Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη για CSS. Για την καλύτερη εμπειρία, σας συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Στο μεταξύ, για να διασφαλίσετε συνεχής υποστήριξη, θα εμφανίσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Η σημασία της παρακολούθησης των περιβαλλοντικών δειγμάτων έχει εκτιμηθεί σε μεγάλο βαθμό από την αρχή της πανδημίας COVID-19 και ορισμένες προσπάθειες παρακολούθησης πραγματοποιούνται με τη χρήση του χρυσού προτύπου, αν και οι τεχνικές που βασίζονται στην qPCR είναι ακριβές. Οι ηλεκτροχημικοί βιοαισθητήρες DNA θα μπορούσαν να προσφέρουν δυνητικά οικονομικά αποδοτικό λύση για την παρακολούθηση περιβαλλοντικών δειγμάτων νερού σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος.Σε αυτήν την εργασία, επιδεικνύουμε την ηλεκτροχημική ανίχνευση αμπλικονίων που λαμβάνονται από φάγο Phi6 που απομονώθηκε από δείγματα νερού λίμνης (ένα δημοφιλές υποκατάστατο του SARS-CoV-2), χρησιμοποιώντας ENIG για την ολοκλήρωση των ηλεκτροδίων PCB χωρίς τροποποίηση της επιφάνειας.φύλο. Η ηλεκτροχημική απόκριση του αισθητήρα χαρακτηρίστηκε διεξοδικά για δύο θραύσματα DNA διαφορετικού μήκους (\({117}\,\hbox {bp}\) και \({503}\,\hbox {bp}\)) και το επίδραση των αλάτων στα κύρια μείγματα PCR στις αλληλεπιδράσεις μπλε του μεθυλενίου (MB)-DNA. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το μήκος των θραυσμάτων DNA καθορίζει σημαντικά την ηλεκτροχημική ευαισθησία και αποδεικνύουν σε αυτή την εργασία ότι η ικανότητα ανίχνευσης μεγάλων αμπλικονίων χωρίς καθαρισμό γέλης προϊόντων PCR είναι σημαντικό για την επιτόπια μέτρηση δειγμάτων νερού.Μια πλήρως αυτοματοποιημένη λύση για το ιικό φορτίο προμηνύεται καλά.
Η υδατογενής μετάδοση του ιού είναι γνωστή ως κίνδυνος για τη δημόσια υγεία από τη δεκαετία του 1940, με τα πρώτα στοιχεία υδατογενούς μετάδοσης της πολιομυελίτιδας και της ηπατίτιδας Ε1. Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (ΠΟΥ) έχει ταξινομήσει αρκετά υδατογενή ιικά παθογόνα μέτριας έως υψηλής σημασίας για την υγεία2.Παραδοσιακός ιός Οι μέθοδοι ανίχνευσης βασίζονται σε τεχνικές που βασίζονται σε χρυσό πρότυπο qPCR, οι οποίες είναι εξαιρετικά ευαίσθητες και ειδικές, αλλά απαιτούν εξειδικευμένο προσωπικό για δοκιμή στο εργαστήριο χρησιμοποιώντας ακριβά όργανα. Ωστόσο, σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος (LMIC) με περιορισμένους πόρους, το ανθρώπινο Οι δειγματοληπτικές δοκιμές είναι πιθανό να έχουν προτεραιότητα έναντι της περιβαλλοντικής παρακολούθησης δειγμάτων νερού. Ως εκ τούτου, απαιτούνται εναλλακτικές μέθοδοι χαμηλού κόστους για βιώσιμη, σε πραγματικό χρόνο παρακολούθηση δειγμάτων νερού και λυμάτων σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος ως έγκαιρες προειδοποιήσεις για αναδυόμενες εστίες ασθενειών. προστατεύοντάς τους έτσι από τις σοβαρές κοινωνικοοικονομικές επιπτώσεις της πανδημίας του ιού. Οι ηλεκτροχημικοί βιοαισθητήρες χαμηλού κόστους για τα νουκλεϊκά οξέα θα μπορούσαν να προσφέρουν μια πολλά υποσχόμενη πιθανή λύση σε αυτήν την ανικανοποίητη ανάγκη. Πολλοί από αυτούς τους βιοαισθητήρες DNA λειτουργούν από το γεγονός ότι συμπληρωματικοί κλώνοι DNA ακινητοποιούνται στο ηλεκτρόδιο επιφάνεια και υβριδοποίηση όταν υπάρχει μια αντίστοιχη αλληλουχία στο δείγμα. Αυτό μπορεί στη συνέχεια να μετατραπεί σε σήμα με διάφορες ηλεκτροχημικές τεχνικές χρησιμοποιώντας μεσολαβητές οξειδοαναγωγής όπως ο σίδηρος/σιδηροκυανιούχο κάλιο. Το μπλε του μεθυλενίου (MB) είναι ένα τέτοιο οξειδοαναγωγικό ενεργό μόριο, το οποίο έχει έχει αναφερθεί ότι παρεμβάλλεται σε δίκλωνο DNA (dsDNA) επιπλέον της πιο μη ειδικής σύνδεσής του με μονόκλωνο DNA5,6. Η παρεμβολή της φύσης των MB για να σχηματίσουν σύμπλοκα MB-DNA τα καθιστά δημοφιλή επιλογή ως μεσολαβητές οξειδοαναγωγής σε πολλά ηλεκτροχημικά DNA διαμορφώσεις αισθητήρα5,6,7,8,9. Αν και η παρεμβολή του MB στο DNA δεν είναι ειδική και η ειδικότητα αυτού του ηλεκτροχημικού αισθητήρα εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την καθαρότητα των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για PCR ή ισοθερμική ενίσχυση, είναι κατάλληλος για την υλοποίηση πραγματικών -Χρονική ηλεκτροχημική qPCR ή ισοθερμική ενίσχυση φθορισμού ως εναλλακτική λύση στη μέτρηση συγκέντρωσης DNA 9 . Σε μια τέτοια εφαρμογή, οι Won et al. Η επιφάνεια των ηλεκτροδίων χρυσού τροποποιήθηκε με 6-μερκαπτο-1-εξανόλη (MCH) για πραγματικό χρόνο μέτρηση αμπλικονίων PCR με MB χρησιμοποιώντας διαφορική παλμική βολταμετρία (DPV)9. Σε άλλες περιπτώσεις, οι Ramirez et al. Ανίχνευση του SARS-CoV-2 στα λύματα με αντίδραση RT-LAMP χρησιμοποιώντας MB με ηλεκτρόδια τυπωμένα με οθόνη. Έχουν επίσης γίνει ηλεκτρόδια πλατίνας χρησιμοποιούνται όπως τα in situ ηλεκτρόδια σε μια πλατφόρμα μικρορευστοποίησης PCR σχεδιασμένη να ανιχνεύει ηλεκτροχημικά αμπλικόνια κατά τις αντιδράσεις 8 . Όλες αυτές οι μελέτες απαιτούν τροποποίηση της επιφάνειας των ηλεκτροδίων, γεγονός που συνεπάγεται αυξημένο κόστος παραγωγής και λειτουργίας λόγω ειδικών απαιτήσεων αποθήκευσης για τη σταθερότητα αυτών των λειτουργικών ηλεκτροδίων.
