criovialesSe utilizan comúnmente para el almacenamiento criogénico de líneas celulares y otros materiales biológicos críticos, en recipientes Dewar llenos de nitrógeno líquido.

La conservación exitosa de células en nitrógeno líquido implica varias etapas. Si bien el principio básico es la congelación lenta, la técnica exacta empleada depende del tipo de célula y del crioprotector utilizado. Hay varias consideraciones de seguridad y buenas prácticas que deben tenerse en cuenta al almacenar células a temperaturas tan bajas.

Esta publicación tiene como objetivo brindar una descripción general de cómo se almacenan los crioviales en nitrógeno líquido.

¿Qué son los crioviales?

Los crioviales son pequeños viales con tapa, diseñados para almacenar muestras líquidas a temperaturas extremadamente bajas. Garantizan que las células conservadas en crioprotector no entren en contacto directo con el nitrógeno líquido, minimizando el riesgo de fracturas celulares y aprovechando al máximo el efecto refrigerante del nitrógeno líquido.

Los viales suelen estar disponibles en diversos volúmenes y diseños: pueden tener rosca interna o externa y fondo plano o redondeado. También están disponibles en formatos estériles y no estériles.

¿Quién lo usa?CyrovialsPara almacenar células en nitrógeno líquido

Una variedad de laboratorios privados y del NHS, así como instituciones de investigación especializadas en bancos de sangre del cordón umbilical, biología de células epiteliales, inmunología y biología de células madre, utilizan crioviales para criopreservar células.

Las células conservadas de esta manera incluyen células B y T, células CHO, células madre y progenitoras hematopoyéticas, hibridomas, células intestinales, macrófagos, células madre y progenitoras mesenquimales, monocitos, mieloma, células NK y células madre pluripotentes.

Descripción general de cómo almacenar crioviales en nitrógeno líquido

La criopreservación es un proceso que preserva células y otros constructos biológicos mediante su enfriamiento a temperaturas muy bajas. Las células pueden almacenarse en nitrógeno líquido durante años sin pérdida de viabilidad celular. A continuación, se presenta un resumen de los procedimientos empleados.

Preparación de células

El método exacto de preparación de las muestras varía según el tipo de célula, pero, en general, las células se recolectan y se centrifugan para formar un pellet rico en células. Este pellet se resuspende en el sobrenadante mezclado con crioprotector o un medio de criopreservación.

Medio de criopreservación

Este medio se utiliza para preservar las células en los entornos de baja temperatura a los que estarán expuestas, inhibiendo la formación de cristales intra y extracelulares y, por consiguiente, la muerte celular. Su función es proporcionar un entorno seguro y protector para las células y los tejidos durante los procesos de congelación, almacenamiento y descongelación.

Un medio como plasma fresco congelado (PFC), solución de plasmalito heparinizada o soluciones sin suero ni componentes animales se mezcla con crioprotectores como dimetilsulfóxido (DMSO) o glicerol.

El pellet de muestra relicuado se divide en alícuotas en crioviales de polipropileno comoViales de almacenamiento criogénico de la empresa Suzhou Ace Biomedical.

Es importante no llenar demasiado los crioviales ya que esto aumentará el riesgo de agrietamiento y la posible liberación del contenido (1).

Tasa de congelación controlada

En general, para la criopreservación exitosa de células se utiliza una velocidad de congelación lenta y controlada.

Tras alicuotar las muestras en viales criogénicos, se colocan en hielo húmedo o en un refrigerador a 4 °C y el proceso de congelación se inicia en 5 minutos. Como norma general, las células se enfrían a una velocidad de -1 a -3 por minuto (2). Esto se logra utilizando un enfriador programable o colocando los viales en una caja aislante dentro de un congelador de velocidad controlada de -70 °C a -90 °C.

Transferencia a nitrógeno líquido

Luego, los viales criogénicos congelados se transfieren a un tanque de nitrógeno líquido durante períodos indefinidos, siempre que se mantenga una temperatura inferior a -135 ℃.

