قوارير التبريدتُستخدم عادةً للتخزين المبرد لخطوط الخلايا والمواد البيولوجية الهامة الأخرى، في أوعية ديوار مملوءة بالنيتروجين السائل.

هناك عدة مراحل لنجاح حفظ الخلايا في النيتروجين السائل. ورغم أن المبدأ الأساسي هو التجميد البطيء، إلا أن التقنية الدقيقة المستخدمة تعتمد على نوع الخلية والمادة الحافظة المستخدمة. وهناك العديد من اعتبارات السلامة وأفضل الممارسات التي يجب مراعاتها عند تخزين الخلايا في درجات حرارة منخفضة كهذه.

تهدف هذه المقالة إلى تقديم نظرة عامة حول كيفية تخزين القوارير المبردة في النيتروجين السائل.

ما هي الكريوفيالات

قوارير التبريد هي قوارير صغيرة مُغطاة، مصممة لتخزين العينات السائلة في درجات حرارة منخفضة للغاية. تضمن هذه القوارير عدم تلامس الخلايا المحفوظة في مادة واقية من التجمد مباشرةً مع النيتروجين السائل، مما يقلل من خطر تكسر الخلايا مع الاستفادة من تأثير التبريد القوي للنيتروجين السائل.

تتوفر القوارير عادةً بأحجام وتصاميم متنوعة، ويمكن تثبيتها داخليًا أو خارجيًا بقواعد مسطحة أو مستديرة. كما تتوفر بأشكال معقمة وغير معقمة.

من يستخدمسيروفيالزلتخزين الخلايا في النيتروجين السائل

تستخدم مجموعة من مختبرات هيئة الخدمات الصحية الوطنية والمختبرات الخاصة، فضلاً عن مؤسسات الأبحاث المتخصصة في بنوك دم الحبل السري، وعلم الأحياء الخلوية الظهارية، وعلم المناعة، وعلم الأحياء الخلوية الجذعية، القوارير المبردة للحفاظ على الخلايا.

تشمل الخلايا المحفوظة بهذه الطريقة الخلايا البائية والتائية، وخلايا CHO، والخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية، والأورام الهجينة، والخلايا المعوية، والخلايا البلعمية، والخلايا الجذعية والسلفية المتوسطة، والخلايا الوحيدة، والورم النقوي المتعدد، والخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا الجذعية متعددة القدرات.

نظرة عامة على كيفية تخزين القوارير المبردة في النيتروجين السائل

الحفظ بالتبريد عمليةٌ تحفظ الخلايا والتركيبات البيولوجية الأخرى بتبريدها إلى درجات حرارة منخفضة جدًا. يمكن تخزين الخلايا في النيتروجين السائل لسنوات دون فقدان حيويتها. هذا ملخصٌ للإجراءات المُستخدمة.

تحضير الخلايا

تختلف الطريقة الدقيقة لتحضير العينات باختلاف نوع الخلية، ولكن عمومًا، تُجمع الخلايا وتُطرد مركزيًا لإنتاج حبيبات غنية بالخلايا. ثم تُعاد هذه الحبيبات إلى السائل العلوي المخلوط بمادة واقية من التجميد أو وسط حفظ بالتبريد.

وسط الحفظ بالتبريد

يُستخدم هذا الوسط لحفظ الخلايا في البيئات منخفضة الحرارة التي ستتعرض لها، وذلك بتثبيط تكوين البلورات داخل الخلايا وخارجها، وبالتالي موت الخلايا. ويتمثل دوره في توفير بيئة آمنة ووقائية للخلايا والأنسجة أثناء عمليات التجميد والتخزين والذوبان.

يتم خلط وسط مثل البلازما الطازجة المجمدة (FFP) أو محلول البلازماليت المضاف إليه الهيبارين أو المحاليل الخالية من المصل وخالية من المكونات الحيوانية مع المواد الواقية من التجمد مثل ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) أو الجلسرين.

يتم تقسيم حبيبات العينة المعاد تسييلها إلى قوارير تجميد البولي بروبيلين مثلشركة سوتشو إيس للطب الحيوي - قوارير تخزين مبردة.

من المهم عدم ملء القوارير المبردة أكثر من اللازم لأن هذا من شأنه أن يزيد من خطر التشقق والانطلاق المحتمل للمحتويات (1).

معدل التجميد المتحكم فيه

بشكل عام، يتم استخدام معدل تجميد بطيء ومتحكم به للحفاظ على الخلايا بالتبريد بنجاح.

بعد توزيع العينات في قوارير مُبرّدة، تُوضع على ثلج رطب أو في ثلاجة بدرجة حرارة 4 درجات مئوية، وتبدأ عملية التجميد خلال 5 دقائق. بشكل عام، تُبرّد الخلايا بمعدل يتراوح بين -1 و-3 خلايا في الدقيقة (2). ويتم ذلك باستخدام مبرد قابل للبرمجة أو بوضع القوارير في صندوق معزول داخل مُجمد ذي معدل تبريد مُتحكم به يتراوح بين -70 و-90 درجة مئوية.

