Criovialss'utilitzen habitualment per a l'emmagatzematge criogènic de línies cel·lulars i altres materials biològics crítics, en recipients Dewar plens de nitrogen líquid.

Hi ha diverses etapes implicades en la preservació reeixida de cèl·lules en nitrogen líquid. Tot i que el principi bàsic és la congelació lenta, la tècnica exacta emprada depèn del tipus de cèl·lula i del crioprotector utilitzat. Hi ha diverses consideracions de seguretat i bones pràctiques a tenir en compte a l'hora d'emmagatzemar cèl·lules a temperatures tan baixes.

Aquesta publicació pretén donar una visió general de com s'emmagatzemen els criovials en nitrogen líquid.

Què són els criovials?

Els criovials són vials petits amb tap dissenyats per emmagatzemar mostres líquides a temperatures extremadament baixes. Garanteixen que les cèl·lules conservades en crioprotector no entrin en contacte directe amb el nitrogen líquid, minimitzant el risc de fractures cel·lulars i alhora beneficiant-se de l'efecte de refredament extrem del nitrogen líquid.

Els vials solen estar disponibles en una gamma de volums i dissenys: poden tenir rosca interna o externa i fons plans o arrodonits. També hi ha formats estèrils i no estèrils disponibles.

Qui utilitzaCyrovialsemmagatzemar cèl·lules en nitrogen líquid

Una sèrie de laboratoris del NHS i privats, així com institucions de recerca especialitzades en bancs de sang de cordó umbilical, biologia de cèl·lules epitelials, immunologia i biologia de cèl·lules mare utilitzen criovials per criopreservar cèl·lules.

Les cèl·lules conservades d'aquesta manera inclouen limfòcits B i T, cèl·lules CHO, cèl·lules mare i progenitores hematopoètiques, hibridomes, cèl·lules intestinals, macròfags, cèl·lules mare i progenitores mesenquimals, monòcits, mieloma, cèl·lules NK i cèl·lules mare pluripotents.

Visió general de com emmagatzemar criovials en nitrogen líquid

La criopreservació és un procés que preserva cèl·lules i altres construccions biològiques refredant-les a temperatures molt baixes. Les cèl·lules es poden emmagatzemar en nitrogen líquid durant anys sense pèrdua de viabilitat cel·lular. Aquest és un esquema dels procediments emprats.

Preparació cel·lular

El mètode exacte per preparar mostres variarà segons el tipus de cèl·lula, però en general, les cèl·lules es recullen i es centrifuguen per desenvolupar un pellet ric en cèl·lules. Aquest pellet es resuspèn en el sobrenedant barrejat amb crioprotector o un medi de criopreservació.

Medi de criopreservació

Aquest medi s'utilitza per preservar les cèl·lules en els ambients de baixa temperatura als quals estaran sotmeses, inhibint la formació de cristalls intra i extracel·lulars i, per tant, la mort cel·lular. La seva funció és proporcionar un entorn segur i protector per a les cèl·lules i els teixits durant els processos de congelació, emmagatzematge i descongelació.

Un medi com ara plasma fresc congelat (FFP), una solució de plasmalits heparinitzada o solucions sense sèrum ni components animals es barreja amb crioprotectors com ara dimetilsulfòxid (DMSO) o glicerol.

El pellet de mostra reliquificat es distribueix en alíquotes en criovials de polipropilè com araSuzhou Ace Biomedical company Vials d'emmagatzematge criogènic.

És important no omplir massa els criovials, ja que això augmentarà el risc d'esquerdes i la possible alliberació del contingut (1).

Velocitat de congelació controlada

En general, s'utilitza una velocitat de congelació lenta i controlada per a la criopreservació reeixida de cèl·lules.

Després de dividir les mostres en vials criogènics en alíquotes, es col·loquen sobre gel humit o en un refrigerador a 4 ℃ i s'inicia el procediment de congelació en 5 minuts. Com a guia general, les cèl·lules es refreden a una velocitat de -1 a -3 per minut (2). Això s'aconsegueix mitjançant un refrigerador programable o col·locant els vials en una caixa aïllada en un congelador de velocitat controlada de -70 °C a -90 °C.

