Kriovialese obično koriste za kriogeno skladištenje ćelijskih linija i drugih kritičnih bioloških materijala, u Dewarovim posudama napunjenim tečnim azotom.

Postoji nekoliko faza uključenih u uspješno očuvanje ćelija u tekućem dušiku. Iako je osnovni princip sporo zamrzavanje, tačna tehnika koja se koristi zavisi od vrste ćelija i korištenog krioprotektanta. Postoji nekoliko sigurnosnih razmatranja i najboljih praksi koje treba uzeti u obzir prilikom skladištenja ćelija na tako niskim temperaturama.

Ovaj članak ima za cilj dati pregled načina skladištenja krioviala u tekućem dušiku.

Šta su krioviale

Krioviale su male, zatvorene bočice dizajnirane za čuvanje tečnih uzoraka na izuzetno niskim temperaturama. One osiguravaju da ćelije sačuvane u krioprotektantu ne dođu u direktan kontakt sa tečnim azotom, minimizirajući rizik od ćelijskih lomova, a istovremeno iskorištavajući ekstremni efekat hlađenja tečnog azota.

Bočice su obično dostupne u različitim volumenima i dizajnima – mogu imati unutrašnji ili vanjski navoj s ravnim ili zaobljenim dnom. Dostupni su i sterilni i nesterilni formati.

Ko koristiCyrovialsČuvanje ćelija u tečnom azotu

Niz NHS i privatnih laboratorija, kao i istraživačke institucije specijalizirane za bankarstvo krvi iz pupčane vrpce, biologiju epitelnih ćelija, imunologiju i biologiju matičnih ćelija koriste kriobočice za krioprezervaciju ćelija.

Ćelije konzervirane na ovaj način uključuju B i T ćelije, CHO ćelije, hematopoetske matične i progenitorske ćelije, hibridome, crijevne ćelije, makrofage, mezenhimalne matične i progenitorske ćelije, monocite, mijelom, NK ćelije i pluripotentne matične ćelije.

Pregled načina skladištenja krioviala u tekućem dušiku

Krioprezervacija je proces koji čuva ćelije i druge biološke konstrukcije hlađenjem na vrlo niske temperature. Ćelije se mogu čuvati u tečnom azotu godinama bez gubitka održivosti ćelija. Ovo je pregled korištenih postupaka.

Priprema ćelija

Tačna metoda za pripremu uzoraka će varirati u zavisnosti od tipa ćelije, ali generalno, ćelije se sakupljaju i centrifugiraju kako bi se razvio talog bogat ćelijama. Ovaj talog se zatim resuspenduje u supernatantu pomiješanom sa krioprotektantom ili medijem za krioprezervaciju.

Medij za krioprezervaciju

Ovaj medij se koristi za očuvanje ćelija u okruženjima niskih temperatura kojima će biti izložene, inhibirajući stvaranje intra- i ekstracelularnih kristala, a time i ćelijsku smrt. Njihova uloga je da obezbijede sigurno, zaštitno okruženje za ćelije i tkiva tokom procesa zamrzavanja, skladištenja i odmrzavanja.

Medij kao što je svježe smrznuta plazma (FFP), heparinizirani plazmalitski rastvor ili rastvori bez seruma i životinjskih komponenti miješaju se s krioprotektantima kao što su dimetilsulfoksid (DMSO) ili glicerol.

Ponovno ukapljeni uzorak peleta se alikvotno dijeli u polipropilenske krioepruvete kao što suSuzhou Ace Biomedical company kriogene bočice za skladištenje.

Važno je ne prepuniti kriobočice jer će to povećati rizik od pucanja i mogućeg ispuštanja sadržaja (1).

Kontrolirana brzina smrzavanja

Općenito, za uspješnu krioprezervaciju ćelija koristi se spora kontrolirana brzina zamrzavanja.

Nakon što se uzorci alikvotiraju u kriogene bočice, stavljaju se na vlažni led ili u hladnjak na 4℃, a postupak zamrzavanja započinje u roku od 5 minuta. Kao općenita smjernica, ćelije se hlade brzinom od -1 do -3 u minuti (2). To se postiže korištenjem programabilnog hladnjaka ili stavljanjem bočica u izoliranu kutiju smještenu u zamrzivač s kontroliranom brzinom od -70°C do -90°C.