Σχηματική ροή εργασίας για ηλεκτροχημική ανίχνευση αμπλικονίων που λαμβάνονται από συμπυκνωμένα ιικά σωματίδια σε δείγματα νερού λίμνης.
Πρόσφατα δείξαμε ηλεκτροχημική ανίχνευση αμπλικονίων SARS-CoV-2 με ηλεκτρόδια χαμηλού κόστους πλακέτας τυπωμένου κυκλώματος (PCB) βασισμένα σε DPV και κυκλική βολταμετρία (CV) που προκαλείται από την προσρόφηση συμπλεγμάτων MB-DNA στην επιφάνεια μη τροποποιημένων ηλεκτροδίων ) αλλαγές στην κορυφή τρέχον11.Αναφέρουμε ότι μακρύτερα θραύσματα DNA (N1-N2, \({943}\, \hbox) που σχηματίστηκαν χρησιμοποιώντας τους συνιστώμενους από το CDC N1 προς τα εμπρός και N2 αντίστροφα εκκινητές σε σύγκριση με μικρότερα θραύσματα {bp}\)) έδειξαν καλύτερη γραμμικότητα στην απόκριση του αισθητήρα ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) που σχηματίστηκε με χρήση σετ εκκινητών N1 προς τα εμπρός και N1. Αυτές οι μελέτες αναφέρονται χρησιμοποιώντας αραιώσεις DNA που παρασκευάστηκαν σε νερό χωρίς νουκλεάσες. Η πλατφόρμα χρησιμοποιήθηκε επίσης για την ανίχνευση του SARS-CoV -2 αμπλικόνια σε προσομοιωμένα δείγματα υγρών αποβλήτων (που ελήφθησαν από την εμφύσηση δειγμάτων ολικού RNA με RNA SARS-CoV-2). Δεδομένου ότι το RNA είναι ευαίσθητο σε διάτμηση κατά την απομόνωση και την κατάντη επεξεργασία,12,13 είναι δύσκολο να ενισχυθούν μακρύτερα θραύσματα με αυτό το ετερογενές δείγμα. Επομένως, η επίδειξη ηλεκτροχημικής ανίχνευσης του αμπλικόνιου SARS-CoV-2 στα λύματα περιορίζεται στο μικρότερο τμήμα \(72\,\hbox {bp}\) N1.
Σε αυτήν την εργασία, διερευνήσαμε τη σκοπιμότητα της ηλεκτροχημικής ανίχνευσης με βάση το ENIG PCB του φάγου Phi6 που συγκεντρώθηκε και απομονώθηκε από δείγματα νερού λίμνης (Εικ. 1). Οι φάγοι Phi6 είναι συγκρίσιμοι σε μέγεθος (80-100 nm) με τον SARS-CoV-2 και έχουν επίσης μια λιπιδική μεμβράνη και μια πρωτεΐνη ακίδας. Για αυτούς τους λόγους, ο βακτηριοφάγος Phi6 είναι ένα δημοφιλές υποκατάστατο για τον SARS-CoV-2 και άλλους παθογόνους ιούς RNA με περίβλημα14,15. Το RNA που απομονώθηκε από σωματίδια φάγου χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για τη σύνθεση cDNA ακολουθούμενο από PCR για τη λήψη δύο θραυσμάτων DNA μήκους 117 και 503 ζευγών βάσεων. Δεδομένης της πρόκλησης της ενίσχυσης θραυσμάτων \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 στην προηγούμενη εργασία μας, στοχεύουμε θραύσματα ενδιάμεσου μήκους (\(117 \,\hbox {bp}\) και \(503 \,\hbox {bp}\)), με βάση τους διαθέσιμους εκκινητές. Η ηλεκτροχημική απόκριση του αισθητήρα μελετήθηκε συστηματικά σε ένα ευρύ φάσμα συγκεντρώσεων (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) έως \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) και για τα δύο τμήματα σε Η παρουσία MB, η επίδραση του άλατος στην απόκριση του αισθητήρα έχει χαρακτηριστεί και διασταυρωθεί με φασματοφωτομετρικές μετρήσεις. Οι κύριες συνεισφορές αυτής της εργασίας είναι οι εξής:
Το μήκος του θραύσματος DNA και η παρουσία άλατος στο δείγμα επηρεάζουν έντονα την ευαισθησία.Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ηλεκτροχημική δραστηριότητα εξαρτάται από διαφορετικούς μηχανισμούς αλληλεπίδρασης του MB, του DNA και του αισθητήρα στην βολταμετρική απόκριση, ανάλογα με τη συγκέντρωση και το μήκος του DNA, με μακρύτερα θραύσματα δείχνουν υψηλότερη ευαισθησία, αν και το αλάτι έχει αρνητική επίδραση στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ MB και DNA.
Η συγκέντρωση του DNA καθορίζει τον μηχανισμό της αλληλεπίδρασης MB-DNA σε μη τροποποιημένα ηλεκτρόδια Αποδεικνύουμε ότι διαφορετικοί μηχανισμοί αλληλεπίδρασης MB-DNA εξαρτώνται από τη συγκέντρωση του DNA. Σε συγκεντρώσεις DNA κάτω από μια μικρή ποσότητα \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), παρατηρήσαμε ότι η απόκριση ηλεκτροχημικού ρεύματος προσδιορίστηκε κυρίως από την προσρόφηση του MB-DNA στο ηλεκτρόδιο, ενώ σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις Σε υψηλές συγκεντρώσεις DNA, η απόκριση ηλεκτροχημικού ρεύματος προσδιορίστηκε από τη στερική αναστολή της οξειδοαναγωγής δραστηριότητα λόγω εισαγωγής MB μεταξύ ζευγών βάσεων DNA.