النقل إلى النيتروجين السائل

يتم بعد ذلك نقل القوارير المبردة المجمدة إلى خزان النيتروجين السائل لفترات غير محددة بشرط الحفاظ على درجة حرارة أقل من -135 درجة مئوية.

يمكن الحصول على هذه درجات الحرارة المنخفضة للغاية عن طريق الغمر في النيتروجين في الحالة السائلة أو البخارية.

الطور السائل أو البخاري؟

من المعروف أن التخزين في النيتروجين في الطور السائل يحافظ على درجة الحرارة الباردة بثبات مطلق، ولكن لا يُنصح به غالبًا للأسباب التالية:

• الحاجة إلى كميات كبيرة (عميقة) من النيتروجين السائل تُشكل خطرًا محتملًا. الحروق أو الاختناق بسبب ذلك خطر حقيقي.
• حالات موثقة من التلوث المتبادل بالعوامل المعدية مثل الرشاشيات والتهاب الكبد الوبائي ب وانتشار الفيروس عبر وسط النيتروجين السائل (2،3)
• احتمال تسرب النيتروجين السائل إلى القوارير أثناء الغمر. عند إخراجها من المخزن وتسخينها إلى درجة حرارة الغرفة، يتمدد النيتروجين بسرعة. ونتيجةً لذلك، قد تتحطم القارورة عند إخراجها من المخزن، مما يُشكل خطرًا ناتجًا عن الحطام المتطاير والتعرض لمحتوياتها (1، 4).

لهذه الأسباب، عادةً ما يُخزَّن النيتروجين في الطور البخاري في درجات حرارة منخفضة للغاية. عند تخزين العينات في الطور السائل، يُفضَّل استخدام أنابيب كريوفليكس مُخصَّصة.

الجانب السلبي للطور البخاري هو إمكانية حدوث تدرج حراري عمودي، مما يؤدي إلى تقلبات في درجات الحرارة تتراوح بين -135 و-190 درجة مئوية. وهذا يتطلب مراقبة دقيقة وحثيثة لمستويات النيتروجين السائل وتغيرات درجات الحرارة (5).

يوصي العديد من المصنعين بأن تكون القوارير المبردة مناسبة للتخزين حتى درجة حرارة -135 درجة مئوية أو للاستخدام في مرحلة البخار فقط.

إذابة خلاياك المحفوظة بالتبريد

تُعدّ عملية إذابة التجميد مُرهقةً للمزارع المُجمدة، وتتطلب التعامل والتقنية المُناسبة لضمان أفضل قابلية للحياة والتعافي والأداء الوظيفي للخلايا. تعتمد بروتوكولات إذابة التجميد الدقيقة على أنواع الخلايا المُحددة. ومع ذلك، يُعتبر الإذابة السريعة أمرًا قياسيًا لما يلي:

• تقليل أي تأثير على التعافي الخلوي
• المساعدة في تقليل وقت التعرض للمواد المذابة الموجودة في وسائط التجميد
• تقليل أي ضرر عن طريق إعادة تبلور الجليد

تُستخدم عادةً حمامات المياه، أو حمامات الخرز، أو الأدوات الآلية المتخصصة لإذابة العينات.

في أغلب الأحيان، يتم إذابة خط خلية واحد في كل مرة لمدة 1-2 دقيقة، عن طريق تحريكه بلطف في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى يتبقى القليل من الثلج في القارورة قبل غسلها في وسط نمو دافئ مسبقًا.

بالنسبة لبعض الخلايا مثل أجنة الثدييات، فإن الاحترار البطيء ضروري لبقائها.

أصبحت الخلايا الآن جاهزة لزراعة الخلايا، أو عزل الخلايا، أو في حالة الخلايا الجذعية المكونة للدم - دراسات الجدوى لضمان سلامة الخلايا الجذعية المانحة قبل العلاج النخاعي.

من المعتاد أخذ عينات صغيرة من العينة المغسولة مسبقًا لعدّ الخلايا لتحديد تركيزاتها في المزرعة. بعد ذلك، يُمكن تقييم نتائج عزل الخلايا وتحديد مدى صلاحيتها للحياة.

أفضل الممارسات لتخزين القوارير المبردة

يعتمد نجاح حفظ العينات المخزنة في القوارير المبردة على العديد من العناصر في البروتوكول بما في ذلك التخزين السليم وحفظ السجلات.