Prelazak na tečni azot

Zamrznute kriogene bočice se zatim prenose u rezervoar sa tečnim azotom na neodređeno vrijeme, pod uslovom da se održava temperatura niža od -135℃.

Ove ultraniske temperature mogu se postići uranjanjem u tečni ili gasoviti azot.

Tečna ili parna faza?

Poznato je da skladištenje u tečnom azotu održava hladnu temperaturu apsolutno konzistentno, ali se često ne preporučuje iz sljedećih razloga:

• Potreba za velikim količinama (dubina) tečnog azota, što predstavlja potencijalnu opasnost. Opekotine ili gušenje zbog ovoga predstavljaju stvarni rizik.
• Dokumentovani slučajevi unakrsne kontaminacije infektivnim agensima kao što su aspergillus, hepatitis B i širenje virusa putem tečnog azotnog medija (2,3)
• Mogućnost curenja tečnog azota u bočice tokom uranjanja. Kada se izvadi iz skladišta i zagrije na sobnu temperaturu, azot se brzo širi. Posljedično, bočica se može razbiti kada se izvadi iz skladišta tečnog azota, stvarajući opasnost i od letećih krhotina i od izlaganja sadržaju (1, 4).

Iz ovih razloga, skladištenje na ultraniskim temperaturama najčešće se vrši u gasovitoj fazi dušika. Kada se uzorci moraju čuvati u tečnoj fazi, treba koristiti specijalizirane kriofleksne cijevi.

Nedostatak parne faze je što se može pojaviti vertikalni temperaturni gradijent koji rezultira temperaturnim fluktuacijama između -135℃ i -190℃. To zahtijeva pažljivo i marljivo praćenje nivoa tečnog azota i temperaturnih varijacija (5).

Mnogi proizvođači preporučuju da su krioviale pogodne za skladištenje do -135℃ ili za upotrebu samo u gasnoj fazi.

Odmrzavanje krioprezerviranih ćelija

Postupak odmrzavanja je stresan za smrznutu kulturu, te je potrebno pravilno rukovanje i tehnika kako bi se osigurala optimalna održivost, oporavak i funkcionalnost ćelija. Tačni protokoli odmrzavanja zavisiće od specifičnih tipova ćelija. Međutim, brzo odmrzavanje se smatra standardnim za:

• Smanjite bilo kakav uticaj na oporavak ćelija
• Pomažu u smanjenju vremena izlaganja rastvorenim materijama prisutnim u mediju za zamrzavanje
• Minimizirajte bilo kakvu štetu uzrokovanu rekristalizacijom leda

Za odmrzavanje uzoraka se obično koriste vodene kupke, kupke s kuglicama ili specijalizirani automatizirani instrumenti.

Najčešće se odmrzava jedna ćelijska linija tokom 1-2 minute, laganim miješanjem u vodenoj kupki na 37℃ dok u bočici ne ostane samo malo leda prije nego što se isperu u prethodno zagrijanom mediju za rast.

Za neke ćelije poput embriona sisara, sporo zagrijavanje je neophodno za njihov opstanak.

Ćelije su sada spremne za kulturu ćelija, izolaciju ćelija ili, u slučaju hematopoetskih matičnih ćelija – studije održivosti kako bi se garantovao integritet donorskih matičnih ćelija prije mijeloablativne terapije.

Uobičajena je praksa uzimati male alikvote prethodno opranog uzorka koji se koristi za brojanje ćelija kako bi se odredile koncentracije ćelija za nasađivanje u kulturu. Zatim možete procijeniti rezultate postupaka izolacije ćelija i odrediti održivost ćelija.

Najbolje prakse za skladištenje krioviala

Uspješna krioprezervacija uzoraka pohranjenih u kriovialama ovisi o mnogim elementima protokola, uključujući pravilno skladištenje i vođenje evidencije.