Ηλεκτροχημική ανίχνευση ιικών νουκλεϊκών οξέων με βάση το ENIG PCB σε δείγματα νερού λιμνών Οι παρατηρήσεις επικυρώθηκαν με ηλεκτροχημική ανίχνευση θραυσμάτων DNA με προσθήκη \(503\,\hbox {bp}\) από Phi6 που ελήφθησαν από δείγματα νερού από τη λίμνη Powai, IIT Mumbai Campus Αποτέλεσμα φάγου.
Χαμηλό κόστος υλοποίησης και δυνατότητα ενσωμάτωσης σε πλήρως αυτοματοποιημένα συστήματα παρακολούθησης, ολιγονουκλεοτίδια ή απταμερή σε ηλεκτρόδια με μεγαλύτερη διάρκεια ζωής.
Ο φάγος Phi6 είναι ένας ιός με περίβλημα dsRNA της οικογένειας Cytoviridae που μολύνει Pseudomonas syringae. Το γονιδίωμα του φάγου Phi6 υπάρχει με τη μορφή 3 θραυσμάτων: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07 \,\hbox {Kb}\)) και L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\)) 16,17. Δεδομένου ότι ο φάγος Phi6 μολύνει ένα μη παθογόνο στέλεχος BSL-1 Pseudomonas, είναι ασφαλές να χρησιμοποιηθεί και μπορεί εύκολα να αναπτυχθεί στο εργαστήριο. Το Phi Phi6 και ο ξενιστής του Pseudomonas syringae αγοράστηκαν από το Felix d'Herelle Reference Center for Bacterial Viruses, Πανεπιστήμιο Laval, Καναδάς (οι αριθμοί καταλόγου κέντρων αναφοράς είναι HER-102 και HER-1102, αντίστοιχα) .Ο φάγος Phi6 και ο ξενιστής του αναζωογονήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κέντρου αναφοράς. Ο φάγος Phi6 καθαρίστηκε με λύση πλάκας και έκλουση για να ληφθούν οι τελικοί τίτλοι με \(\περίπου 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (μονάδες σχηματισμού πλάκας/ χιλιοστόλιτρα). Το RNA απομονώθηκε από καθαρισμένα σωματίδια φάγου χρησιμοποιώντας το GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, ένα καθαρισμένο εναιώρημα Phi6 φάγου\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) λύθηκε και το προϊόν λύσης φορτώθηκε σε στήλη spin για να επιτραπεί στο RNA να συνδεθεί στη στήλη ρητίνης. Το RNA στη συνέχεια εκλούεται στο διάλυμα έκλουσης \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) που παρέχεται από το κιτ. Υπολογίστε τη συγκέντρωση του RNA με απορρόφηση στο \(260\,\hbox {nm}\). Το RNA αποθηκεύτηκε σε κλάσματα στο \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) μέχρι περαιτέρω χρήση.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Το κιτ σύνθεσης cDNA iScript (Βιο -Rad Laboratories) χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για τη σύνθεση cDNA ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, μια αντίδραση σύνθεσης cDNA αποτελείται από 3 βήματα: εκκίνηση στο \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , αντίστροφη μεταγραφή του \({20}\,{\hbox {min}}\) στο \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), και αντίστροφη Η συσκευή εγγραφής βρίσκεται στο \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) για \({1}\,{\hbox {min }}\). Όταν εκτελέστηκε σε πήκτωμα αγαρόζης 1%, το cDNA έδειξε τρεις ζώνες που αντιστοιχούν στα αναμενόμενα τρία θραύσματα RNA (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση δύο θραυσμάτων DNA μήκους 117 και 503 bp. χρησιμοποιώντας cDNA ως πρότυπο για PCR σε θερμικό κυκλοποιητή miniPCR® mini8:
Οι εκκινητές για \(117\,\hbox {bp}\) και \(503\,\hbox {bp}\) αντιστοιχούν σε 1476-1575 νουκλεοτίδια του τμήματος Μ και 458-943 νουκλεοτίδια του τμήματος L, αντίστοιχα οξύ Όλα τα ενισχυμένα προϊόντα PCR ηλεκτροφορήθηκαν σε γέλες αγαρόζης 1% και το ενισχυμένο DNA στόχο καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ εξαγωγής γέλης GeneJET (Thermo Fisher Scientific).
Μια λίμνη στην πανεπιστημιούπολη του IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) χρησιμοποιήθηκε για την προσθήκη σωματιδίων φάγων. Το νερό της λίμνης φιλτραρίστηκε μέσω μιας μεμβράνης \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) για να αφαιρεθεί αιωρούμενα σωματίδια και, στη συνέχεια, προστέθηκε φάγος Phi6. Προσθήκη \({1}\,{\hbox {ml}}\) από \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) στο \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) φιλτραρισμένο νερό λίμνης, στο \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Ένα μικρό ποσοστό ήταν που προορίζεται για μέτρηση ιικού φορτίου με ανάλυση πλάκας. Δοκιμάσαμε δύο διαφορετικές μεθόδους για τη συμπύκνωση σωματιδίων του ιού Phi6: (1) τη μέθοδο προσρόφησης-καθίζησης υδροξειδίου του αργιλίου,19 η οποία έχει επικυρωθεί για τη συγκέντρωση αρκετών ιών RNA από περιβαλλοντικά δείγματα και (2) ) Η μέθοδος συγκέντρωσης ιού με βάση την πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) προσαρμόστηκε από τους Flood et al.20 .Δεδομένου ότι η απόδοση ανάκτησης της μεθόδου που βασίζεται σε PEG βρέθηκε να είναι καλύτερη από εκείνη της μεθόδου υδροξειδίου του αργιλίου, η μέθοδος που βασίζεται σε PEG χρησιμοποιήθηκε για τη συγκέντρωση σωματιδίων Phi6 από δείγματα νερού λίμνης.
