolatuko izozkailu batean jarritako kaxa isolatu batean jartzen dira.

Nitrogeno likidora transferitzea

Izoztutako kriogeniko-ontziok nitrogeno likidozko depositu batera eramaten dira denbora mugagabean, baldin eta -135 ℃-tik beherako tenperatura mantentzen bada.

Tenperatura ultra-baxu hauek nitrogeno likidoan edo lurrun-fasean murgilduz lor daitezke.

Likido edo lurrun fasea?

Nitrogeno fase likidoan biltegiratzeak tenperatura hotza koherentzia osoarekin mantentzen duela ezagutzen da, baina askotan ez da gomendatzen honako arrazoi hauengatik:

• Nitrogeno likidoaren bolumen (sakonera) handiak behar izatea arrisku potentziala da. Honek eragindako erredurak edo itotzea arrisku erreala da.
• Aspergillus, B hepatitisa eta nitrogeno likidoaren bidezko birusen hedapena bezalako agente infekziosoen bidezko kutsadura gurutzatuaren kasu dokumentatuak (2,3)
• Murgiltzean nitrogeno likidoa flaskoetan isurtzeko aukera. Biltegitik atera eta giro-tenperaturara berotzen denean, nitrogenoa azkar hedatzen da. Ondorioz, flaskoa hautsi egin daiteke nitrogeno likidoaren biltegitik ateratzean, eta horrek arriskua sortzen du bai hegan dabiltzan hondakinengatik, bai edukiaren eraginpean egoteagatik (1, 4).

Arrazoi hauengatik, tenperatura ultra-baxuko biltegiratzea ohikoena nitrogeno fase lurrunkorrean da. Laginak fase likidoan gorde behar direnean, hodi krioflex espezializatuak erabili behar dira.

Lurrun-fasearen alde txarra da tenperatura-gradiente bertikal bat gerta daitekeela, eta horrek -135 ℃ eta -190 ℃ arteko tenperatura-gorabeherak eragin ditzakeela. Horrek nitrogeno likidoaren mailen eta tenperatura-aldaketen jarraipen zaindua eta arduratsua eskatzen du (5).

Fabrikatzaile askok gomendatzen dute kriobiolak -135 ℃-raino biltegiratzeko edo lurrun-fasean soilik erabiltzeko egokiak direla.

Zure zelula kriokontserbatuak desizoztea

Desizozte-prozedura estresagarria da izoztutako kultura batentzat, eta manipulazio eta teknika egokiak behar dira zelulen bideragarritasun, berreskurapen eta funtzionaltasun optimoak bermatzeko. Desizozteko protokolo zehatzak zelula mota espezifikoen araberakoak izango dira. Hala ere, desizozte azkarra estandartzat hartzen da honako hauetarako:

• Murriztu zelulen berreskurapenean duen edozein eragin
• Izozte-euskarrian dauden solutuen esposizio-denbora murrizten laguntzen du
• Izotzaren birkristaltzearen bidezko kalteak minimizatu

Ur-bainuak, perla-bainuak edo tresna automatizatu espezializatuak erabiltzen dira normalean laginak desizozteko.

Gehienetan zelula-lerro bana desizozten da aldi berean 1-2 minutuz, 37 ℃-ko ur-bainu batean astiro-astiro irabiatuz, flaskoan izotz pixka bat geratu arte, eta gero, aldez aurretik berotutako hazkuntza-ingurune batean garbitu.

Ugaztunen enbrioien moduko zelula batzuentzat, berotze motela ezinbestekoa da bizirauteko.

Zelulak prest daude orain zelula-kulturarako, zelulen isolamendurako edo, zelula ama hematopoietikoen kasuan, bideragarritasun-azterketetarako, emailearen zelula amen osotasuna bermatzeko terapia mieloablatiboa egin aurretik.

Ohiko praktika da aurrez garbitutako laginaren zati txikiak hartzea zelula-kontaketa egiteko, kulturan laminatzeko zelulen kontzentrazioak zehazteko. Ondoren, zelulen isolamendu-prozeduren emaitzak ebaluatu eta zelulen bideragarritasuna zehaztu dezakezu.

Kriobiolak gordetzeko praktika onenak

Kriobioletan gordetako laginen kriokontserbazio arrakastatsua protokoloko elementu askoren araberakoa da, besteak beste, biltegiratze egokia eta erregistroak gordetzea.