Estas temperaturas ultrabajas se pueden obtener mediante inmersión en nitrógeno en fase líquida o vapor.

¿Fase líquida o fase de vapor?

Se sabe que el almacenamiento en nitrógeno en fase líquida mantiene la temperatura fría con absoluta consistencia, pero a menudo no se recomienda por las siguientes razones:

• La necesidad de grandes volúmenes (profundidad) de nitrógeno líquido constituye un peligro potencial. Las quemaduras o la asfixia por este motivo son un riesgo real.
• Casos documentados de contaminación cruzada por agentes infecciosos como Aspergillus, hepatitis B y propagación viral a través del medio de nitrógeno líquido (2,3)
• La posibilidad de que el nitrógeno líquido se filtre en los viales durante la inmersión. Al retirarlos del almacenamiento y calentarlos a temperatura ambiente, el nitrógeno se expande rápidamente. En consecuencia, el vial podría romperse al retirarlo del almacenamiento de nitrógeno líquido, lo que supone un riesgo tanto por la proyección de residuos como por la exposición al contenido (1, 4).

Por estas razones, el almacenamiento a temperaturas ultrabaja se realiza generalmente en nitrógeno en fase vapor. Cuando las muestras deben almacenarse en fase líquida, se deben utilizar tubos crioflexibles especializados.

La desventaja de la fase de vapor es que puede producirse un gradiente vertical de temperatura, lo que provoca fluctuaciones de temperatura entre -135 °C y -190 °C. Esto requiere un control minucioso y diligente de los niveles de nitrógeno líquido y las variaciones de temperatura (5).

Muchos fabricantes recomiendan que los crioviales sean adecuados para el almacenamiento a temperaturas de hasta -135 °C o para su uso solo en fase de vapor.

Descongelación de células criopreservadas

El procedimiento de descongelación es estresante para un cultivo congelado, y se requiere una manipulación y técnica adecuadas para garantizar la viabilidad, recuperación y funcionalidad óptimas de las células. Los protocolos exactos de descongelación dependerán de los tipos celulares específicos. Sin embargo, la descongelación rápida se considera estándar para:

• Disminuir cualquier impacto en la recuperación celular
• Ayuda a reducir el tiempo de exposición a los solutos presentes en los medios de congelación.
• Minimizar cualquier daño por recristalización del hielo.

Para descongelar muestras se utilizan habitualmente baños de agua, baños de perlas o instrumentos automatizados especializados.

Lo más frecuente es descongelar una línea celular a la vez durante 1 o 2 minutos, girándola suavemente en un baño de agua a 37 °C hasta que solo quede un poco de hielo en el vial antes de lavarlas en un medio de crecimiento precalentado.

Para algunas células, como los embriones de mamíferos, el calentamiento lento es esencial para su supervivencia.

Las células ahora están listas para el cultivo celular, el aislamiento celular o, en el caso de las células madre hematopoyéticas, estudios de viabilidad para garantizar la integridad de las células madre del donante antes de la terapia mieloablativa.

Es habitual tomar pequeñas alícuotas de la muestra prelavada utilizada para realizar un recuento celular y determinar las concentraciones celulares para su siembra en cultivo. Posteriormente, se pueden evaluar los resultados de los procedimientos de aislamiento celular y determinar la viabilidad celular.

Mejores prácticas para el almacenamiento de crioviales

La criopreservación exitosa de muestras almacenadas en crioviales depende de muchos elementos del protocolo, incluido el almacenamiento adecuado y el mantenimiento de registros.

