Krüoviaalidkasutatakse tavaliselt rakuliinide ja muude kriitiliste bioloogiliste materjalide krüogeenseks säilitamiseks vedela lämmastikuga täidetud dewar-anumates.

Rakkude edukas säilitamine vedelas lämmastikus hõlmab mitut etappi. Kuigi põhiprintsiip on aeglane külmutamine, sõltub täpne kasutatav tehnika rakutüübist ja kasutatavast krüoprotektandist. Rakkude nii madalatel temperatuuridel säilitamisel tuleb arvestada mitmete ohutuskaalutluste ja parimate tavadega.

See postitus annab ülevaate krüoviaalide säilitamisest vedelas lämmastikus.

Mis on krüoviaalid?

Krüoviaalid on väikesed korgiga viaalid, mis on mõeldud vedelate proovide säilitamiseks äärmiselt madalatel temperatuuridel. Need tagavad, et krüoprotektandis säilitatud rakud ei puutu otseselt kokku vedela lämmastikuga, minimeerides rakkude purunemise ohtu, kasutades samal ajal ära vedela lämmastiku äärmuslikku jahutavat toimet.

Viaalid on tavaliselt saadaval erineva mahu ja disainiga – need võivad olla sise- või väliskeermega ning lameda või ümara põhjaga. Saadaval on ka steriilsed ja mittesteriilsed vormid.

Kes kasutabKüroviaalidrakkude hoidmiseks vedelas lämmastikus

Mitmed NHS-i ja eralaborid, samuti nabaväädivere pankadele, epiteelirakkude bioloogiale, immunoloogiale ja tüvirakkude bioloogiale spetsialiseerunud teadusasutused kasutavad rakkude krüokonserveerimiseks krüoviaale.

Sel viisil säilitatud rakkude hulka kuuluvad B- ja T-rakud, CHO-rakud, vereloome tüvi- ja eellasrakud, hübridoomid, soolerakud, makrofaagid, mesenhümaalsed tüvi- ja eellasrakud, monotsüüdid, müeloom, NK-rakud ja pluripotentsed tüvirakud.

Ülevaade krüoviaalide säilitamisest vedelas lämmastikus

Krüokonserveerimine on protsess, mille käigus säilitatakse rakke ja teisi bioloogilisi konstruktsioone, jahutades neid väga madalale temperatuurile. Rakke saab vedelas lämmastikus säilitada aastaid ilma nende elujõulisust kaotamata. See on ülevaade kasutatavatest protseduuridest.

Rakkude ettevalmistamine

Proovide valmistamise täpne meetod varieerub olenevalt rakutüübist, kuid üldiselt rakud kogutakse ja tsentrifuugitakse, et saada rakurikas pellet. Seejärel suspendeeritakse see pellet uuesti supernatandis, mis on segatud krüoprotektandi või krüokonservatsioonikeskkonnaga.

Krüokonserveerimiskeskkond

Seda keskkonda kasutatakse rakkude säilitamiseks madalatemperatuurilises keskkonnas, milles nad kokku puutuvad, pärssides rakuväliste ja -siseste kristallide teket ning seega ka rakkude surma. Nende ülesanne on pakkuda rakkudele ja kudedele ohutut ja kaitsvat keskkonda külmutamise, ladustamise ja sulatamise ajal.

Keskkond, näiteks värskelt külmutatud plasma (FFP), hepariniseeritud plasmalüüdilahus või seerumivabad, loomsete komponentideta lahused, segatakse krüoprotektantidega, näiteks dimetüülsulfoksiidiga (DMSO) või glütserooliga.

Veeldatud proovipellet jaotatakse polüpropüleenist krüoviaalidesse, näiteksSuzhou Ace'i biomeditsiiniettevõtte krüogeensed säilitusviaalid.

Krüoviaale on oluline mitte üle täita, kuna see suurendab pragunemise ja sisu võimaliku väljavoolu ohtu (1).

Kontrollitud külmumiskiirus

Üldiselt kasutatakse rakkude edukaks krüokonserveerimiseks aeglast kontrollitud külmutuskiirust.

Pärast proovide jagamist krüogeensetesse viaalidesse asetatakse need märjale jääle või 4 ℃ külmkappi ja külmutamisprotseduuri alustatakse 5 minuti jooksul. Üldise juhisena jahutatakse rakke kiirusega -1 kuni -3 minutis (2). See saavutatakse programmeeritava jahuti abil või asetades viaalid isoleeritud karpi, mis on paigutatud –70 °C kuni –90 °C kontrollitud kiirusega sügavkülmikusse.