Η μέθοδος PEG που χρησιμοποιήθηκε ήταν η εξής: PEG 8000 και \(\hbox {NaCl}\) προστέθηκαν σε δείγματα νερού λίμνης με ακίδα Phi6 για να ληφθεί 8 % PEG 8000 και \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). Τα δείγματα επωάστηκαν σε αναδευτήρα\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στο \(4700 \,\hbox {g}\) είναι \({45}\,{\hbox {min}}\). Απορρίψτε το υπερκείμενο και επαναιωρήστε το ίζημα στο \({1}\, {\hbox {ml}}\) στο ίδιο υπερκείμενο. Όλα τα πειράματα συγκέντρωσης και συγκέντρωσης ιού πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Μετά τη συμπύκνωση, ένα μικρό δείγμα κρατήθηκε για τη μέτρηση της αποτελεσματικότητας ανάκτησης με ανάλυση πλάκας. Το RNA απομονώθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως και εκλούστηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης που παρέχεται από το κιτ\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Δεδομένου ότι η συγκέντρωση RNA θα ποικίλλει από δείγμα σε δείγμα εις τριπλούν, το \({2}\,{\upmu \ Το hbox {l}}\) του RNA χρησιμοποιείται και για τα τρία ανεξάρτητα από τη συγκέντρωσή του Η σύνθεση cDNA των δειγμάτων. Η σύνθεση cDNA πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR για 35 κύκλους για την ενίσχυση των \ (117\,\hbox {bp}\) και \(503\,\hbox { bp}\) θραύσματα. Αυτά τα δείγματα αντιπροσωπεύονται ως "1:1", δηλαδή χωρίς αραίωση. Δημιουργήθηκε ένας μάρτυρας χωρίς πρότυπο (NTC) ως αρνητικός μάρτυρας, ενώ ένα cDNA που συντέθηκε χρησιμοποιώντας RNA που απομονώθηκε από καθαρισμένο φάγο δημιουργήθηκε ως πρότυπο για θετικό μάρτυρα (PC). Πραγματοποιήθηκε ποσοτική PCR (qPCR) σε όργανο Stratagene Mx3000P RT-PCR χρησιμοποιώντας Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Οι αντιδράσεις ρυθμίστηκαν εις τριπλούν όπως προηγουμένως περιγράφηκε.Το κατώφλι κύκλου (Ct) καταγράφηκε για όλα τα δείγματα. Επιπλέον, τα αραιωμένα δείγματα ήταν \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) χρησιμοποιώντας cDNA αραιωμένο 1:100 σε φιλτραρισμένο νερό λίμνης ως \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR για 35 κύκλους. Αυτά τα δείγματα αντιπροσωπεύονται ως "1:100".
Τα ηλεκτρόδια PCB κατασκευάζονται χρησιμοποιώντας μια εμπορικά διαθέσιμη, χαμηλού κόστους διαδικασία Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) χωρίς την ανάγκη πρόσθετης επίστρωσης χρυσού. Οι προδιαγραφές ηλεκτροδίων PCB ENIG περιγράφονται λεπτομερώς στην προηγούμενη εργασία μας11. Για τα ηλεκτρόδια PCB ENIG, παραδοσιακές μέθοδοι καθαρισμού ηλεκτροδίων, όπως Το διάλυμα πιράνχα ή η κυκλική βολταμετρία θειικού οξέος δεν συνιστώνται καθώς μπορεί να προκαλέσουν ξεφλούδισμα του λεπτού στρώματος χρυσού (πάχος \(\περίπου\) \(100\,\hbox {nm }\)) και να εκθέσουν τα υποκείμενα στρώματα χαλκού που είναι επιρρεπή σε διάβρωση 21, 22, 23, 24, 25. Επομένως, καθαρίστε τα ηλεκτρόδια με ένα πανί που δεν αφήνει χνούδι, βρεγμένο με IPA. Το δείγμα που θα δοκιμαστεί επωάστηκε με \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB σε \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) για εύκολη εισαγωγή. Στην προηγούμενη εργασία μας , παρατηρήσαμε ότι η ευαισθησία και η γραμμικότητα του αισθητήρα βελτιώθηκαν αυξάνοντας τη συγκέντρωση MB 11 .Με βάση τις βελτιστοποιήσεις που αναφέρθηκαν στην προηγούμενη εργασία μας, χρησιμοποιήσαμε \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB Η ηλεκτροχημική ανίχνευση του δίκλωνου DNA (ds-DNA) μπορεί να επιτευχθεί χρησιμοποιώντας ανιονικούς ή κατιονικούς παρεμβολείς. Αν και οι ανιονικοί παρεμβολείς ανιχνεύουν το DNA με καλύτερη επιλεκτικότητα, απαιτούν επώαση κατά τη διάρκεια της νύχτας, με αποτέλεσμα μεγαλύτερους χρόνους ανίχνευσης. από την άλλη πλευρά, οι κατιονικοί παρεμβολείς όπως το MB απαιτούν μικρότερους χρόνους επώασης, περίπου \({1}\,{\hbox {h}}\) για την ηλεκτροχημική ανίχνευση του ds-DNA6. Κάθε μέτρηση περιλαμβάνει τη διανομή του δείγματος που θα δοκιμαστεί στο ηλεκτρόδιο\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), στη συνέχεια καθαρίστε με ένα πανί βρεγμένο με IPA, πριν προχωρήσετε με άλλο δείγμα.μία μέτρηση.Κάθε δείγμα δοκιμάστηκε σε 5 διαφορετικά ηλεκτρόδια, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Οι μετρήσεις DPV και CV πραγματοποιήθηκαν με χρήση ποτενσιοστάτη PalmSens Sensit Smart και το λογισμικό PSTrace χρησιμοποιήθηκε για τη διαμόρφωση και τη λήψη δεδομένων ποτενσιοστάτη, συμπεριλαμβανομένων των υπολογισμών ρεύματος αιχμής. Χρησιμοποιούνται οι ακόλουθες ρυθμίσεις για μετρήσεις DPV και CV:
