Kryoröhrchenwerden üblicherweise für die kryogene Lagerung von Zelllinien und anderen kritischen biologischen Materialien in mit flüssigem Stickstoff gefüllten Dewargefäßen verwendet.

Die erfolgreiche Konservierung von Zellen in flüssigem Stickstoff umfasst mehrere Schritte. Das Grundprinzip ist das langsame Einfrieren, die genaue Technik hängt jedoch vom Zelltyp und dem verwendeten Kryoprotektivum ab. Bei der Lagerung von Zellen bei so niedrigen Temperaturen sind verschiedene Sicherheitsaspekte und bewährte Verfahren zu beachten.

Dieser Beitrag soll einen Überblick darüber geben, wie Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff gelagert werden.

Was sind Kryoröhrchen

Kryovials sind kleine, verschlossene Fläschchen zur Lagerung flüssiger Proben bei extrem niedrigen Temperaturen. Sie stellen sicher, dass die im Kryoprotektivum konservierten Zellen nicht in direkten Kontakt mit dem flüssigen Stickstoff kommen. Dadurch wird das Risiko von Zellbrüchen minimiert und gleichzeitig die extreme Kühlwirkung des flüssigen Stickstoffs genutzt.

Die Fläschchen sind in der Regel in verschiedenen Volumina und Ausführungen erhältlich – sie können mit Innen- oder Außengewinde und flachem oder abgerundetem Boden ausgestattet sein. Sterile und nicht sterile Ausführungen sind ebenfalls erhältlich.

Wer nutztCyrovialszur Lagerung von Zellen in flüssigem Stickstoff

Zahlreiche Labore des britischen Gesundheitsdienstes (NHS) und private Labore sowie Forschungseinrichtungen, die auf Nabelschnurblutbanken, Epithelzellbiologie, Immunologie und Stammzellbiologie spezialisiert sind, verwenden Kryoröhrchen zur Kryokonservierung von Zellen.

Zu den auf diese Weise konservierten Zellen gehören B- und T-Zellen, CHO-Zellen, hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen, Hybridome, Darmzellen, Makrophagen, mesenchymale Stamm- und Vorläuferzellen, Monozyten, Myelome, NK-Zellen und pluripotente Stammzellen.

Übersicht über die Lagerung von Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff

Kryokonservierung ist ein Verfahren, das Zellen und andere biologische Konstrukte durch Abkühlung auf sehr niedrige Temperaturen konserviert. Zellen können jahrelang in flüssigem Stickstoff gelagert werden, ohne dass ihre Lebensfähigkeit verloren geht. Dies ist eine Übersicht über die angewandten Verfahren.

Zellvorbereitung

Die genaue Methode zur Probenvorbereitung variiert je nach Zelltyp. Im Allgemeinen werden die Zellen gesammelt und zentrifugiert, um ein zellreiches Pellet zu erhalten. Dieses Pellet wird anschließend im Überstand mit Kryoprotektivum oder einem Kryokonservierungsmedium resuspendiert.

Kryokonservierungsmedium

Dieses Medium dient der Konservierung von Zellen in den niedrigen Temperaturen, denen sie ausgesetzt sind. Es verhindert die Bildung intra- und extrazellulärer Kristalle und damit den Zelltod. Seine Aufgabe ist es, Zellen und Geweben während des Einfrierens, der Lagerung und des Auftauens eine sichere und schützende Umgebung zu bieten.

Ein Medium wie beispielsweise gefrorenes Frischplasma (FFP), heparinisierte Plasmalytlösung oder serumfreie, tierkomponentenfreie Lösungen wird mit Kryoprotektiva wie Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Glycerin vermischt.

Das wiederverflüssigte Probenpellet wird in Polypropylen-Kryoröhrchen aliquotiert, wie z. B.Kryogene Lagerfläschchen der Firma Suzhou Ace Biomedical.

Es ist wichtig, die Kryoröhrchen nicht zu überfüllen, da dies das Risiko einer Rissbildung und eines möglichen Austretens des Inhalts erhöht (1).

Kontrollierte Gefrierrate

Im Allgemeinen wird für die erfolgreiche Kryokonservierung von Zellen eine langsame, kontrollierte Gefrierrate verwendet.

Nachdem die Proben in Kryoröhrchen aliquotiert wurden, werden diese auf Nasseis oder in einen 4 °C kalten Kühlschrank gestellt und der Gefriervorgang innerhalb von 5 Minuten gestartet. Als Faustregel gilt, dass die Zellen mit einer Abkühlrate von -1 bis -3 pro Minute gekühlt werden (2). Dies wird mithilfe eines programmierbaren Kühlers oder durch die Platzierung der Röhrchen in einer Isolierbox in einem Gefrierschrank mit geregelter Temperatur von -70 °C bis -90 °C erreicht.