• Dividir celdas entre ubicaciones de almacenamiento– Si los volúmenes lo permiten, divida las células entre los viales y almacénelos en lugares separados para reducir el riesgo de pérdida de muestras debido a fallas del equipo.
• Prevenir la contaminación cruzada– Opte por viales criogénicos estériles de un solo uso o autoclave antes del uso posterior
• Utilice viales de tamaño adecuado para sus células.Los viales vienen en un rango de volúmenes de entre 1 y 5 ml. Evite llenarlos en exceso para reducir el riesgo de rotura.
• Seleccione viales criogénicos con rosca interna o externaAlgunas universidades recomiendan el uso de viales con rosca interna como medida de seguridad; también pueden evitar la contaminación durante el llenado o cuando se almacenan en nitrógeno líquido.
• Prevenir fugas- Utilice sellos bi-inyectados moldeados en la tapa de rosca o en juntas tóricas para evitar fugas y contaminación.
• Utilice códigos de barras 2D y etiquete los vialesPara garantizar la trazabilidad, los viales con amplias áreas de escritura permiten etiquetar adecuadamente cada uno. Los códigos de barras 2D facilitan la gestión del almacenamiento y el registro de datos. Las tapas con código de color facilitan la identificación.
• Mantenimiento adecuado del almacenamientoPara evitar la pérdida de células, los recipientes de almacenamiento deben monitorizar constantemente la temperatura y los niveles de nitrógeno líquido. Se deben instalar alarmas para alertar a los usuarios sobre posibles errores.

Precauciones de seguridad

El nitrógeno líquido se ha convertido en una práctica común en la investigación moderna, pero conlleva el riesgo de causar lesiones graves si se utiliza incorrectamente.

Se debe usar el equipo de protección personal (EPP) adecuado para minimizar el riesgo de congelación, quemaduras y otros incidentes adversos al manipular nitrógeno líquido.

• guantes criogénicos
• bata de laboratorio
• Protector facial completo resistente a impactos que también cubre el cuello.
• Zapatos cerrados
• Delantal de plástico a prueba de salpicaduras

Los refrigeradores de nitrógeno líquido deben ubicarse en áreas bien ventiladas para minimizar el riesgo de asfixia. El nitrógeno liberado se vaporiza y desplaza el oxígeno atmosférico. Los almacenes de gran volumen deben contar con sistemas de alarma de bajo nivel de oxígeno.

Lo ideal es trabajar en parejas al manipular nitrógeno líquido y debe prohibirse su uso fuera del horario laboral normal.

Crioviales para apoyar su flujo de trabajo

La empresa Suzhou Ace Biomedical ofrece una amplia selección de productos que satisfacen sus necesidades de criopreservación para diferentes tipos de células. Su portafolio incluye una gama de tubos y crioviales estériles.

Nuestros crioviales son:

• Viales criogénicos de fondo cónico con junta y tapón de rosca de laboratorio de 0,5 ml, 1,5 ml y 2,0 ml.

  ● Especificación de 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, con faldón o sin faldón
  ● Diseño cónico o autónomo, disponible tanto estéril como no estéril.
  ● Los tubos con tapa de rosca están hechos de polipropileno de grado médico.
  ● Los viales criotubos PP se pueden congelar y descongelar repetidamente
  ●El diseño de la tapa externa puede reducir la probabilidad de contaminación durante el tratamiento de la muestra.
  ● Tubos criogénicos con tapón de rosca Roscas de rosca universales para uso
  ● Los tubos se adaptan a los rotores más comunes
  ● Los tubos de junta tórica para tubos criogénicos se adaptan a cajas de congelador estándar de 1 pulgada y 2 pulgadas, de 48 pocillos, 81 pocillos, 96 pocillos y 100 pocillos.
  ● Esterilizable en autoclave a 121 °C y congelable a -86 °C

  NÚMERO DE PIEZA	MATERIAL	VOLUMEN	TAPACOLOR	PCS/BOLSA	BOLSAS/ESTUCHES
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Negro, Amarillo, Azul, Rojo, Morado, Blanco	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Negro, Amarillo, Azul, Rojo, Morado, Blanco	500	10
  ACT15-BL-NO	PP	1,5 ml	Negro, Amarillo, Azul, Rojo, Morado, Blanco	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Negro, Amarillo, Azul, Rojo, Morado, Blanco	500	10