• Podijelite ćelije između lokacija za pohranu– Ako volumen dozvoljava, razdvojite ćelije između bočica i čuvajte ih na odvojenim mjestima kako biste smanjili rizik od gubitka uzorka zbog kvarova opreme.
• Spriječite unakrsnu kontaminaciju– Odlučite se za sterilne kriogene bočice za jednokratnu upotrebu ili autoklavirajte prije sljedeće upotrebe
• Koristite bočice odgovarajuće veličine za svoje ćelije– bočice dolaze u rasponu zapremina između 1 i 5 ml. Izbjegavajte prepunjavanje bočica kako biste smanjili rizik od pucanja.
• Odaberite kriogene bočice s unutarnjim ili vanjskim navojem– Neki univerziteti preporučuju bočice sa unutrašnjim navojem iz sigurnosnih razloga – one također mogu spriječiti kontaminaciju tokom punjenja ili skladištenja u tečnom azotu.
• Spriječite curenje- Koristite dvostruko ubrizgane zaptivke oblikovane u navojni čep ili O-prstenove kako biste spriječili curenje i kontaminaciju.
• Koristite 2D barkodove i označite bočice– kako bi se osigurala sljedivost, bočice s velikim površinama za pisanje omogućavaju adekvatno označavanje svake bočice. 2D barkodovi mogu pomoći u upravljanju skladištenjem i vođenju evidencije. Čepovi s kodovima u boji korisni su za lakšu identifikaciju.
• Adekvatno održavanje skladišta- Kako bi se osiguralo da se ćelije ne izgube, u posudama za skladištenje treba stalno pratiti temperaturu i nivo tečnog azota. Treba postaviti alarme koji će upozoravati korisnike na greške.

Sigurnosne mjere opreza

Tečni azot je postao uobičajena praksa u modernim istraživanjima, ali nosi rizik od ozbiljnih povreda ako se koristi nepravilno.

Treba nositi odgovarajuću ličnu zaštitnu opremu (LZO) kako bi se smanjio rizik od promrzlina, opekotina i drugih neželjenih događaja pri rukovanju tečnim azotom.

• Kriogene rukavice
• Laboratorijski mantil
• Štitnik za cijelo lice otporan na udarce koji pokriva i vrat
• Cipele sa zatvorenim prstima
• Plastična pregača otporna na prskanje

Hladnjake s tekućim dušikom treba smjestiti u dobro prozračene prostore kako bi se smanjio rizik od gušenja – oslobođeni dušik isparava i istiskuje atmosferski kisik. Skladišta velikih zapremina trebaju imati alarmne sisteme za nizak nivo kisika.

Rad u paru pri rukovanju tečnim azotom je idealan, a njegova upotreba izvan redovnog radnog vremena treba biti zabranjena.

Krioviale za podršku vašem radnom procesu

Kompanija Suzhou Ace Biomedical nudi širok izbor proizvoda koji zadovoljavaju vaše potrebe za krioprezervacijom različitih vrsta ćelija. Portfolio uključuje niz epruveta, kao i niz sterilnih kriobočica.

Naše kriobočice su:

• Laboratorijske kriogene bočice sa navojnim čepom od 0,5 ml, 1,5 ml i 2,0 ml, sa konusnim dnom i zaptivkom

  ● Specifikacija 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, sa ili bez zaštitne folije
  ● Dostupni su konusni ili samostojeći dizajn, sterilni ili nesterilni
  ● Tube sa navojnim čepom napravljene su od polipropilena medicinskog kvaliteta
  ● PP kriotube bočice se mogu više puta zamrzavati i odmrzavati
  ● Dizajn vanjskog poklopca može smanjiti vjerovatnoću kontaminacije tokom obrade uzorka.
  ● Kriogene epruvete s navojnim poklopcem Univerzalni navoji za upotrebu
  ● Cijevi odgovaraju većini uobičajenih rotora
  ● Kriogene cijevi s o-prstenovima odgovaraju standardnim kutijama za zamrzavanje od 1 inča i 2 inča, 48, 81, 96 i 100 rupa
  ● Može se autoklavirati do 121°C i zamrzavati do -86°C

  BROJ DIJELA	MATERIJAL	JAČINA	ZPPBOJA	PCS/VREĆA	TORBE/KUTIJICA
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Crna, Žuta, Plava, Crvena, Ljubičasta, Bijela	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Crna, Žuta, Plava, Crvena, Ljubičasta, Bijela	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Crna, Žuta, Plava, Crvena, Ljubičasta, Bijela	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Crna, Žuta, Plava, Crvena, Ljubičasta, Bijela	500	10