Transfer in flüssigen Stickstoff

Die gefrorenen Kryofläschchen werden dann für unbestimmte Zeit in einen Tank mit flüssigem Stickstoff überführt, sofern eine Temperatur von weniger als -135 °C aufrechterhalten wird.

Diese ultraniedrigen Temperaturen können durch Eintauchen in flüssigen oder dampfförmigen Stickstoff erreicht werden.

Flüssig- oder Dampfphase?

Die Lagerung in flüssigem Stickstoff hält die kalte Temperatur bekanntermaßen absolut konstant, wird jedoch aus folgenden Gründen häufig nicht empfohlen:

• Der Bedarf an großen Mengen (Tiefe) flüssigen Stickstoffs stellt eine potenzielle Gefahr dar. Verbrennungen oder Erstickung sind ein reales Risiko.
• Dokumentierte Fälle von Kreuzkontamination durch Infektionserreger wie Aspergillus, Hepatitis B und Virusverbreitung über das flüssige Stickstoffmedium (2,3)
• Es besteht die Möglichkeit, dass flüssiger Stickstoff während des Eintauchens in die Fläschchen gelangt. Nach der Entnahme aus dem Lager und dem Erwärmen auf Raumtemperatur dehnt sich der Stickstoff schnell aus. Infolgedessen kann das Fläschchen beim Entnehmen aus dem Flüssigstickstofflager zerspringen, was sowohl durch herumfliegende Trümmer als auch durch den Kontakt mit dem Inhalt eine Gefahr darstellt (1, 4).

Aus diesen Gründen erfolgt die Lagerung bei extrem niedrigen Temperaturen meist in Stickstoffdampfphase. Wenn Proben in der Flüssigphase gelagert werden müssen, sollten spezielle Cryoflex-Schläuche verwendet werden.

Der Nachteil der Dampfphase besteht darin, dass ein vertikaler Temperaturgradient auftreten kann, der zu Temperaturschwankungen zwischen -135 °C und -190 °C führt. Dies erfordert eine sorgfältige und gewissenhafte Überwachung des Flüssigstickstoffspiegels und der Temperaturschwankungen (5).

Viele Hersteller empfehlen, dass Kryoröhrchen nur für die Lagerung bis -135 °C oder für die Verwendung in der Dampfphase geeignet sind.

Auftauen Ihrer kryokonservierten Zellen

Das Auftauen ist für eine gefrorene Kultur belastend. Um optimale Lebensfähigkeit, Regeneration und Funktionalität der Zellen zu gewährleisten, sind eine korrekte Handhabung und Technik erforderlich. Die genauen Auftauprotokolle hängen vom jeweiligen Zelltyp ab. Schnelles Auftauen gilt jedoch als Standard, um:

• Reduzieren Sie jegliche Auswirkungen auf die Zellregeneration
• Helfen Sie dabei, die Einwirkungszeit der im Gefriermedium enthaltenen gelösten Stoffe zu verkürzen
• Minimieren Sie Schäden durch Eisrekristallisation

Zum Auftauen von Proben werden üblicherweise Wasserbäder, Perlenbäder oder spezielle automatisierte Instrumente verwendet.

Am häufigsten wird jeweils eine Zelllinie 1–2 Minuten lang aufgetaut, indem sie in einem 37 °C warmen Wasserbad vorsichtig geschwenkt wird, bis nur noch ein kleiner Rest Eis im Fläschchen übrig ist, bevor sie in einem vorgewärmten Wachstumsmedium gewaschen werden.

Für manche Zellen, beispielsweise Säugetierembryonen, ist eine langsame Erwärmung überlebenswichtig.

Die Zellen sind nun bereit für die Zellkultur, Zellisolierung oder – im Fall von hämatopoetischen Stammzellen – Lebensfähigkeitsstudien, um die Integrität der Spenderstammzellen vor der myeloablativen Therapie zu gewährleisten.

Es ist üblich, kleine Aliquots der vorgewaschenen Probe zu entnehmen, um eine Zellzählung durchzuführen und so die Zellkonzentration für die Ausplattierung in Kultur zu bestimmen. Anschließend können Sie die Ergebnisse der Zellisolierungsverfahren auswerten und die Zelllebensfähigkeit bestimmen.

Best Practices für die Lagerung von Kryoröhrchen

Die erfolgreiche Kryokonservierung von in Kryoröhrchen gelagerten Proben hängt von vielen Elementen des Protokolls ab, einschließlich der ordnungsgemäßen Lagerung und Dokumentation.