• Banatu gelaxkak biltegiratze kokapenen artean– Bolumenak ahalbidetzen badu, banatu zelulak fialen artean eta gorde itzazu leku bereizietan, ekipamenduaren akatsen ondorioz lagina galtzeko arriskua murrizteko.
• Saihestu kutsadura gurutzatua– Erabili aurretik, aukeratu behin bakarrik erabiltzeko ontzi kriogeniko esterilak edo autoklabea.
• Erabili zure zeluletarako tamaina egokiko flaskoak– botilak 1 eta 5 ml arteko bolumenetan daude eskuragarri. Saihestu botilak gehiegi betetzea pitzatzeko arriskua murrizteko.
• Aukeratu barneko edo kanpoko haridun ontzi kriogenikoak– Unibertsitate batzuek barne-haridun botilak gomendatzen dituzte segurtasun neurriengatik – kutsadura ere saihestu dezakete betetzean edo nitrogeno likidoan gordetzean.
• Saihestu ihesak- Erabili tapoian edo O-eraztunetan moldatutako bi-injekzioko zigiluak, ihesak eta kutsadura saihesteko.
• Erabili 2D barra-kodeak eta etiketatu botilak– trazabilitatea bermatzeko, idazteko eremu handiak dituzten botilak botila bakoitza behar bezala etiketatzea ahalbidetzen dute. 2D barra-kodeek biltegiratze-kudeaketan eta erregistroak gordetzen lagun dezakete. Kolore-kodetutako tapoiak erabilgarriak dira identifikazioa errazteko.
• Biltegiratze mantentze egokia- Zelulak ez galtzeko, biltegiratze-ontziek etengabe kontrolatu beharko lituzkete tenperatura eta nitrogeno likidoaren mailak. Alarmak jarri beharko lirateke erabiltzaileei erroreak daudenean ohartarazteko.

Segurtasun neurriak

Nitrogeno likidoa ohiko praktika bihurtu da ikerketa modernoan, baina gaizki erabiltzen bada lesio larriak eragiteko arriskua dakar.

Nitrogeno likidoa maneiatzean izozte-hozkadak, erredurak eta bestelako gertakari kaltegarriak izateko arriskua gutxitzeko, babes pertsonaleko ekipamendu (PPE) egokia eraman behar da.

• Eskularru kriogenikoak
• Laborategiko bata
• Aurpegi osoa estaltzen duen inpaktuarekiko erresistentea den babes-pantaila, lepoa ere estaltzen duena
• Oinetako itxiak
• Zipriztinen aurkako plastikozko mantala

Nitrogeno likidozko hozkailuak ondo aireztatutako guneetan jarri behar dira itolarriaren arriskua gutxitzeko: ihes egiten duen nitrogenoak lurrundu egiten du eta atmosferako oxigenoa desplazatzen du. Bolumen handiko dendek oxigeno baxuko alarma sistemak izan behar dituzte.

Nitrogeno likidoa maneiatzen denean binaka lan egitea da aproposa, eta debekatuta egon beharko litzateke ohiko lanorduetatik kanpo erabiltzea.

Kriobiolak zure lan-fluxua laguntzeko

Suzhou Ace Biomedical enpresak zelula mota desberdinetarako kriokontserbazio beharrak asetzeko produktu sorta zabala eskaintzen du. Zorroan hodi sorta bat eta kriovial esteril sorta bat daude.

Gure kriobiolak hauek dira:

• Laborategiko torloju-tapoia 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kriogenikozko botilak Hondo konikoa duen kriotuboa juntura batekin

  ● 0.5ml, 1.5ml, 2.0ml zehaztapena, gona batekin edo gona gabe
  ● Diseinu konikoa edo autozutika, esterila edo ez-esterila eskuragarri daude
  ● Torlojuzko tapoiko hodiak polipropileno medikoz eginda daude
  ● PP Cryotube ontziak behin eta berriz izoztu eta desizoztu daitezke
  ●Kanpoko tapoiaren diseinuak laginaren tratamenduan zehar kutsadura probabilitatea murriztu dezake.
  ● Torloju-tapoiko hodi kriogenikoak Erabilerarako torloju-hari unibertsalak
  ● Hodiak errotore ohikoenetara egokitzen dira
  ● Hodi kriogenikoen o-ring hodiek 1 hazbeteko eta 2 hazbeteko, 48 putzuko, 81 putzuko, 96 putzuko eta 100 putzuko izozkailu-kutxa estandarretan sartzen dira.
  ● 121 °C-raino autoklabatu eta -86 °C-raino izoztu daiteke

  PIEZA ZENBAKIA	MATERIALA	BOLUMENA	TXAPELAKOLOREA	PCS/POLTSA	POLTSAK/KUTXA
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Beltza, Horia, Urdina, Gorria, Morea, Zuria	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Beltza, Horia, Urdina, Gorria, Morea, Zuria	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Beltza, Horia, Urdina, Gorria, Morea, Zuria	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0ML	Beltza, Horia, Urdina, Gorria, Morea, Zuria	500	10