• تقسيم الخلايا بين مواقع التخزين- إذا كانت الأحجام تسمح بذلك، قم بتقسيم الخلايا بين القوارير وتخزينها في أماكن منفصلة لتقليل خطر فقدان العينة بسبب فشل المعدات.
• منع التلوث المتبادل- اختر قوارير معقمة مبردة للاستخدام مرة واحدة أو جهاز تعقيم بالبخار قبل الاستخدام اللاحق
• استخدم قوارير ذات حجم مناسب لخلاياكتتوفر القوارير بأحجام تتراوح بين ١ و٥ مل. تجنب ملء القوارير أكثر من اللازم لتقليل خطر التشقق.
• اختر قوارير التبريد المبردة داخليًا أو خارجيًا– توصي بعض الجامعات باستخدام القوارير ذات الخيوط الداخلية كإجراءات أمان – كما يمكنها أيضًا منع التلوث أثناء التعبئة أو عند تخزينها في النيتروجين السائل.
• منع التسرب- استخدم أختامًا مزدوجة الحقن مصبوبة في غطاء المسمار أو حلقات O لمنع التسرب والتلوث.
• استخدم الباركودات ثنائية الأبعاد وقم بوضع ملصقات على القواريرلضمان إمكانية التتبع، تُمكّن القوارير ذات مساحات الكتابة الكبيرة من وضع علامات مناسبة على كل قارورة. تُساعد الباركودات ثنائية الأبعاد في إدارة التخزين وحفظ السجلات. كما تُسهّل الأغطية المُرمّزة بالألوان عملية التعرف.
• صيانة التخزين الكافيةلضمان عدم ضياع الخلايا، يجب مراقبة درجة حرارة أوعية التخزين ومستويات النيتروجين السائل باستمرار. كما يجب تركيب أجهزة إنذار لتنبيه المستخدمين في حال وجود أي أخطاء.

احتياطات السلامة

لقد أصبح النيتروجين السائل ممارسة شائعة في الأبحاث الحديثة ولكنه يحمل خطر الإصابة بجروح خطيرة إذا تم استخدامه بشكل غير صحيح.

يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة لتقليل خطر الإصابة بقضمة الصقيع والحروق وغيرها من الحوادث الضارة عند التعامل مع النيتروجين السائل. ارتدِ

• قفازات مبردة
• معطف المختبر
• واقي كامل للوجه مقاوم للصدمات ويغطي الرقبة أيضًا
• أحذية مغلقة من الأمام
• مئزر بلاستيكي مقاوم للرذاذ

يجب وضع ثلاجات النيتروجين السائل في أماكن جيدة التهوية لتقليل خطر الاختناق، إذ يتبخر النيتروجين المتسرب ويحل محل الأكسجين الجوي. وينبغي تزويد المخازن الكبيرة بأنظمة إنذار لانخفاض الأكسجين.

من المثالي العمل في أزواج عند التعامل مع النيتروجين السائل، ويجب منع استخدامه خارج ساعات العمل العادية.

قوارير التبريد لدعم سير عملك

تقدم شركة سوتشو إيس بيوميديكال مجموعة واسعة من المنتجات التي تلبي احتياجاتكم في مجال الحفظ بالتبريد لمختلف أنواع الخلايا. تشمل مجموعتنا مجموعة من الأنابيب، بالإضافة إلى مجموعة من القوارير المعقمة.

قواريرنا المبردة هي:

• غطاء لولبي للمختبر 0.5 مل 1.5 مل 2.0 مل قوارير تبريد ذات قاع مخروطي مع حشية

  ● مواصفات 0.5 مل، 1.5 مل، 2.0 مل، مع تنورة أو بدون تنورة
  ● تصميم مخروطي أو قائم بذاته، معقم أو غير معقم، كلاهما متاح
  ● أنابيب الغطاء اللولبي مصنوعة من مادة البولي بروبيلين الطبية
  ● يمكن تجميد وإذابة قوارير PP Cryotube بشكل متكرر
  ●يمكن أن يقلل تصميم الغطاء الخارجي من احتمالية التلوث أثناء معالجة العينة.
  ● أنابيب التبريد ذات الغطاء اللولبي، خيوط لولبية عالمية للاستخدام
  ● الأنابيب تناسب معظم الدوارات الشائعة
  ● أنابيب حلقية من نوع Cryogenic تناسب صناديق التجميد القياسية مقاس 1 بوصة و2 بوصة، و48 بئرًا، و81 بئرًا، و96 بئرًا، و100 بئر
  ● قابلة للتعقيم بالبخار حتى 121 درجة مئوية وقابلة للتجميد حتى -86 درجة مئوية

  رقم القطعة	مادة	مقدار	كابلون	قطع غيار السيارات/شنطة	الحقائب/الحافظات
  ACT05-BL-N	PP	0.5 مل	أسود، أصفر، أزرق، أحمر، بنفسجي، أبيض	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5 مل	أسود، أصفر، أزرق، أحمر، بنفسجي، أبيض	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5 مل	أسود، أصفر، أزرق، أحمر، بنفسجي، أبيض	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0 مل	أسود، أصفر، أزرق، أحمر، بنفسجي، أبيض	500	10