Ülekanne vedelasse lämmastikku

Külmutatud krüogeensed viaalid viiakse seejärel määramata ajaks vedela lämmastiku paaki, tingimusel et temperatuur hoitakse alla -135 ℃.

Neid ülimadalaid temperatuure saab saavutada vedelas või aurufaasis lämmastikku kastes.

Vedel või aurfaas?

Vedelfaasi lämmastikus säilitamine on teadaolevalt külma temperatuuri absoluutse püsivuse säilitamise vahend, kuid seda ei soovitata sageli järgmistel põhjustel:

• Vajadus suure vedela lämmastiku koguse (sügavuse) järele on potentsiaalne oht. Põletused või lämbumine on reaalne oht.
• Dokumenteeritud juhtumid ristsaastumisest nakkustekitajatega nagu aspergillus, B-hepatiit ja viiruste levik vedela lämmastiku keskkonna kaudu (2, 3)
• Vedela lämmastiku lekkimise võimalus viaalidesse lekkimise ajal. Kui lämmastik hoiukohast välja võetakse ja toatemperatuurini soojendatakse, paisub see kiiresti. Seetõttu võib viaal vedela lämmastiku hoiukohast välja võttes puruneda, tekitades ohu nii lendavate prahtide kui ka sisuga kokkupuute tõttu (1, 4).

Nendel põhjustel toimub ülimadala temperatuuri säilitamine kõige sagedamini aurufaasis lämmastikus. Kui proove tuleb säilitada vedelfaasis, tuleks kasutada spetsiaalseid krüoflex-torusid.

Aurfaasi miinuseks on vertikaalne temperatuurigradient, mille tulemuseks on temperatuurikõikumised vahemikus -135 ℃ kuni -190 ℃. See nõuab vedela lämmastiku taseme ja temperatuurikõikumiste hoolikat ja hoolikat jälgimist (5).

Paljud tootjad soovitavad, et krüoviaalid sobivad säilitamiseks temperatuuril kuni -135 ℃ või ainult aurufaasis kasutamiseks.

Krüokonserveeritud rakkude sulatamine

Külmutatud kultuuri sulatamisprotseduur on stressirohke ning optimaalse elujõulisuse, taastumise ja rakkude funktsionaalsuse tagamiseks on vaja õiget käsitsemist ja tehnikat. Täpsed sulatamisprotokollid sõltuvad konkreetsest rakutüübist. Kiiret sulatamist peetakse aga standardiks järgmistel juhtudel:

• Vähendage igasugust mõju rakkude taastumisele
• Aitab vähendada külmutuskeskkonnas lahustunud ainetega kokkupuuteaega
• Minimeerige jää ümberkristalliseerumisega kaasnevaid kahjustusi

Proovide sulatamiseks kasutatakse tavaliselt veevanne, helmesvanne või spetsiaalseid automatiseeritud instrumente.

Kõige sagedamini sulatatakse üks rakuliin korraga 1-2 minutit, keerutades seda õrnalt 37 ℃ veevannis, kuni viaalis on alles vaid väike kogus jääd, enne kui need eelsoojendatud kasvukeskkonnas pestakse.

Mõnede rakkude, näiteks imetajate embrüote puhul on aeglane soojenemine nende ellujäämiseks hädavajalik.

Rakud on nüüd valmis rakukultuuriks, rakkude isoleerimiseks või vereloome tüvirakkude puhul elujõulisuse uuringuteks, et tagada doonori tüvirakkude terviklikkus enne müeloablatiivset ravi.

Tavaliselt võetakse eelnevalt pestud proovist väikesed alikvoodid, mida kasutatakse rakkude loendamiseks, et määrata rakkude kontsentratsioon kultuuris plaadistamiseks. Seejärel saate hinnata rakkude eraldamise protseduuride tulemusi ja määrata rakkude elujõulisuse.

Krüoviaalide säilitamise parimad tavad

Krüoviaalides säilitatavate proovide edukas krüokonserveerimine sõltub protokolli paljudest elementidest, sealhulgas nõuetekohasest säilitamisest ja arvestuse pidamisest.