DPV: Χρόνος ισορροπίας = \(8\,\hbox {s}\), Βήμα τάσης = \(3\,\hbox {mV}\), Τάση παλμού = \(25\,\hbox {mV}\) , διάρκεια παλμού = \(50\,\hbox {ms}\), ρυθμός σάρωσης = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Χρόνος ισορροπίας = \(8\,\hbox {s}\), Βήμα τάσης = \(3\,\hbox {mV}\), Ρυθμός σάρωσης = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Ρεύματα αιχμής που λαμβάνονται από βολταμογράμματα DNA συμπλεγμένου με \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Λήφθηκαν βολταμογράμματα DPV και CV σε ηλεκτρόδια PCB ENIG \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB συμπλεγμένα με DNA (σε συγκεντρώσεις 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) δηλαδή 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) για \(117\,\hbox {bp}\ ) και 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) για \(503\,\hbox {bp}\)). Αντιπροσωπευτικά βολταμογράμματα φαίνονται στο Σχήμα S1 στις Συμπληρωματικές Πληροφορίες. Το Σχήμα 2 δείχνει τα αποτελέσματα των μετρήσεων DPV και CV (ρεύμα αιχμής) χρησιμοποιώντας προϊόντα PCR καθαρισμένα με γέλη. Σε σύγκριση με τις μετρήσεις CV, οι μετρήσεις DPV δείχνουν υψηλότερη ευαισθησία (ρεύμα ως συνάρτηση της συγκέντρωσης του DNA) επειδή τα χωρητικά ρεύματα φόντου στις μετρήσεις CV κρύβουν ρεύματα Faradaic 26 .Τα δεδομένα για κάθε κουτί στο κιβώτιο περιέχει μετρήσεις από 5 ηλεκτρόδια. Όλες οι μετρήσεις χρησιμοποιούν το ίδιο σύνολο ηλεκτροδίων για την αποφυγή σφαλμάτων μέτρησης λόγω διακύμανσης ηλεκτροδίου προς ηλεκτρόδιο. Παρατηρήσαμε μια αυξητική τάση στα ρεύματα αιχμής που μετρήθηκαν DPV και CV για χαμηλότερες συγκεντρώσεις DNA , μεγαλύτερο (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ σε σύγκριση με \(117) ) θραύσμα. Αυτό είναι σύμφωνο με την αναμενόμενη τάση της προσρόφησης ηλεκτροδίων που αναφέρθηκε στην προηγούμενη εργασία μας. η προσρόφηση του συμπλέγματος MB-DNA διευκολύνει τη μεταφορά φορτίου στο ηλεκτρόδιο, η οποία συμβάλλει στην αύξηση του ρεύματος αιχμής. Άλλες μελέτες έχουν δείξει την επίδραση του μεγέθους και της αλληλουχίας των ολιγονουκλεοτιδίων στην παρεμβολή MB-DNA27,28,29,30. Η γουανίνη -η περιεκτικότητα σε κυτοσίνη (GC) των δύο αμπλικονίων (\(117\,\hbox {bp}\) και \(503\,\hbox {bp}\)) ήταν περίπου 50%, υποδεικνύοντας ότι η παρατήρηση Η διαφορά οφείλεται στο μήκος του αμπλικονίου.Ωστόσο, για υψηλότερες συγκεντρώσεις DNA (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), για \(503\,\hbox {bp} \) και \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) για \(117\,\hbox {bp}\)), παρατηρούμε δύο ενισχύσεις Τα ρεύματα αιχμής των υποδοχέων μειώνονται τόσο στις μετρήσεις DPV όσο και στις μετρήσεις CV. Αυτό συμβαίνει επειδή το MB κορεστεί και παρεμβάλλεται μεταξύ ζευγών βάσεων DNA, με αποτέλεσμα τη στερική αναστολή της οξειδοαναγωγικής δραστηριότητας της αναγώγιμης ομάδας στο MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Τα άλατα που υπάρχουν στα κύρια μείγματα PCR παρεμβαίνουν στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ MB και DNA, επομένως προσθέτοντας \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) με \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB προϊόν καθαρισμένου με γέλη για τη μελέτη της επίδρασης του άλατος στην αλληλεπίδραση MB-DNA. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3, παρατηρήσαμε ότι για υψηλότερες συγκεντρώσεις DNA (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) και \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) για \(117\,\hbox {bp} \)), σε DPV και CV Η προσθήκη αλατιού δεν επηρέασε σημαντικά τις μετρήσεις (βλ. Εικόνα S2 στις Συμπληρωματικές πληροφορίες για αντιπροσωπευτικά βολταμογράμματα). χαμηλότερες συγκεντρώσεις DNA, η προσθήκη αλατιού μειώνει σημαντικά την ευαισθησία, με αποτέλεσμα να μην υπάρχει σημαντική αλλαγή στο ρεύμα με τη συγκέντρωση του DNA. Παρόμοιες αρνητικές επιδράσεις του άλατος στις αλληλεπιδράσεις και την παρεμβολή MB-DNA έχουν αναφερθεί στο παρελθόν από άλλους ερευνητές33,34.\(\hbox { Τα κατιόντα Mg}^{2+}\) συνδέονται με την αρνητική φωσφορική ραχοκοκαλιά του DNA, εμποδίζοντας έτσι την ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση μεταξύ MB και DNA. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις DNA, η στερική αναστολή των οξειδοαναγωγικών ενεργών MB έχει ως αποτέλεσμα χαμηλότερα ρεύματα αιχμής, επομένως ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις δεν επηρεάζουν σημαντικά την απόκριση του αισθητήρα. Το βασικό σημείο είναι ότι αυτός ο βιοαισθητήρας είναι καλύτερα κατάλληλος για την ανίχνευση υψηλότερων συγκεντρώσεων DNA (σπάνια \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ή υψηλότερη), για πλήρως αυτοματοποιημένη επεξεργασία περιβαλλοντικών δειγμάτων νερού, όπου ο καθαρισμός με γέλη των προϊόντων PCR ενδέχεται να μην είναι εφικτός.
Περιοχή κάτω από την καμπύλη απορρόφησης για το εύρος μήκους κύματος 600–700 \(\hbox {nm}\) για διάφορες συγκεντρώσεις DNA συμπλεγμένου με \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) με και χωρίς αλάτι (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) με και χωρίς αλάτι (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) συγκεντρώσεις DNA που αντιστοιχούν σε \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) δείγματα MB Χωρίς DNA.