Transferència a nitrogen líquid

Els vials criogènics congelats es transfereixen a un tanc de nitrogen líquid durant períodes indefinits, sempre que es mantingui una temperatura inferior a -135 ℃.

Aquestes temperatures ultrabaixes es poden obtenir per immersió en nitrogen en fase líquida o de vapor.

Fase líquida o de vapor?

L'emmagatzematge en nitrogen en fase líquida és conegut per mantenir la temperatura freda amb una consistència absoluta, però sovint no es recomana pels motius següents:

• La necessitat de grans volums (profunditat) de nitrogen líquid, que és un perill potencial. Les cremades o l'asfíxia a causa d'això són un risc real.
• Casos documentats de contaminació creuada per agents infecciosos com l'aspergil·losi, l'hepatitis B i la propagació viral a través del medi de nitrogen líquid (2,3)
• La possibilitat que el nitrogen líquid s'infiltri als vials durant la immersió. Quan es treu del magatzem i s'escalfa a temperatura ambient, el nitrogen s'expandeix ràpidament. En conseqüència, el vial es pot trencar quan es treu del magatzem de nitrogen líquid, creant un perill tant per les restes volants com per l'exposició al contingut (1, 4).

Per aquestes raons, l'emmagatzematge a temperatura ultrabaixa es fa més habitualment en nitrogen en fase vapor. Quan les mostres s'han d'emmagatzemar en fase líquida, s'han d'utilitzar tubs crioflex especialitzats.

L'inconvenient de la fase de vapor és que es pot produir un gradient de temperatura vertical que provoca fluctuacions de temperatura entre -135 ℃ i -190 ℃. Això requereix un seguiment acurat i diligent dels nivells de nitrogen líquid i de les variacions de temperatura (5).

Molts fabricants recomanen que els criovials siguin adequats per a emmagatzematge fins a -135 ℃ o per a ús només en fase de vapor.

Descongelació de les cèl·lules criopreservades

El procediment de descongelació és estressant per a un cultiu congelat, i cal una manipulació i una tècnica adequades per garantir una viabilitat, recuperació i funcionalitat òptimes de les cèl·lules. Els protocols de descongelació exactes dependran dels tipus de cèl·lules específics. Tanmateix, la descongelació ràpida es considera estàndard per a:

• Disminuir qualsevol impacte en la recuperació cel·lular
• Ajudar a reduir el temps d'exposició als soluts presents en els medis de congelació
• Minimitzar qualsevol dany per recristal·lització del gel

Per descongelar mostres s'utilitzen habitualment banys d'aigua, banys de perles o instruments automatitzats especialitzats.

El més freqüent és descongelar una línia cel·lular cada vegada durant 1-2 minuts, remenant-la suaument en un bany d'aigua a 37 ℃ fins que només quedi una mica de gel al vial abans de rentar-les en un medi de creixement preescalfat.

Per a algunes cèl·lules com els embrions de mamífers, un escalfament lent és essencial per a la seva supervivència.

Les cèl·lules ara estan llestes per al cultiu cel·lular, l'aïllament cel·lular o, en el cas de les cèl·lules mare hematopoètiques, estudis de viabilitat per garantir la integritat de les cèl·lules mare del donant abans de la teràpia mieloablativa.

És pràctica normal prendre petites alíquotes de la mostra pre-rentada utilitzada per realitzar un recompte cel·lular per determinar les concentracions cel·lulars per al cultiu. Aleshores, es poden avaluar els resultats dels procediments d'aïllament cel·lular i determinar la viabilitat cel·lular.

Millors pràctiques per a l'emmagatzematge de criovials

L'èxit de la criopreservació de mostres emmagatzemades en criovials depèn de molts elements del protocol, com ara un emmagatzematge adequat i el manteniment de registres.