• Jaga lahtrid salvestuskohtade vahel– Kui mahud lubavad, jagage rakud viaalide vahel ja hoidke neid eraldi kohtades, et vähendada seadmete rikete tõttu tekkivate proovide kadumise ohtu.
• Vältida ristsaastumist– Valige ühekordselt kasutatavad steriilsed krüogeensed viaalid või autoklaav enne järgmist kasutamist
• Kasutage oma rakkude jaoks sobiva suurusega viaale– viaalide maht on vahemikus 1 kuni 5 ml. Vältige viaalide ületäitmist, et vähendada pragunemise ohtu.
• Valige sise- või väliskeermega krüogeensed viaalid– Mõned ülikoolid soovitavad ohutusmeetmeteks sisekeermega viaale – need aitavad vältida ka saastumist täitmise ajal või vedelas lämmastikus hoidmisel.
• Lekke vältimine- Lekke ja saastumise vältimiseks kasutage keeratava korgi või O-rõngaste sisse vormitud kahepoolselt sissepritsega tihendeid.
• Kasutage 2D-triipkoode ja sildistage viaalid– Jälgitavuse tagamiseks võimaldavad suurte kirjutuspindadega viaalid iga viaali piisavalt märgistada. 2D-vöötkoodid aitavad hoiustamise haldamisel ja arvestuse pidamisel. Värvikoodiga korgid on kasulikud hõlpsamaks tuvastamiseks.
• Piisav hoiustamishooldus- Rakkude kadumise vältimiseks tuleks säilitusanumates pidevalt jälgida temperatuuri ja vedela lämmastiku taset. Paigaldada tuleks alarmid, mis teavitaksid kasutajaid vigadest.

Ohutusabinõud

Vedel lämmastik on tänapäevastes uuringutes muutunud tavaliseks praktikaks, kuid vale kasutamise korral kaasneb sellega tõsiste vigastuste oht.

Vedela lämmastiku käitlemisel tuleb külmakahjustuste, põletuste ja muude kahjulike õnnetuste ohu minimeerimiseks kanda sobivaid isikukaitsevahendeid.

• Krüogeensed kindad
• Laborikittel
• Löögikindel täisnäokaitse, mis katab ka kaela
• Suletud ninaga kingad
• Pritsmekindel plastpõll

Vedelat lämmastikku kasutavad külmikud tuleks paigutada hästiventileeritavatesse kohtadesse, et minimeerida lämbumisohtu – lekkinud lämmastik aurustab ja tõrjub välja atmosfäärihapniku. Suuremahulistes ladudes peaksid olema madala hapnikutaseme alarmsüsteemid.

Vedela lämmastiku käitlemisel on ideaalne töötada paarides ja selle kasutamine väljaspool tavapärast tööaega tuleks keelata.

Krüoviaalid teie tööprotsessi toetamiseks

Suzhou Ace Biomedical pakub laia valikut tooteid, mis vastavad teie krüokonserveerimisvajadustele erinevat tüüpi rakkude puhul. Portfell sisaldab nii tuube kui ka steriilseid krüoviaale.

Meie krüoviaalid on:

• Lab keeratava korgiga 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml krüoviaal krüogeensed viaalid koonilise põhjaga krüotoru tihendiga

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml spetsifikatsioon, seelikuga või ilma seelikuta
  ● Saadaval on kooniline või iseseisev disain, steriilne või mittesteriilne
  ● Keeratava korgiga tuubid on valmistatud meditsiinilisest polüpropüleenist
  ● PP krüotuubidest viaale saab korduvalt külmutada ja sulatada
  ● Välise korgi disain võib vähendada saastumise tõenäosust proovi töötlemise ajal.
  ● Keeratava korgiga krüogeensed torud Universaalsed keermed kasutamiseks
  ● Torud sobivad enamikele tavalistele rootoritele
  ● Krüogeensed o-rõngaga torud sobivad standardsetele 1-tollistele ja 2-tollistele, 48-, 81-, 96- ja 100-süvendiliste sügavkülmikukarpidele
  ● Autoklaavitav temperatuurini 121 °C ja külmutatav temperatuurini -86 °C

  OSA NR	MATERJAL	KÖIDE	ÜPPVÄRV	TK/KOTT	KOTID/KOHVIKUD
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Must, kollane, sinine, punane, lilla, valge	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Must, kollane, sinine, punane, lilla, valge	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Must, kollane, sinine, punane, lilla, valge	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Must, kollane, sinine, punane, lilla, valge	500	10