Για να επαληθεύσουμε περαιτέρω τα παραπάνω αποτελέσματα, πραγματοποιήσαμε οπτικές μετρήσεις χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO). Τα δείγματα \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) χρησιμοποιήθηκαν για κάθε Μέτρηση. Η υπογραφή απορρόφησης μειώνεται με την αύξηση της συγκέντρωσης του DNA, όπως φαίνεται από την τάση της περιοχής κάτω από την καμπύλη απορρόφησης για το εύρος μήκους κύματος \(600\,\hbox {nm}\) έως \(700\,\hbox { nm}\) , όπως φαίνεται στο Σχ. 4 (φάσμα απορρόφησης φαίνεται στο Σχ. S3 στις Συμπληρωματικές Πληροφορίες). Για δείγματα με συγκεντρώσεις DNA μικρότερες από \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην πρόσληψη μεταξύ δειγμάτων που περιέχουν DNA και δειγμάτων μόνο MB (για \(503\,\hbox {bp}\) και \(117\,\hbox {bp}\ ) θραύσματα μήκους), υποδηλώνοντας την απουσία στερικής αναστολής της οξειδοαναγωγικής δραστικής ΜΒ. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις DNA, παρατηρήσαμε σταδιακή μείωση του σήματος απορρόφησης και παρατηρήσαμε μικρότερη μείωση της απορρόφησης παρουσία άλατος. Αυτά τα αποτελέσματα αποδόθηκαν σε μοριακά αλληλεπιδράσεις και στερική αναστολή με στοίβαξη βάσεων σε υβρίδια DNA. Τα αποτελέσματά μας είναι σύμφωνα με αναφορές στη βιβλιογραφία σχετικά με φασματοσκοπικές μελέτες παρεμβολής MB-DNA που συσχετίζουν την υποχρωματικότητα με μειωμένα επίπεδα ενέργειας στο \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) ηλεκτρονικές μεταβάσεις λόγω παρεμβολής Επίπεδα 36, 37, 38.
Ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης του φάγου Phi6: Προϊόντα PCR μήκους \(117\,\hbox {bp}\) και \(503\,\hbox {bp}\) από δείγματα νερού λίμνης. Δείκτης M-DNA.Έλεγχος NTC-χωρίς πρότυπο, εκκινητές που περιέχουν αντίστοιχα αμπλικόνια.Θετικός έλεγχος PC;1, 2, 3-αδιάλυτα (1:1) δείγματα αιχμηρού νερού λίμνης εις τριπλούν. Μια ζώνη είναι ορατή στο \(\περίπου 50\,\hbox {bp}\) λόγω των αχρησιμοποίητων ολιγονουκλεοτιδίων στο \(503\,\ λωρίδα hbox {bp}\).
Αξιολογήσαμε τη χρησιμότητα του αισθητήρα χρησιμοποιώντας δείγματα νερού της λίμνης Powai με φάγο Phi6. Οι συγκεντρώσεις RNA που απομονώθηκαν από δείγματα νερού με αιχμή φάγου κυμαίνονταν από 15,8–\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), ενώ αυτά που απομονώθηκαν από καθαρισμένα εναιωρήματα φάγων Το RNA εκτιμήθηκε ότι είναι \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) με αποτελεσματικότητα ανάκτησης περίπου 1 %. Το RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA και χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για PCR και qPCR. Το μέγεθος του προϊόντος επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης (Εικόνα 5) πριν από τη δοκιμή με τον αισθητήρα. Αυτά τα δείγματα δεν έχουν καθαριστεί με πήκτωμα και επομένως περιέχουν όλα τα συστατικά της PCR ως καθώς και τα αμπλικόνια που μας ενδιαφέρουν. Οι τιμές Ct που καταγράφηκαν κατά τη διάρκεια του qPCR (Πίνακας 1) αποδείχθηκε ότι συσχετίζονται με τη συγκέντρωση του RNA που απομονώθηκε από τα αντίστοιχα δείγματα με αιχμηρό νερό. Η τιμή Ct αποκαλύπτει τον αριθμό των κύκλων που απαιτούνται για το σήμα φθορισμού υπερβαίνουν το όριο ή το σήμα φόντου. Οι υψηλότερες τιμές Ct υποδεικνύουν χαμηλότερες συγκεντρώσεις προτύπου και αντίστροφα. Οι τιμές Ct των δειγμάτων NTC ήταν τόσο υψηλές όσο αναμενόταν. Η διαφορά στις τιμές \(\περίπου 3\) Ct μεταξύ ο θετικός μάρτυρας και το δείγμα δοκιμής υποδεικνύουν περαιτέρω ότι κάθε δείγμα δοκιμής έχει περίπου 1% πρότυπο σε σύγκριση με τον θετικό μάρτυρα. Έχουμε συζητήσει προηγουμένως ότι τα μεγαλύτερα αμπλικόνια οδηγούν σε καλύτερη ευαισθησία. Η ενίσχυση μακρύτερων θραυσμάτων που απομονώνονται από ετερογενή περιβαλλοντικά δείγματα είναι πρόκληση λόγω των μειονεκτημάτων χαμηλής ιικής συγκέντρωσης και αποικοδόμησης RNA. Ωστόσο, με το πρωτόκολλο εμπλουτισμού ιού και ενίσχυσης PCR, μπορέσαμε να ενισχύσουμε με επιτυχία το τμήμα \(503\,\hbox {bp}\) για ηλεκτροχημική ανίχνευση.
Το Σχήμα 6 δείχνει τα αποτελέσματα ηλεκτροχημικού αισθητήρα του ενισχυτικού τμήματος \(503\,\hbox {bp}\), τόσο χρησιμοποιώντας μη αραιωμένο cDNA ως πρότυπο (1:1) όσο και 100 φορές αραιωμένο cDNA ως πρότυπο (1:100 ) που πραγματοποιήθηκε PCR , σε σύγκριση με το NTC και το PC (βλ. Σχήμα S4 στις Συμπληρωματικές Πληροφορίες για αντιπροσωπευτικά βολταμογράμματα). Κάθε κουτί στο τετραγωνίδιο στο σχήμα 6 περιέχει μετρήσεις από τρία δείγματα σε 5 ηλεκτρόδια. Τα ίδια ηλεκτρόδια χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση όλων των δειγμάτων για την αποφυγή σφαλμάτων λόγω ηλεκτροδίων Σε σύγκριση με τις μετρήσεις CV, οι μετρήσεις DPV δείχνουν καλύτερη ανάλυση για να διακρίνουν τα δείγματα δοκιμής και PC από τα NTC επειδή, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, τα ρεύματα Faradaic είναι κρυμμένα λόγω των χωρητικών ρευμάτων φόντου στο τελευταίο. Για μεγαλύτερα αμπλικόνια, παρατηρήσαμε ότι ο αρνητικός έλεγχος (NTC) οδήγησε σε υψηλότερα ρεύματα κορυφής CV και DPV σε σχέση με τον θετικό μάρτυρα, ενώ τα θετικά και μη αραιωμένα δείγματα δοκιμής έδειξαν παρόμοια ύψη κορυφής των ρευμάτων αιχμής DPV. Οι μετρούμενες μέσες και διάμεσες τιμές για κάθε μη αραιωμένο (1:1 ) Το δείγμα δοκιμής και ο υπολογιστής μπορούν να αναλυθούν σαφώς από την έξοδο του αισθητήρα για το δείγμα NTC, ενώ η ανάλυση για το αραιωμένο δείγμα 1:100 είναι λιγότερο έντονη. Για 100πλάσια αραίωση του cDNA, δεν παρατηρήσαμε ζώνες κατά την ηλεκτροφόρηση γέλης (οι λωρίδες δεν φαίνονται στο Σχήμα 5) και τα αντίστοιχα ρεύματα αιχμής DPV και CV ήταν παρόμοια με αυτά που αναμένονταν για το NTC. Τα αποτελέσματα για το τμήμα \(117\,\hbox {bp}\) εμφανίζονται στις Συμπληρωματικές Πληροφορίες. Τα αρνητικά ο έλεγχος προκάλεσε ηλεκτροχημική απόκριση από τον αισθητήρα PCB λόγω της προσρόφησης των ελεύθερων MB στο ηλεκτρόδιο και της αλληλεπίδρασης του MB με το μονόκλωνο ολιγονουκλεοτίδιο εκκινητή. Επομένως, κάθε φορά που δοκιμάζεται ένα δείγμα, πρέπει να εκτελείται αρνητικός έλεγχος και ρεύμα αιχμής του δείγματος δοκιμής σε σύγκριση με το ρεύμα αιχμής που λαμβάνεται από τον αρνητικό μάρτυρα για την επίτευξη διαφορικής (σχετικής) μέτρησης39,40 για την ταξινόμηση του δείγματος δοκιμής ως θετικού ή αρνητικού.