• Dividir cel·les entre ubicacions d'emmagatzematge– Si els volums ho permeten, dividiu les cèl·lules entre els vials i guardeu-les en llocs separats per reduir el risc de pèrdua de mostres a causa d'errors de l'equip.
• Prevenir la contaminació creuada– Optar per vials criogènics estèrils d'un sol ús o autoclau abans d'un ús posterior
• Utilitzeu vials de la mida adequada per a les vostres cèl·lules– els vials tenen volums d'entre 1 i 5 ml. Eviteu omplir massa els vials per reduir el risc d'esquerdes.
• Seleccioneu vials criogènics amb rosca interna o externa– Algunes universitats recomanen vials amb rosca interna per mesures de seguretat; també poden evitar la contaminació durant l'ompliment o quan s'emmagatzemen en nitrogen líquid.
• Prevenir fuites- Utilitzeu segells biinjectats modelats al tap de rosca o a les juntes tòriques per evitar fuites i contaminació.
• Utilitzeu codis de barres 2D i etiqueteu els vials– per garantir la traçabilitat, els vials amb grans àrees d'escriptura permeten etiquetar adequadament cada vial. Els codis de barres 2D poden ajudar amb la gestió de l'emmagatzematge i el manteniment de registres. Els taps codificats per colors són útils per facilitar la identificació.
• Manteniment adequat de l'emmagatzematge- Per garantir que no es perdin cèl·lules, els recipients d'emmagatzematge han de controlar constantment la temperatura i els nivells de nitrogen líquid. S'han d'instal·lar alarmes per alertar els usuaris dels errors.

Precaucions de seguretat

El nitrogen líquid s'ha convertit en una pràctica habitual en la recerca moderna, però comporta el risc de lesions greus si s'utilitza incorrectament.

Cal portar equips de protecció individual (EPI) adequats per minimitzar el risc de congelacions, cremades i altres incidents adversos durant la manipulació de nitrogen líquid.

• Guants criogènics
• Bata de laboratori
• Pantalla facial completa resistent als impactes que també cobreix el coll
• Sabates tancades
• Davantal de plàstic resistent a les esquitxades

Els refrigeradors de nitrogen líquid s'han de col·locar en zones ben ventilades per minimitzar el risc d'asfíxia: el nitrogen que s'escapa s'evapora i desplaça l'oxigen atmosfèric. Els magatzems de gran volum han de tenir sistemes d'alarma per baix contingut d'oxigen.

Treballar en parelles quan es manipula nitrogen líquid és ideal i s'hauria de prohibir el seu ús fora de l'horari laboral normal.

Criovials per donar suport al vostre flux de treball

L'empresa Suzhou Ace Biomedical ofereix una àmplia selecció de productes que satisfan les vostres necessitats de criopreservació per a diferents tipus de cèl·lules. La cartera inclou una gamma de tubs, així com una gamma de criovials estèrils.

Els nostres criovials són:

• Tap de rosca de laboratori 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml Criovial Vials criogènics Criotub de fons cònic amb junta

  ● Especificació de 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, amb faldilla o sense faldilla
  ● Disseny cònic o autoportant, estèril o no estèril disponibles
  ● Els tubs amb tap de rosca estan fets de polipropilè de grau mèdic
  ● Els vials de criotubs de PP es poden congelar i descongelar repetidament
  ● El disseny de la tapa externa pot reduir la probabilitat de contaminació durant el tractament de la mostra.
  ● Tubs criogènics amb tap de rosca Rosques universals per a ús
  ● Els tubs s'adapten a la majoria de rotors comuns
  ● Els tubs criogènics amb junta tòrica s'adapten a caixes congeladores estàndard d'1 polzada i 2 polzades, 48 ​​pous, 81 pous, 96 pous i 100 pous
  ● Autoclavable a 121 °C i congelable a -86 °C

  NÚM. DE PEÇA	MATERIAL	VOLUM	CAPCOLOR	PCS/BOSSA	BOSSES/ESTOIX
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Negre, Groc, Blau, Vermell, Lila, Blanc	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Negre, Groc, Blau, Vermell, Lila, Blanc	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Negre, Groc, Blau, Vermell, Lila, Blanc	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Negre, Groc, Blau, Vermell, Lila, Blanc	500	10