• Zellen zwischen Speicherorten aufteilen– Wenn das Volumen es erlaubt, teilen Sie die Zellen auf mehrere Fläschchen auf und lagern Sie sie an getrennten Orten, um das Risiko eines Probenverlusts aufgrund von Geräteausfällen zu verringern.
• Kreuzkontamination verhindern– Entscheiden Sie sich für sterile Kryofläschchen zum Einmalgebrauch oder autoklavieren Sie sie vor der weiteren Verwendung
• Verwenden Sie Fläschchen mit der richtigen Größe für Ihre Zellen– Fläschchen sind in verschiedenen Größen zwischen 1 und 5 ml erhältlich. Vermeiden Sie ein Überfüllen der Fläschchen, um das Risiko von Rissen zu verringern.
• Wählen Sie Kryoröhrchen mit Innen- oder Außengewinde– Einige Universitäten empfehlen Fläschchen mit Innengewinde aus Sicherheitsgründen. Sie können außerdem eine Kontamination beim Befüllen oder bei der Lagerung in flüssigem Stickstoff verhindern.
• Leckagen verhindern- Verwenden Sie in die Schraubkappe eingegossene Doppeldichtungen oder O-Ringe, um Leckagen und Verunreinigungen zu verhindern.
• Verwenden Sie 2D-Barcodes und beschriften Sie FläschchenUm die Rückverfolgbarkeit zu gewährleisten, ermöglichen Fläschchen mit großen Beschriftungsflächen eine ausreichende Beschriftung jedes Fläschchens. 2D-Barcodes können bei der Lagerverwaltung und Dokumentation hilfreich sein. Farbcodierte Verschlüsse erleichtern die Identifizierung.
• Angemessene LagerwartungUm Zellverlust zu vermeiden, sollten Temperatur und Stickstoffstand in den Lagerbehältern ständig überwacht werden. Alarme sollten installiert werden, um den Benutzer auf Fehler aufmerksam zu machen.

Sicherheitsvorkehrungen

Flüssiger Stickstoff ist in der modernen Forschung mittlerweile gängige Praxis, birgt bei unsachgemäßer Anwendung jedoch das Risiko schwerer Verletzungen.

Um das Risiko von Erfrierungen, Verbrennungen und anderen unerwünschten Ereignissen beim Umgang mit flüssigem Stickstoff zu minimieren, sollte geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) getragen werden. Tragen

• Kryogene Handschuhe
• Laborkittel
• Schlagfester Vollgesichtsschutz, der auch den Hals abdeckt
• Geschlossene Schuhe
• Spritzwassergeschützte Kunststoffschürze

Flüssigstickstoff-Kühlschränke sollten in gut belüfteten Bereichen aufgestellt werden, um das Erstickungsrisiko zu minimieren – entweichender Stickstoff verdampft und verdrängt den Luftsauerstoff. Großraumlager sollten über Alarmsysteme bei Sauerstoffmangel verfügen.

Ideal ist die Zusammenarbeit zu zweit beim Umgang mit flüssigem Stickstoff und die Verwendung außerhalb der normalen Arbeitszeiten sollte untersagt sein.

Kryoröhrchen zur Unterstützung Ihres Arbeitsablaufs

Suzhou Ace Biomedical bietet eine breite Produktpalette für die Kryokonservierung verschiedener Zelltypen. Das Portfolio umfasst verschiedene Röhrchen und sterile Kryovials.

Unsere Kryoröhrchen sind:

• Labor-Schraubverschluss 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml Kryovial Kryogene Fläschchen Kryoröhrchen mit konischem Boden und Dichtung

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml Spezifikation, mit oder ohne Rand
  ● Konisches oder freistehendes Design, steril oder nicht steril sind beide verfügbar
  ● Röhrchen mit Schraubverschluss bestehen aus medizinischem Polypropylen
  ● PP-Kryoröhrchen können wiederholt eingefroren und aufgetaut werden
  ●Das Design der externen Kappe kann die Kontaminationswahrscheinlichkeit während der Probenbehandlung verringern.
  ● Kryoröhrchen mit Schraubverschluss. Universelle Schraubgewinde für den Einsatz
  ● Die Rohre passen auf die meisten gängigen Rotoren
  ● Kryogene Rohre mit O-Ringen passen in Standard-Gefrierboxen mit 1 Zoll und 2 Zoll, 48 Well, 81 Well, 96 Well und 100 Well
  ● Autoklavierbar bis 121 °C und gefrierbar bis -86 °C

  TEIL NR	MATERIAL	VOLUMEN	KAPPEFARBE	PCS/TASCHE	TASCHEN/KOFFER
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Schwarz, Gelb, Blau, Rot, Lila, Weiß	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Schwarz, Gelb, Blau, Rot, Lila, Weiß	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Schwarz, Gelb, Blau, Rot, Lila, Weiß	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Schwarz, Gelb, Blau, Rot, Lila, Weiß	500	10