(α) DPV και (β) ρεύμα αιχμής CV για ηλεκτροχημική ανίχνευση θραυσμάτων \(503\,\hbox {bp}\) σε δείγματα νερού λίμνης. Τα δείγματα δοκιμής μετρήθηκαν εις τριπλούν και συγκρίθηκαν με κανένα πρότυπο ελέγχου (NTC) και θετικούς μάρτυρες (PC).
Τα ευρήματά μας απεικονίζουν διαφορετικούς μηχανισμούς που επηρεάζουν την απόδοση ηλεκτροχημικών αισθητήρων για αμπλικόνια διαφορετικού μήκους για διαφορετικά DNA, με συγκεντρώσεις που επαληθεύονται με οπτικές μετρήσεις χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο UV/Vis. Οι παρατηρήσεις μας υπογραμμίζουν τη γνώση ότι μακρύτερα θραύσματα DNA μέχρι \(\περίπου\) Το \(500\,\hbox {bp}\) μπορεί να ανιχνευθεί με υψηλότερη ευαισθησία και ότι η παρουσία αλατιού στο δείγμα δεν προκαλεί ευαισθησία συγκέντρωση DNA που επηρεάζει την υψηλότερη ευαισθησία (σπάνια \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) και παραπάνω). Επιπλέον, διερευνήσαμε την επίδραση διαφορετικών τύπων δειγμάτων, συμπεριλαμβανομένων των αμπλικονίων καθαρισμένων με γέλη με και χωρίς πρόσθετο αλάτι και της προσθήκης δειγμάτων νερού λίμνης στις μετρήσεις DPV και CV.Παρατηρήσαμε ότι το DPV παρείχε καλύτερη ανάλυση, καθώς το χωρητικό ρεύμα φόντου επηρεάζει επίσης τη μέτρηση του CV, καθιστώντας το λιγότερο ευαίσθητο.
Η ενίσχυση μακρύτερων θραυσμάτων εξαρτάται από την ακεραιότητα του ιικού γονιδιωματικού RNA. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η ενίσχυση μακρύτερων θραυσμάτων δεν είναι πάντα αποτελεσματική λόγω της αποικοδόμησης του RNA στο περιβάλλον και της πιθανότητας ματίσματος κατά την απομόνωση11,41,42,43,44 Παρατηρήσαμε ότι η μέθοδος συγκέντρωσης ιού που βασίζεται σε PEG ήταν πιο αποτελεσματική στη συγκέντρωση φάγου Phi-6 σε δείγματα νερού λίμνης από τη μέθοδο συγκέντρωσης ιού με βάση το υδροξείδιο του αργιλίου. Η ικανότητα ανίχνευσης μακρών θραυσμάτων DNA αποδείχθηκε ότι ξεπερνά την απαίτηση για multiplex PCR για την ενίσχυση πολλαπλών προτύπων μικρότερου μήκους και τη μείωση της πιθανότητας πολλαπλής εξειδίκευσης.
Τα βιολογικά δείγματα είναι σπάνια, επομένως υπάρχει ανάγκη να σχεδιαστεί ένας βιοαισθητήρας που απαιτεί ελάχιστα δείγματα για δοκιμή. Τα ηλεκτρόδια PCB ENIG που χρησιμοποιούνται σε αυτήν τη μελέτη απαιτούν μόνο \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) δείγματα για δοκιμή για την κάλυψη της αποτελεσματικής περιοχής των ηλεκτροδίων. Επιπλέον, το ίδιο ηλεκτρόδιο μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί μετά τον καθαρισμό πριν από τη διανομή του επόμενου δείγματος. Τα ενισχυμένα δείγματα δεν απαιτούν την προσθήκη άλλων χημικών ουσιών εκτός από το μπλε του μεθυλενίου, το οποίο είναι φθηνό και κοινώς χρησιμοποιούμενο χημικό. Δεδομένου ότι κάθε ηλεκτρόδιο κοστίζει περίπου 0,55 $ (ή 40 INR) για την κατασκευή, αυτός ο βιοαισθητήρας μπορεί να είναι μια οικονομικά αποδοτική εναλλακτική λύση στις υπάρχουσες τεχνολογίες ανίχνευσης. Ο Πίνακας 2 δείχνει μια σύγκριση αυτής της εργασίας με άλλους αισθητήρες που αναφέρονται στη βιβλιογραφία για μεγάλο χρονικό διάστημα Θραύσματα DNA σε ετερογενή δείγματα.
Δεδομένου ότι τα πρωτόκολλα ηλεκτροχημικής ανίχνευσης που βασίζονται σε MB βασίζονται στην ειδικότητα της PCR, ένας σημαντικός περιορισμός αυτής της μεθόδου είναι η δυνατότητα για μη ειδική ενίσχυση σε ετερογενή δείγματα όπως τα λύματα και το νερό της λίμνης ή η χρήση εκκινητών χαμηλής καθαρότητας. Για να βελτιωθεί η ευαισθησία του μέθοδοι ηλεκτροχημικής ανίχνευσης για την ανίχνευση DNA μη καθαρισμένων προϊόντων PCR χρησιμοποιώντας μη τροποποιημένα ηλεκτρόδια PCB ENIG, είναι απαραίτητο να κατανοηθούν καλύτερα τα σφάλματα που εισάγονται από αχρησιμοποίητα dNTP και εκκινητές και να βελτιστοποιηθούν οι συνθήκες αντίδρασης και τα πρωτόκολλα ανάλυσης. Πρόσθετες φυσικοχημικές παράμετροι όπως pH, θερμοκρασία και βιολογικές Η ζήτηση οξυγόνου (BOD) του δείγματος νερού μπορεί επίσης να χρειαστεί να μετρηθεί προκειμένου να βελτιωθεί η ακρίβεια της μέτρησης.
Συμπερασματικά, προτείνουμε έναν ηλεκτροχημικό αισθητήρα PCB ENIG χαμηλού κόστους για ανίχνευση ιών σε περιβαλλοντικά δείγματα (νερό λίμνης). Σε αντίθεση με τα ακινητοποιημένα ολιγονουκλεοτιδικά ηλεκτρόδια ή τα προσαρμοσμένα υποστρώματα για ανίχνευση DNA που απαιτούν κρυογονική αποθήκευση για τη διατήρηση της ευαισθησίας, η τεχνική μας χρησιμοποιεί μη τροποποιημένο PCB ηλεκτρόδια με μεγαλύτερη διάρκεια ζωής και χωρίς ειδικές απαιτήσεις αποθήκευσης και επομένως κατάλληλα για την ανάπτυξη λύσεων μέτρησης με αυτοματοποιημένη επεξεργασία δειγμάτων που αναπτύσσονται σε LMIC. Ο βιοαισθητήρας χρησιμοποιεί φθηνές οξειδοαναγωγικές χρωστικές ουσίες παρεμβολής DNA (MB) για ταχεία ανίχνευση ενισχυτικών στόχων. Η μη ειδική ενίσχυση κοινή σε περιβαλλοντικά δείγματα μειώνει την εξειδίκευση αυτής της μεθόδου ανίχνευσης λόγω της μη ειδικής δέσμευσης των MBs σε μονόκλωνα και δίκλωνα ολιγονουκλεοτίδια. Ως εκ τούτου, η εξειδίκευση αυτής της δοκιμής εξαρτάται από τη βελτιστοποίηση των εκκινητών και των συνθηκών αντίδρασης PCR. Επιπλέον, το CV και τα ρεύματα αιχμής DPV που λαμβάνονται από τα δοκιμασμένα δείγματα θα πρέπει να ερμηνεύονται σε σχέση με τις αποκρίσεις που λαμβάνονται από τον αρνητικό μάρτυρα (NTC) για κάθε δοκιμή. Τα σχέδια και οι μέθοδοι ηλεκτροχημικών αισθητήρων που παρουσιάζονται σε αυτήν την εργασία μπορούν να ενσωματωθούν με αυτοδειγματολήπτες για την ανάπτυξη ενός πλήρως αυτοματοποιημένου και χαμηλού -Λύση κόστους που μπορεί να συλλέγει και να αναλύει δείγματα και να μεταδίδει ασύρματα τα αποτελέσματα πίσω στο εργαστήριο.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Μέθοδοι για αρχική συγκέντρωση ιών από δείγματα νερού: ανασκόπηση και μετα-ανάλυση πρόσφατων μελετών.J.Application.microorganism.115, σσ. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Waterborne viruses: Barriers to safe drinking water.PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Επιδημιολογία λυμάτων για οικονομικά αποδοτική μεγάλης κλίμακας επιτήρηση του COVID-19 σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος: προκλήσεις και ευκαιρίες. Water 13, 2897 (2021).
Palecek, Ε. & Bartosik, Μ. Nucleic acid electrochemistry. Chemical.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Το μπλε του μεθυλενίου ως ηλεκτροχημικός διαχωριστής μονόκλωνων ολιγονουκλεοτιδίων ακινητοποιημένων σε υποστρώματα χρυσού. Αναλυτής 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion Intercalators for Electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long-Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648–654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Μεταφορά φορτίου μέσω DNA: ένας επιλεκτικός ηλεκτροχημικός DNA biosensor.anus.Chemical.78, 2138–2144 (2006).
Fang, TH et al. Microfluidic συσκευή PCR σε πραγματικό χρόνο με ταυτόχρονη ηλεκτροχημική ανίχνευση. βιολογικός αισθητήρας. Bioelectronics.24, 2131–2136 (2009).
Win, BY et al.Μελέτη μηχανισμού σηματοδότησης και επαλήθευση απόδοσης ενός ηλεκτροχημικού συστήματος PCR σε πραγματικό χρόνο που βασίζεται στην αλληλεπίδραση του μπλε του μεθυλενίου με το DNA. Αναλυτής 136, 1573–1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. Ηλεκτροχημικός αισθητήρας βασισμένος σε ισοθερμική ενίσχυση με μεσολάβηση βρόχου για ανίχνευση sars-cov-2 σε δείγματα λυμάτων. J.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Ηλεκτροχημική ανίχνευση αμπλικονίων SARS-CoV-2 με ηλεκτρόδια PCB. Ο αισθητήρας ενεργοποιείται.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Efficient detection of SARS-CoV-2 RNA in the solid fraction of wastewater.science.general environment.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytic Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Survival of the enveloped βακτηριοφάγου Phi6 (ένα υποκατάστατο του SARS-CoV-2) σε σταγονίδια εξατμισμένου σάλιου που εναποτίθενται σε γυάλινες επιφάνειες.science.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Περιβαλλοντική επιμονή ενός υποκατάστατου SARS-CoV-2 (Phi6) σε αμοιβάδα ελεύθερης διαβίωσης.J.Water Health 20, 83 (2021).
Mindich, L. Ακριβής συσκευασία τριών γονιδιωματικών θραυσμάτων βακτηριοφάγου δίκλωνου RNA\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Secondary structure of the DH RNA phage\(\varphi\)6 packaging area.RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al.Phages on the Tap – Ένα γρήγορο και αποτελεσματικό πρωτόκολλο για την προετοιμασία εργαστηριακών αποθεμάτων βακτηριοφάγων. PeerJ 4, e2261 (2016).
Ώρα δημοσίευσης: 27 Μαΐου 2022